劉 紅， 魏曉羽， 馬 輝， 瞿 輝， 孫 葉

(1.江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇揚州225007；2.江蘇省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣總站,江蘇南京210019)

蘭屬(CymbidiumSw.)是蘭科(Orchidaceae)下的一個屬，蘭屬植物多為附生或地生草本，罕見腐生，多分布于中國、日本、馬來西亞、印度北部、菲律賓與婆羅洲，以及澳洲北部等亞熱帶、熱帶地區(qū)。全屬約有48個種，中國分布有29種，其中地生蘭種類如春蘭(Cymbidiumgeoringii)、蕙蘭(Cymbidiumfaberi)、建蘭(Cymbidiumensifolium)、墨蘭(Cymbidiumsinense)、寒蘭(Cymbidiumkanran)、春劍(Cymbidiumlongibracteatum)和蓮瓣蘭(Cymbidiumlianpan)等被稱為中國蘭花，簡稱國蘭，在中國有數(shù)千年栽培鑒賞的歷史。傳統(tǒng)國蘭優(yōu)良品種是從野生資源中篩選出的極少數(shù)符合中國蘭花“瓣型理論”標(biāo)準(zhǔn)的自然變異種[1]，是中國特有的珍稀蘭花種質(zhì)資源[2]，但是傳統(tǒng)國蘭優(yōu)良品種的花色以綠色為主色，色花瓣型品種十分稀有。隨著人們蘭花鑒賞觀的演變，色花類型越來越受到推崇。大花蕙蘭(Cymbidiumhybridum)是以蘭屬中一些大花型附生型品種為親本，經(jīng)過多代雜交選擇培育出來的花型大、色彩鮮艷、生長強健的優(yōu)良品種，目前已經(jīng)發(fā)展成為全球五大重要的蘭花商品盆花和切花之一，但是大花蕙蘭具有無香味、葉型散亂等缺點，并且在中國南方地區(qū)不易開花[3]。近年來，通過國蘭與大花蕙蘭種間雜交，選育兼具二者優(yōu)點的新品種，已經(jīng)成為國內(nèi)蘭花人工育種的熱點之一。

花色作為觀賞植物最重要的性狀，主要受到花色素組成及含量的影響[4]。植物花色素主要包括類黃酮、類胡蘿卜素、葉綠素和生物堿四大類。其中類胡蘿卜素可使花呈現(xiàn)黃色或橙色，葉綠素可使花呈現(xiàn)綠色，甜菜色素可使花呈現(xiàn)紅色或黃色。類黃酮是形成花色的重要色素，可分為花青素、花黃素2類?；ㄇ嗨赜址Q花色素，可使花呈現(xiàn)紅色或紫紅色，主要的花青素包括矢車菊素、天竺葵素、飛燕草素、芍藥色素、錦葵色素和矮牽牛素6大類，其中矢車菊素主要呈品紅色至紅色，芍藥色素主要呈紫紅色至紅色[5]?；ㄇ嗨氐募谆Ⅴ；疤腔寄芤鸹ㄉ淖兓ㄇ嗨氐募谆?、糖基化可使紅色加深[6]?；S素主要由黃酮醇、黃酮、黃烷酮、查爾酮等組成，除查爾酮為深黃色外，其他為淡黃色或無色[7]，花黃素可能通過與花青素共色素化而參與花的呈色過程[8]。

近年來，國內(nèi)外對蘭科植物花色素的研究逐漸加深，尤其是對類黃酮代謝物組成與結(jié)構(gòu)的鑒定取得了一定進展，在蝴蝶石斛蘭、卡特蘭、文心蘭、大花蕙蘭、金釵石斛蘭、獨蒜蘭等蘭科植物上已經(jīng)開展了相關(guān)研究[9-14]，而關(guān)于春蘭、墨蘭和蓮瓣蘭等蘭屬植物花色素組成的研究尚未見報道。本研究擬通過液-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對24種不同色系的中國蘭、大花蕙蘭及相關(guān)雜交種等蘭屬植物花色素成分進行分析，以期為蘭屬植物花色形成機理研究奠定基礎(chǔ)，為蘭花新品種選育提供重要的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及采集

參試的24份材料(表1、圖1)取自江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所花卉課題組蘭花種質(zhì)資源圃，包括8份春蘭材料(A～H)、4個墨蘭品種(I～L)、4個蓮瓣蘭品種(M～P)、4個大花蕙蘭品種(Q～T)及4個春蘭與大花蕙蘭雜交種(U～X)。

表1 24份蘭屬參試材料

除春蘭大富貴分別選取花蕾期苞片和盛開期舌瓣、外瓣，玉兔選取盛花期捧瓣外，其他材料均選取盛開期花朵外瓣進行色素成分測定，根據(jù)《植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測試指南 春蘭》(NY/T 2437-2013)描述花朵待測部位顏色。取樣時選取生長勢一致、花色一致的3個單株為3次生物學(xué)重復(fù)。將每個單株的花朵全部取下，按照不同部位取樣，加液氮研磨成粉末后存于-80 ℃冰箱中備用。

1.2 試劑與儀器設(shè)備

色譜級甲酸，購自上海安譜實驗科技股份有限公司；色譜級甲醇，購自上海泰坦科技股份有限公司；色譜級乙腈，購自上海滬試實驗室器材股份有限公司；葉綠素檢測試劑盒(比色法)，購自上海禾午生物科技有限公司；矢車菊素-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品，購自上海西格瑪奧德里奇有限公司，純度達95%以上；蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品，購自北京盛世康普化工技術(shù)研究院，純度達96%以上；類胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品，購自上海西格瑪奧德里奇有限公司，純度達95%以上。

CS-580A分光測色儀，購自杭州彩譜科技有限公司；Sartorius分析天平(型號：BSA124S)，購自賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；TGL-16M冷凍離心機，購自上海盧湘儀離心機儀器有限公司；UV-6000紫外-可見分光光度計，購自上海元析儀器有限公司；Agilent 1200-6460 QQQ，購自美國安捷倫科技有限公司；LCQ Deca XP MAX液質(zhì)聯(lián)用色譜儀，購自美國賽默飛科技有限公司。

材料A～X見表1。圖1 24份參試蘭屬材料Fig.1 24 cultivars of Cymbidium Sw.

1.3 蘭花花瓣花色表型的鑒定

對供試材料(除大富貴)盛花期花瓣、大富貴花蕾期苞片的顏色進行描述，以進行花瓣花色表型的鑒定。參照朱佳意等[15]的方法，利用RHCSS(英國皇家園藝學(xué)會比色卡)和CIEL*a*b*顏色系統(tǒng)對花色進行定性、數(shù)字化描述。L*表示明暗變化程度從0(黑色)到100(白色)；a*、b*為正值時，代表紅色、黃色，a*、b*為負(fù)值時，代表綠色、藍色；C表示色彩的飽和度，色相角(h)表示色調(diào)。

1.4 類黃酮的檢測

花瓣中類黃酮的提取參照李崇暉等[16]的方法進行，具體步驟：稱取0.1 g冷凍花瓣粉末置于 2 ml 離心管內(nèi)，加1.5 ml含有0.1%甲酸的甲醇溶液振蕩，在4 ℃冰箱內(nèi)浸提 24 h，每隔6 h振蕩1次，提取結(jié)束后于1 000 r/min離心10 min，取上清并過0.22 μm 濾膜，得到待測液，每個提取試驗進行3次重復(fù)。

類黃酮的定性分析利用LCQ Deca XP MAX液質(zhì)聯(lián)用色譜儀(HPLC-ESI-MSn)進行，色譜柱為TSK gel ODS-80Ts QA(250.0 mm×4.6 mm，Tosoh，日本)。質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子化(ESI)方法，三重四極桿離子阱分析器，全離子掃描范圍為50～2 000m/z；花青素苷、黃酮醇苷分析采用正、負(fù)離子(NI)檢測模式。毛細管電壓為4 000 V，噴霧器壓力為 35 Pa，干燥氣體(N2)溫度為 300 ℃，流速為 10 L/min。

類黃酮的定量分析利用Agilent 1200-6460 QQQ的高效液相色譜-二極管陣列檢測法(HPLC-DAD)進行，包括柱溫箱(TCC-1260)及光電二極管陣列檢測器(DDA-1260)。液相色譜條件：流動相為0.1%甲酸水溶液(A)、乙腈(B)。洗脫程序見表2。色譜柱為Agilent Edipse plus C18(150.0 mm×4.6 mm，5 μm，美國)，柱溫為35 ℃，進樣量為10 μl，流速為0.8 ml/min，檢測波長為515 nm(花青素苷)、350 nm(黃酮醇苷)，在波長為200～800 nm時對每個吸收峰進行全波長掃描。

花瓣中各類黃酮組分的定量分析采用外標(biāo)法，將矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品分別溶于含有0.1%甲酸的甲醇中，最終生成質(zhì)量濃度0.05～100.00 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品工作溶液，分別以在515 nm和350 nm處測定的吸光度為橫坐標(biāo)(x)、以質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)(Y)，得到矢車菊素-3-O-葡萄糖苷相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=0.103 3x+3.061 0，R2=0.999 3，蕓香苷相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=0.402 8x+0.099 4，R2=0.999 5。計算樣品中各花青素苷含量(相對于矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的含量)、花黃素含量(相對于蕓香苷的含量)，鮮樣的含量單位為μg/g，重復(fù)3 次。

表2 流動相的洗脫程序

1.5 類胡蘿卜素及葉綠素含量的測定

參照黃昕蕾[17]的方法進行類胡蘿卜素的提取，采用紫外-可見分光光度計測定類胡蘿卜素含量，測定波長為450 nm，重復(fù)3次。參照葉綠素試劑盒方法進行總?cè)~綠素含量的測定，重復(fù)3次。

1.6 數(shù)據(jù)分析

用MassHunter Workstation Software (Version B. 06.00)和Chemdraw Ultra軟件對花色成分進行分析，用Excel 2016進行數(shù)據(jù)整理，用IBM SPSS Statistics 22軟件、Duncan’s法進行花色素含量的差異顯著性分析，用Origin 2021軟件繪制花色的二維、三維散點圖，進行主成分分析，用GraphPad Prism 6繪制柱形圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 花色表型分析

蘭屬植物花色豐富，為了解蘭屬植物不同色系的著色差異，分別用RHCSS、CIEL*a*b*顏色系統(tǒng)對蘭屬植物的花色進行定性與數(shù)字化描述，詳見表3。根據(jù)RHCSS評價指標(biāo)，參試蘭花可劃分為6種色系，分別為棕色系、紫色系、紅紫色系、灰橙色系、黃色系和黃綠色系。

用CIEL*a*b*評價體系量化蘭花花色的各項指標(biāo)，分別以b*、L*為縱坐標(biāo)，繪制不同色系蘭花品種花瓣、花色的二維、三維分布結(jié)果，可以看出，灰橙色、黃色和黃綠色主要集中在二維、三維圖的上部，棕色、紫色和紅紫色主要集中在二維、三維圖的下部(圖2)。

表3 24份蘭屬樣品的花色表型參數(shù)

A：a*、b*的二維分布圖；B：a*、b*和L*的三維分布圖。圖2 24份蘭屬材料花色指標(biāo)的二維、三維分布結(jié)果(色系由RHSCC值確定)Fig.2 Flower color distribution of 24 Cymbidium Sw. cultivars in coordinate systems of bivariate and trivariate, respectively (The flower colors were identified by the RHSCC value)

如圖3所示，黃色系蘭屬植物的平均L*最高，達59.35，顯著高于其他色系蘭花(P<0.05)；其次為黃綠色系蘭花，平均L*為55.30；L*最低的為棕色系蘭花，僅為25.60，與其他色系蘭花間差異顯著(P<0.05)；紫色系和紅紫色系蘭花的L*差別不大，且存在重復(fù)區(qū)域。紅紫色系蘭花的平均a*為13.96，顯著高于其他色系蘭花(P<0.05)；其次為紫色系蘭花，而黃綠色系、灰橙色系蘭花的平均a*分別為-1.87、-2.40，表明它們呈現(xiàn)一定程度的綠色。黃色系蘭花的b*最高，達44.62，b*最低的為棕色系蘭花，僅為1.26，各色系蘭花的b*均為正值，代表不同程度的黃色。C與b*呈現(xiàn)同樣的規(guī)律，色相角(h)也表現(xiàn)為黃綠色系、黃色系及灰橙色系蘭花高于棕色系、紫色系和紅紫色系蘭花。上述結(jié)果表明：紫色、紅紫色、棕色和黃色蘭花在CIEL*a*b*空間中處于由紅色向黃色過渡的區(qū)域，而黃綠色系和灰橙色系花處于由綠色向黃色過渡的區(qū)域。

A：L*值；B：a*值；C：b*值；D：C值；E：h值。圖3 不同色系蘭屬植物花色表型的CIE L*a*b*值Fig.3 CIE L*a*b* values in flowers of Cymbidium Sw.

2.2 類黃酮組成成分分析

類黃酮的鑒定基于保留時間、紫外可見吸收光譜(λmax)、特征質(zhì)荷比、分子離子峰和前人研究中報道的信息，詳見表4。在520 nm波長下共檢測到6 種花青素苷，圖4A為花青素苷種類最豐富的品種大富貴苞片在520 nm下的色譜結(jié)果。在350 nm下共檢測到47種黃酮醇苷、7種黃酮苷、6種黃烷酮苷及4種未確定的成分，圖4B顯示了具有代表性的黑墨外瓣的類黃酮色譜結(jié)果。

2.2.1 花青素苷 本研究共檢測到2種花青素苷元，其中峰a1、a2、a3和a5均產(chǎn)生質(zhì)荷比(m/z)為287的碎片離子，為矢車菊素苷元(Cyanidin,Cy)的特征碎片離子(表4)。通常情況下，單糖優(yōu)先連接在花青素苷元的第3位羥基上，2個或2個以上的糖可同時連接在第3位羥基或分別連接在第3位、第5位羥基上[18]。峰a1處分子離子([M+H]+)的m/z為449，由矢車菊素苷元離子結(jié)合1 分子葡萄糖基(相對分子質(zhì)量為162)得到，與矢車菊素3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品一致，因此將峰a1鑒定為矢車菊素3-O-葡萄糖苷(Cyanidin 3-O- glucoside)[8,19]。峰a2 Cy苷元(m/z為287)上連接了2個糖基(相對分子質(zhì)量分別為162、146)，MS2質(zhì)譜中只能觀察到m/z為449的碎片離子([M+H-146]+)，而沒有觀察到m/z為433的碎片離子([M+H-162]+)，表明Cy是被1種雙糖糖苷化的[20]，308為蕓香糖苷的特征質(zhì)荷比，因此將峰a2鑒定為矢車菊素3-O-蕓香糖苷(Cyanidin 3-O-rutinoside)[10,12]。峰a3分子離子的m/z約為757，根據(jù)文獻[13]將峰a3鑒定為矢車菊素-3-O-蕓香糖苷-5-O-葡萄糖苷(Cyanidin 3-O-rutinoside-5-O-glucoside)。峰a5[M+H]+對應(yīng)的m/z為535，較峰a1增加86(為丙二?；?，因而將其鑒定為矢車菊素3-O-丙二酰葡萄糖苷(Cyanidin 3-O-malonylglucoside)[12,15]。峰a4、a6處均產(chǎn)生碎片離子，m/z為301，為芍藥花素苷元(Peonidin,Pn)的特征碎片離子，根據(jù)前人的報道，分別將峰a4、a6鑒定為芍藥花素3-O-蕓香糖苷(Peonidin 3-O-rutinoside)、芍藥花素3-O-丙二酰葡萄糖苷(Peonidin 3-O- malonylglucoside)[12]。

表4 24份蘭屬樣品花中類黃酮的HPLC-MS分析及結(jié)構(gòu)解析

2.2.2 黃酮醇 質(zhì)譜分析結(jié)果顯示，共有 6 種黃酮醇苷元離子，在正離子模式下分別是m/z為287的山柰酚(Kaempferol,Km)、m/z為303的槲皮素(Quercetin,Qu)、m/z為317的異鼠李素(Isorhamnetin,Is)、m/z為319的楊梅黃素(Myricetin,My)、m/z為347的丁香亭(Syringetin,Sy)、m/z為349的二氫丁香亭(Dihydrosyringetin，DHS)。

分子離子峰f1、f8、f9、f46和f58均連續(xù)丟失86、162的相對分子質(zhì)量，產(chǎn)生m/z為347、319、319、303和317的碎片苷元離子。86是丙二酰的特征質(zhì)荷比，162的相對分子質(zhì)量大小對應(yīng)1分子六碳糖，根據(jù)Abad-García等[21]的報道，葡萄糖是最常見的單糖，其次為半乳糖、鼠李糖、木糖、阿拉伯糖和葡萄糖醛酸，而甘露糖、果糖和半乳糖醛酸最少見。因此推測峰f1為丁香亭3-O-丙二酰葡萄糖苷(Syringetin 3-O-malonylglucoside)；峰f8和f9的質(zhì)譜信息相同，互為同分異構(gòu)體，由于當(dāng)相同苷元連接不同的糖基時，半乳糖苷先于葡萄糖苷洗脫[22-23]，因此推測峰f8、f9分別為楊梅素3-O-丙二酰半乳糖苷(Myricetin 3-O-malonylgalactoside)、楊梅素3-O-丙二酰葡萄糖苷(Myricetin 3-O-malonylglucoside)。結(jié)合質(zhì)譜信息及文獻報道，推測峰f46、f58分別為槲皮素3-O-丙二酰葡萄糖苷(Quercetin 3-O-malonylglucoside)、異鼠李素3-O-丙二酰葡萄糖苷(Isorhamnetin 3-O-malonylglucoside)[16]。

峰f2 [M+H]+在m/z為579處丟失232的相對分子質(zhì)量，產(chǎn)生m/z為347的碎片苷元離子,232為琥珀酰阿拉伯糖苷的特征質(zhì)荷比(琥珀酰的特征質(zhì)荷比為100，阿拉伯糖苷的特征質(zhì)荷比為132)，因此推測峰f2為丁香亭3-O-琥珀酰阿拉伯糖苷(Syringetin 3-O-succinylarabinoside)。峰f21、f60、f63與f2 的質(zhì)譜行為相似，且質(zhì)譜信息相同，峰f21、f60、f63互為同分異構(gòu)體，皆丟失262的相對分子質(zhì)量，即丟失1分子琥珀酰(相對分子質(zhì)量為100)和1分子六糖苷(相對分子質(zhì)量為162)，產(chǎn)生m/z為319的碎片苷元離子。根據(jù)上述分析結(jié)果，推測峰f21、f60、f63分別為楊梅素3-O-琥珀酰半乳糖苷(Myricetin 3-O-succinylgalactoside)、楊梅素3-O-琥珀酰葡萄糖苷(Myricetin 3-O-succinylglucoside)、楊梅素3-O-琥珀酰己糖苷(Myricetin 3-O-succinylhexose)。

峰f4分子離子([M+H]+)的m/z為511，丟失162 的相對分子質(zhì)量，產(chǎn)生m/z為349的碎片苷元離子，347為Sy的特征質(zhì)荷比，根據(jù)前人報道，349為二氫丁香亭的m/z[24]，因此將峰f4暫定為二氫丁香亭3-O-葡萄糖苷(Dihydrosyringetin 3-O-glucoside)。峰f14、f15互為同分異構(gòu)體，峰f49、f51和f53互為同分異構(gòu)體，其質(zhì)譜行為與峰f4相似，均丟失了1分子六碳糖(相對分子質(zhì)量為162)，結(jié)合相關(guān)參考文獻，推測峰f14、f15分別為山柰酚3-O-半乳糖苷(Kaempferol 3-O-galactoside)[25]、山柰酚3-O-葡萄糖苷(Kaempferol 3-O-glucoside)[10,15-16],峰f49、f51和f53分別為楊梅素3-O-半乳糖苷(Myricetin 3-O-galactoside)[26]、楊梅素3-O-葡萄糖苷(Myricetin 3-O-glucoside)[25]和楊梅素3-O-己糖苷(Myricetin 3-O-hexose)。

峰f5、f13和f61分別是m/z為349、287、319的苷元離子結(jié)合相對分子質(zhì)量為294的雙糖(294是桑布雙糖特征質(zhì)荷比[27])，推測峰f5、f13和f61分別為二氫丁香亭3-O-桑布雙糖(Dihydrosyringetin 3-O-sambubioside)、山柰酚3-O-桑布雙糖(Kaempferol 3-O-sambubioside)和楊梅素3-O-桑布雙糖(Myricetin 3-O-sambubioside)。峰f11、f12中只檢測到質(zhì)荷比為349的碎片苷元離子，因此推測其為二氫丁香亭衍生物(Dihydrosyringetin derivative)。

峰f41的液相色譜保留時間及質(zhì)譜特征與標(biāo)準(zhǔn)品蕓香苷相同， 則推測峰f41為蕓香苷(Rutin)[10,12,19]。由峰f37、f40的質(zhì)譜信息看出，它們與已知組分峰f41為同分異構(gòu)體。峰f40苷元的Qu上連接了2個糖基，分別為1分子鼠李糖(相對分子質(zhì)量為146)和1分子己糖(相對分子質(zhì)量為162)，在MS2質(zhì)譜信息中，只能觀察到m/z為465的碎片離子([M+H-146]+)，而沒有觀察到m/z為449的碎片離子([M+H-162]+)，表明Qu被1種雙糖糖苷化。由于m/z為465的碎片([M+H-146]+)的豐度小于m/z為303的碎片([Y0+，M + H - (146+162)])，因此判斷該雙糖是通過1→2糖苷鍵連接的[20]，進而推測其為槲皮素-3-鼠李糖-(1→2)-葡萄糖[Quercetin 3-O-rhamnopyranosyl-(1→2)-glucopyranoside]，即槲皮素3-O-新橙皮糖苷(Quercetin 3-O-neohesperidoside)]。刺槐雙糖(Robinoside)[Rhamnopyranosyl-(1→6)-galactopyranoside]與蕓香糖苷[Rhamnopyranosyl-(1→6)-glucopyranoside]亦為同分異構(gòu)體，且當(dāng)它們連接相同苷元時，刺槐雙糖的出峰時間較蕓香糖早，根據(jù)已知組分峰f43與峰f45[12,25]、f50與f52[10,12,16]，可以推測峰f37為槲皮素3-O-刺槐雙糖(Quercetin 3-O-robinoside)。峰f16的質(zhì)譜信息與上述成分相似，但無同分異構(gòu)體，推測其為楊梅素3-O-蕓香糖苷(Myricetin 3-O-rutinoside)。

峰f17分子離子([M+H]+)的m/z約為595，丟失了1分子葡萄糖醛酸(相對分子質(zhì)量為176)和1分子琥珀酰(相對分子質(zhì)量為100)，產(chǎn)生m/z為319的碎片苷元離子，推測其為楊梅素3-O-琥珀酰葡萄糖醛酸苷(Myricetin 3-O-succinylglucuronide)。

峰f18、f30、f31、f32、f34和f39的質(zhì)譜行為相似，均為分子離子連續(xù)丟失2分子糖苷后產(chǎn)生苷元離子。不同化合物中的糖苷化位置不同，如花青素通常發(fā)生在3碳位、5碳位，黃酮醇、黃烷-3-醇通常發(fā)生在3碳位、7碳位，黃酮、黃烷酮通常發(fā)生在7碳位[28]。峰f18連續(xù)丟失2分子鼠李糖苷(相對分子質(zhì)量為146)后產(chǎn)生m/z為319的碎片苷元離子，推測其為楊梅素3-O-鼠李糖-7-O-鼠李糖苷(Myricetin 3-O-rhamnoside-7-O-rhamnoside)。根據(jù)已有研究結(jié)果，推測峰f31、f32與峰f34分別為山柰酚3-O-葡萄糖-7-O-葡萄糖苷(Kaempferol 3-O-glucoside-7-O-glucoside)、槲皮素3-O-半乳糖-7-O-葡萄糖苷(Quercetin 3-O- galactoside-7-O-glucoside)和槲皮素3-O-葡萄糖-7-O-葡萄糖苷(Quercetin 3-O-glucoside-7-O-glucoside)[9,29]。峰f30與峰f39的質(zhì)譜行為一致，互為同分異構(gòu)體，且與峰f32、f34相似，推測峰f30與峰f39分別為楊梅素3-O-半乳糖-7-O-葡萄糖苷(Myricetin 3-O-galactoside-7-O-glucoside)和楊梅素3-O-葡萄糖-7-O-葡萄糖苷(Myricetin 3-O-glucoside-7-O-glucoside)。

峰f19和峰f22的質(zhì)譜行為類似，都為分子離子連續(xù)丟失糖苷或?；擒蘸螽a(chǎn)生的苷元離子。峰f22與山柰酚3-O-蕓香糖-7-O-葡萄糖苷(Kaempferol 3-O-rutinoside-7-O-glucoside)的質(zhì)譜信息一致[9]。同理，推測峰f19為槲皮素3-O-葡萄糖-7-O-丙二酰葡萄糖苷(Quercetin 3-O-glucoside-7-O- malonyl-glucoside)。

峰f26與峰f27的質(zhì)譜信息相同，根據(jù)已有研究結(jié)果，峰f26與楊梅素3-O-沒食子酰半乳糖苷(Myricetin 3-O-galloylgalactoside)的結(jié)構(gòu)一致[18]，因此推測峰f27為楊梅素3-O-沒食子酰葡萄糖苷(Myricetin 3-O-galloylglucoside)。同理，f35與已報道的槲皮素3-O-沒食子酰葡萄糖苷(Quercetin 3-O-galloylglucoside)結(jié)構(gòu)一致[27]。

從峰f20、f25、f29、f44、f55、f56、f57中均檢測到質(zhì)荷比為319的碎片苷元離子，但是根據(jù)分子離子信息，無法推測具體化合物，均暫認(rèn)為它們是楊梅素衍生物(Myricetin derivative)。

2.2.3 黃酮 根據(jù)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，在波長為350 nm的條件下共檢測到7種黃酮苷，包括2種黃酮苷元離子，在正離子模式下分別為m/z為271的芹菜素(Apigenin，Ap)[30]、m/z約為301的金圣草黃素(Chrysoeriol，Ch)[31]。峰f3分子離子[M+H]+的m/z為609，丟失1分子蕓香糖苷(相對分子質(zhì)量為308)后，產(chǎn)生m/z為301的碎片苷元離子。通常情況下，黃酮、黃烷酮類糖元優(yōu)先連接在苷元的7位羥基上，因此推測峰f3為金圣草黃素7-O-蕓香糖苷(Chrysoeriol 7-O-rutinoside)[32]。峰f10分子離子丟失1分子阿魏酰葡萄糖苷(相對分子質(zhì)量為338)，推定為金圣草黃素7-O-阿魏酰葡萄糖苷(Chrysoeriol 7-O-feruloylglucoside)。峰f38中檢測到Ch苷元，但根據(jù)分子離子的m/z無法推測其結(jié)構(gòu)組成，因而暫將其推測為金圣草黃素衍生物(Chrysoeriol derivative)。峰f47分子離子丟失1分子葡萄糖苷(相對分子質(zhì)量為162)和1分子木糖苷(相對分子質(zhì)量為132)，推測其為金圣草黃素7-O-桑布雙糖(Chrysoeriol 7-O-sambubioside)。峰f48分子離子丟失了2分子葡萄糖苷，經(jīng)MassBank查詢，與金圣草黃素7-O-槐糖苷(Chrysoeriol 7-O-sophoroside)一致(登記號：PN000073)。峰f24、f42均為芹菜素類衍生物，峰f24的質(zhì)譜信息與MassBank中芹菜素7-O-丙二酰葡萄糖苷(Apigenin 7-O-malonylglucoside)相符(登記號：PN000048)。峰f42的質(zhì)譜行為與峰f48相似，均為分子離子丟失2分子葡萄糖苷，因此推測峰f42為芹菜素7-O-槐糖苷(Apigenin 7-O-sophoroside)。

2.2.4 黃烷酮 從峰f6、f7、f23、f28、f36、f59中均檢測到m/z為273的碎片柚皮素(Na)苷元[30]，經(jīng)MassBank查詢，峰f6為柚皮素7-O-葡萄糖苷(Naringenin 7-O-glucoside)(登記號：PR306370)，峰f7為柚皮素7-O-蕓香糖苷(Naringenin 7-O-rutinoside)(登記號： PR302552)。峰f23分子離子丟失了1分子阿魏酰(相對分子質(zhì)量為176)和1分子鼠李糖苷(相對分子質(zhì)量為146)，推定其為柚皮素7-O-阿魏酰鼠李糖苷(Naringenin 7-O-ferulylrhamnoside)。峰f28分子離子丟失了1分子鼠李糖苷(相對分子質(zhì)量為146)，推測其為柚皮素7-O-鼠李糖苷(Naringenin 7-O-rhamnoside)。峰f36分子離子丟失了1分子阿魏酰(相對分子質(zhì)量為176)、1分子葡萄糖苷(相對分子質(zhì)量為162)，推測其為柚皮素7-O-阿魏酰葡萄糖苷(Naringenin 7-O-feruloylglucoside)。峰f59的質(zhì)譜行為與峰f48相似，因而推測其為柚皮素7-O-槐糖苷(Naringenin 7-O-sophoroside)。

2.3 花色素組成與定量分析

由于蘭花外瓣、捧瓣和舌瓣有不同的著色模式，通常外瓣、捧瓣以同樣的方式著色，但是對于蝶花，其花瓣著色模式發(fā)生了變化，與舌瓣類似，是經(jīng)過修飾的，在顏色、形狀上都不同。本研究選取不同色系蘭花的不同組織部位進行類黃酮、類胡蘿卜素和葉綠素含量的測定，可以較全面地分析蘭花色素分布特點。研究發(fā)現(xiàn)，24份蘭屬植物花組織中均含有類黃酮、類胡蘿卜素和葉綠素(表5)。

2.3.1 類黃酮代謝物成分及含量 在24個樣品中共檢測到70種類黃酮代謝物，包括6種花青素苷類物質(zhì)、47種黃酮醇苷類物質(zhì)、7種黃酮苷類物質(zhì)、6種黃烷酮苷類物質(zhì)和4種未確定的代謝物。棕色系花瓣中共包含42種類黃酮代謝物，紫色系花瓣中共包含31種類黃酮代謝物，紅紫色系花瓣中共包含61種類黃酮代謝物，黃色系花瓣中共包含34種類黃酮代謝物，黃綠色系花瓣中共包含56種類黃酮代謝物，灰橙色系花瓣中共包含23種類黃酮代謝物。對每種類黃酮代謝物的相對含量進行橫向歸一化處理，由圖5可以看出，棕色系、紫色系、紅紫色系和灰橙色系花的類黃酮代謝物與黃色系、黃綠色系花的類黃酮代謝物具有明顯差異。

2.3.1.1 花青素苷 在參試的蘭屬植物花朵中，有16份中檢測出花青素苷，包含4種矢車菊素、2種芍藥色素(圖6)，其中只有大富貴苞片中檢出6種花青素苷，其余材料中檢測出1～5種花青素苷。蘭屬植物不同色系花朵所含花青素類別與含量差異較大， 總花青素苷(TAC)含量整體表現(xiàn)為棕色系>紫色系>紅紫色系>灰橙色系>黃綠色系>黃色系，分別為1 656.92 μg/g、430.62 μg/g、277.61 μg/g、142.88 μg/g、85.20 μg/g和0 μg/g(圖7)。從棕色系花中檢出4種花青素苷，包括矢車菊素 3-O-葡萄糖苷、矢車菊素 3-O-蕓香糖苷、矢車菊素 3-O-蕓香糖苷-5-O-葡萄糖苷和芍藥花素3-O-蕓香糖苷，其中矢車菊素 3-O-葡萄糖苷、芍藥花素3-O-蕓香糖苷的相對含量明顯高于其他色系；紫色系花中均含有花青素苷，共檢出6.0種花青素苷，平均每個材料檢出5.5種花青素苷，且均含有矢車菊素、芍藥花素；紅紫色系花中均含有花青素苷，共檢出6.0種花青素苷，每個材料中的花青素苷數(shù)量平均為3.4種，其中有7份樣品中只含有矢車菊素，3 份樣品中同時檢出矢車菊素、芍藥花素；灰橙色系花中有3種花青素苷，均為矢車菊素；在黃綠色系花中，只有2個材料中檢出花青素苷，其中從大富貴外瓣中檢出1種花青素，從瑞梅外瓣中檢出2種花青素苷，均為矢車菊素，在檢出花青素苷的樣品中，TAC含量處于最低水平；黃色系花的外瓣不含有花青素。此外，春蘭大富貴花朵不同部位含有的花青素苷種類和TAC含量不同，其苞片含有4種Cy、2種Pn，舌瓣含有3種Cy，外瓣只含有1種Cy；不同部位的TAC含量表現(xiàn)為苞片>舌瓣>外瓣，分別為520.74 μg/g、275.52 μg/g和52.87μg/g，差異顯著(P<0.05)。

在所有檢出花青素苷的樣品中，矢車菊素含量均高于芍藥花素含量，為主要的花青素類型，并且除F-19中的花青素苷含量以矢車菊素 3-O-葡萄糖苷為主外，有8個材料中的花青素苷含量以矢車菊素 3-O-蕓香糖苷為主，10個材料中的花青素苷含量以矢車菊素 3-O-丙二酰葡萄糖苷為主。

樣品A～X見表1。B：棕色系；P：紫色系；RP：紅紫色系；Y：黃色系；YB：黃綠色系；GO：灰橙色系。代謝物相對含量采用歸一化處理，圖中的顏色取決于蘭屬花朵的濃度，藍色代表濃度較低，紅色代表濃度較高;##1、##2、##3、##4、##5表示未命名。圖5 24份蘭屬樣品花中類黃酮物質(zhì)相對含量熱圖Fig.5 A heat map of relative content of flavonoids in the flowers of 24 Cymbidium Sw. samples

樣品A～X見表1。圖6 24份蘭屬樣品花中的花青素苷組成及含量Fig.6 The composition and content of anthocyanin in flowers of 24 Cymbidium Sw. samples

2.3.1.2 花黃素 除花青素苷外，在參試材料中共檢出64種花黃素，包括黃酮醇、黃酮和黃烷酮等。黃酮醇苷元有6種，分別為Km、Qu、Is、My、Sy和DHS，其中Km、Qu和My型苷元存在于所有樣品中，而少數(shù)樣品中未檢出Is、Sy或DHS苷元；黃酮苷元有2種，分別為Ap和Ch，其中Ch在所有樣品中都存在，而Ap僅存在于9個樣品中；黃烷酮苷元為Na，在4份樣品(O、S、U和W)中未檢出(表6)。由圖5可以看出，從不同色系的材料中檢出11～36個組分，峰f40、f41、f45、f46、f47為普遍存在的花黃素，其中峰f40僅C、K和L中未檢出，峰f41僅M、N中未檢出，峰f45僅C、T中未檢出，峰f46僅N、T中未檢出，而峰f47僅N、Q、S和U中未檢出；峰f13、f25、f27、f44、f49、f62、f63、f64分別為樣品N、V、G、R、J、I、T和Q所特有的，峰f37、f60為樣品B所特有的； 峰f7、f18僅存在于墨蘭(I、J和L)中，具有一定的種屬特異性。

由表4可以看出，在所有檢出的64種花黃素成分中，只有峰f15、f22、f31、f32、f34、f41、f43、f45、f46、f50、f52等11種曾在蘭科植物中報道過，峰f3、f6、f7、f13、f14、f24、f26、f35、f48、f51等10種在其他物種研究或數(shù)據(jù)庫中報道過，其余除峰f11、f12、f20、f25、f29、f33、f38、f44、f54、f55、f56、f57、f62、f64等14種沒有得到準(zhǔn)確鑒定外，有28種黃花素為首次報道，分別為丁香亭3-O-丙二酰葡萄糖苷(峰f1)、丁香亭3-O-琥珀酰阿拉伯糖苷(峰f2)、二氫丁香亭3-O-葡萄糖苷(峰f4)、二氫丁香亭3-O-桑布雙糖(峰f5)、楊梅素3-O-丙二酰半乳糖苷(峰f8)、楊梅素3-O-丙二酰葡萄糖苷(峰f9)、金圣草黃素7-O-阿魏酰葡萄糖苷(峰f10)、楊梅素3-O-蕓香糖苷(峰f16)、楊梅素3-O-琥珀酰葡萄糖醛酸苷(峰f17)、楊梅素3-O-鼠李糖-7-O-鼠李糖苷(峰f18)、槲皮素3-O-葡萄糖-7-O-丙二酰葡萄糖苷(峰f19)、楊梅素3-O-琥珀酰半乳糖苷(峰f21)、柚皮素7-O-阿魏酰鼠李糖苷(峰f23)、楊梅素3-O-沒食子酰葡萄糖苷(峰f27)、柚皮素7-O-鼠李糖苷(峰f28)、楊梅素3-O-半乳糖-7-O-葡萄糖苷(峰f30)、柚皮素7-O-阿魏酰葡萄糖苷(峰f36)、槲皮素3-O-刺槐雙糖(峰f37)、楊梅素3-O-葡萄糖-7-O-葡萄糖苷(峰f39)、槲皮素3-O-新橙皮糖苷(峰f40)、芹菜素7-O-槐糖苷(峰f42)、金圣草黃素7-O-桑布雙糖(峰f47)、楊梅素3-O-半乳糖苷(峰f49)、楊梅素3-O-己糖苷(峰f53)、柚皮素7-O-槐糖苷(峰f59)、楊梅素3-O-琥珀酰葡萄糖苷(峰f60)、楊梅素3-O-桑布雙糖(峰f61)和楊梅素3-O-琥珀酰己糖苷(峰f63)。同時，本研究檢出的楊梅素、丁香亭和柚皮素類衍生物為首次在蘭科植物中發(fā)現(xiàn)。

由圖7可以看出，不同色系蘭屬植物花中的類黃酮含量存在一定差異，總類黃酮(TFC)、總黃酮醇、總黃酮和總黃烷酮含量最高的均為棕色系，分別為12 817.74 μg/g、10 504.35 μg/g、1 296.60 μg/g和1 016.80 μg/g，遠高于其他色系，且差異顯著(P<0.05)，而其他色系之間的總類黃酮含量無顯著差異；紫色系的TFC、總黃酮醇和總黃酮含量均最低，灰橙色系的總黃烷酮含量最低。棕色系花瓣中的黃酮醇類物質(zhì)主要以山柰酚、槲皮素、丁香亭和二氫丁香亭為苷元，黃酮類物質(zhì)以芹菜素、金圣草黃素為苷元，其中金圣草黃素7-O-桑布雙糖含量顯著高于其他色系；黃烷酮以柚皮素為苷元，其中柚皮素7-O-葡萄糖苷、柚皮素7-O-蕓香糖苷含量明顯高于其他色系。黑墨、櫻姬爪和白墨為墨蘭，其TFC、總黃酮醇、總黃烷酮含量在所有樣品中分別位列第1、2、4位，可見墨蘭的TFC、總黃酮醇和總黃烷酮含量相對較高，具有一定的種屬特異性，詳見圖5、表5和表6。

除大富貴舌瓣、玉兔捧瓣外，所有樣品中的黃酮醇在總類黃酮中均占最高比例，為53.01%～97.93%，其中占比最高的為韓國小姐；大富貴舌瓣中的黃酮醇、黃酮占比接近；玉兔捧瓣中的黃酮醇占比僅為32.02%，而黃酮占比為67.02%；各樣品中的黃烷酮占比較低，為0～14.01%。由此可見，黃酮醇為蘭屬植物花的主要花黃素類型(表5)。由表6可以看出，有18個樣品中Qu含量在總黃酮醇含量中的占比達33.92%～75.81%，為主要的黃酮醇類型；而滇梅中的Km占比達55.44%，為主要的黃酮醇類型；金公主外瓣中以My為主要的黃酮醇類型，占比為30.87%；玉兔、FH-16、FH-19和大富貴舌瓣中以Ch為主要的黃酮醇類型，占比分別為39.12%、43.91%、46.99%和29.95%。除玉兔、白墨、金公主、FH-16、FH-19、大富貴舌瓣和瑞梅外，有21份樣品中的槲皮素3-O-蕓香糖苷(蕓香苷)含量最高，為主要的黃酮醇類物質(zhì)。

同一類色素對應(yīng)的不同色系花柱上標(biāo)有不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖7 不同色系蘭屬植物花中花色素含量Fig.7 Anthocyanin content in flowers of Cymbidium Sw. samples with different colors

2.3.2 類黃酮的主成分分析 以不同色系的24種蘭花為樣本，以類黃酮組成及含量作為變量，用Origin 2021進行主成分分析。如圖8所示，共提取出特征值大于1的2個主成分，不同材料分布在不同象限中，其中第1主成分的特征值為7.339，貢獻率為66.716%，第2主成分的特征值為2.012，貢獻率為18.290%，2個主成分的累計貢獻率達到85.006%，表明前2個主成分基本可以代表24種蘭花含有的85%的類黃酮信息。變量山柰酚3-O-半乳糖苷、山柰酚3-O-刺槐雙糖、槲皮素3-O-新橙皮糖苷、槲皮素3-O-蕓香糖苷、槲皮素3-O-丙二酰葡萄糖苷、柚皮素7-O-葡萄糖苷、矢車菊素 3-O-葡萄糖苷、矢車菊素 3-O-蕓香糖苷-5-O-葡萄糖苷、矢車菊素 3-O-丙二酰葡萄糖苷含量在第1主成分的正方向有較高的載荷系數(shù)，即與第1主成分表現(xiàn)為正相關(guān)，主要為槲皮素、山柰酚和矢車菊素類物質(zhì)，表明槲皮素、山柰酚為蘭花植物花中的主要黃酮醇，矢車菊素為主要的花青素；變量芍藥花素3-O-蕓香糖苷、芍藥花素3-O-丙二酰葡萄糖苷含量在第2主成分的正方向有較高的載荷系數(shù)，表明與第2主成分呈正相關(guān)，為芍藥花素類花青素苷。

從得分結(jié)果可以看出，黑墨(I)、櫻姬爪(J)、大富貴苞片(B)、白墨(L)、韓國小姐(Q)沿第1主成分正向分布，并且黑墨與峰f14、f43、f40、f41、f46、f6、a1、a3、a6靠近，表明這些成分在黑墨花瓣中的含量占有較高比例；凝香紫(A)、大富貴苞片(B)、櫻姬爪(J)、FH-19W、FH-16U沿第2主成分正向分布，表明這幾個材料都含有芍藥花素，其中大富貴苞片向峰a4、a6靠近，表明其中芍藥花素占有較高比例。其余材料包括紅紫色、黃色、黃綠色和灰橙色系，均分布于第1主成分、第2主成分的負(fù)方向，且具有較低的載荷系數(shù)，表明它們與第1、第2主成分呈弱負(fù)相關(guān)。上述結(jié)果表明，主成分分析能夠反映不同蘭花材料的類黃酮組成及含量差異。

2.3.3 類胡蘿卜素定量分析 由圖7可知，不同色系蘭屬植物花中類胡蘿卜素含量為158.75～2 067.56 μg/g，其中紫色系含量最高，紅紫色系含量最低。所有樣品中都含有類胡蘿卜素，含量為50.92～2 532.13 μg/g，含量最高的為大富貴苞片，其次是蒼巖素(2 173.34 μg/g)，紅霞中的含量最低(表5)。黃色系黃金小神童、FH-10中的類胡蘿卜素含量分別為551.53 μg/g、105.66 μg/g。大富貴不同部位的類胡蘿卜素含量表現(xiàn)為苞片(2 532.13 μg/g)>外瓣(1 576.77 μg/g)>舌瓣(145.64 μg/g)，差異顯著(P<0.05)。

從不同種群花中的類胡蘿卜素含量來看，春蘭類的類胡蘿卜素含量較高，除大富貴舌瓣、揚紅荷外瓣外，其他部分的類胡蘿卜素含量均達到1 000.00 μg/g以上，而其他蘭屬植物除黑墨以外，類胡蘿卜素含量均在1 000.00 μg/g以下，尤其是蓮瓣蘭品種、春蘭與大花蕙蘭雜交種的整體類胡蘿卜素含量水平較低，平均含量分別為137.28μg/g、123.35μg/g。

2.3.4 總?cè)~綠素含量的定量分析 由圖7可以看出，不同色系蘭屬植物花中葉綠素含量排序為棕色系>紫色系>黃綠色系>紅紫色系>黃色系>灰橙色系，含量分別為214.94 μg/g、180.01 μg/g、159.76 μg/g、22.39 μg/g、19.74 μg/g和1.97 μg/g，前3名與后3名間存在顯著差異(P<0.05)。由表5可以看出，所有樣品中都含有葉綠素，含量為1.97～419.92 μg/g，總?cè)~綠素含量最高的為蒼巖素外瓣，其次是大富貴外瓣，為316.23 μg/g，瑞梅外瓣的葉綠素含量也較高，達179.70 μg/g，在所有樣品中位列第5位，這些均為春蘭綠花品種，且與其他品種間差異明顯；大富貴花中不同部位的葉綠素含量排序為外瓣(316.23 μg/g)>苞片(73.73 μg/g)>舌瓣(8.71 μg/g)，差異顯著(P<0.05)。

PC1：主成分1；PC2：主成分2；a1～a6：分別為矢車菊素3-O-葡萄糖苷、矢車菊素3-O-蕓香糖苷、矢車菊素3-O-蕓香糖苷-5-O-葡萄糖苷、芍藥花素3-O-蕓香糖苷、矢車菊素3-O-丙二酰葡萄糖苷、芍藥花素3-O-丙二酰葡萄糖苷；f1～f64：檢出的花黃素，詳見表4。圖8 24份蘭屬樣品花中類黃酮含量的主成分分析Fig.8 Principal component analysis of the contents of flavonoids in flowers of 24 Cymbidium Sw. samples

表5 24份蘭屬樣品花中花色素組成及含量

表6 24份蘭屬樣品花中花黃素組成及含量

2.4 花色表型與花色素含量的相關(guān)性分析

為了分析參試蘭屬植物花瓣的顏色與花色素含量的關(guān)系，對花色CIEL*a*b*參數(shù)與胡蘿卜素、葉綠素、類黃酮、花青素苷物質(zhì)及類黃酮主成分含量進行相關(guān)性分析。如表7、表8所示，明度(L*)與TAC、Cy含量呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.557、-0.533，與a1、a5含量呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.460、-0.472；紅綠程度(a*)與葉綠素含量呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.463(P<0.05)；黃藍程度(b*)與TAC含量呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，相關(guān)系數(shù)為-0.528，與Cy、a1、a3、a5和a6含量呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.496、-0.455、-0.405、-0.448和-0.411(P<0.05)；飽和度(C)與TAC、Cy含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.558和-0.532(P<0.01)，與a1、a3和a5含量呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.497、-0.448和-0.494(P<0.05)，且與Sy含量呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.405(P<0.05)。

3 討論

3.1 24份蘭屬樣品花中類黃酮組成概況

本研究利用HPLC-MS方法分析了24個蘭屬樣品花中的類黃酮成分，共檢測出6種花青素，包括4種矢車菊素、2種芍藥花素；另外檢測到64種黃酮醇、黃酮、黃烷酮類物質(zhì)，包括山柰酚、槲皮素、異鼠李素、楊梅黃素、丁香亭、芹菜素、金圣草黃素和柚皮素類物質(zhì)，其中山柰酚、槲皮素、楊梅黃素和金圣草黃素為所有樣品共有的。對現(xiàn)有蘭科植物花中黃酮組成進行研究，發(fā)現(xiàn)其中都檢測出了矢車菊素、槲皮素、山柰酚和異鼠李素，但是不同研究中檢測出的花青素、花黃色素種類和數(shù)量差別較大，本研究檢出的花黃色素種類、數(shù)量高于以往的研究。張藝祎[14]在四川獨蒜蘭花瓣中檢測到4種矢車菊素、飛燕草素；宋小蒙[13]在金釵石斛蘭花中鑒定出 13 種矢車菊素、飛燕草素衍生物；Wang 等[12]在不同色系大花蕙蘭中檢測出6種矢車菊素、芍藥色素糖苷，6種槲皮素、山柰酚和異鼠李素糖苷；李文建等[29]在建蘭花瓣中檢測到8種矢車菊素、飛燕草素、天竺葵素、芍藥花素，12種槲皮素、山柰酚和異鼠李素；王紫珊[10]在卡特蘭Pink Lady花瓣中共發(fā)現(xiàn)9種矢車菊素、芍藥花素和矮牽牛素衍生物，18種槲皮素、山柰酚和異鼠李素糖苷；李崇暉等[9]從不同顏色蝴蝶石斛蘭品種花中共檢測出28種矢車菊素糖苷與19 種槲皮素、山柰酚和異鼠李素糖苷；李崇輝等[16]在文心蘭唇瓣中檢測到5 種矢車菊素、芍藥花素糖苷和23種黃酮、黃酮醇苷(苷元有木樨草素、金圣草黃素、槲皮素、山柰酚和異鼠李素)；Griesbach[33]在大花蕙蘭中檢測到黃酮芹菜素糖苷。本研究檢出的楊梅素、丁香亭和柚皮素類衍生物均為首次在蘭科植物中發(fā)現(xiàn)，類黃酮種類多樣性的增加豐富了對蘭科植物花中類黃酮生物合成途徑的認(rèn)識。

表7 24份蘭屬樣品花色表型參數(shù)與花色素含量的相關(guān)性

表8 24份蘭屬樣品花色表型參數(shù)與類黃酮類物質(zhì)主要成分含量的相關(guān)性

通過主成分分析發(fā)現(xiàn)，參試蘭花花中主要的類黃酮成分為黃酮醇、黃烷酮、花青素，其中主要黃酮醇為槲皮素、山柰酚，主要黃烷酮為柚皮素，主要花青素為矢車菊素，與本研究中類黃酮定量分析結(jié)果相互印證。從類黃酮定量分析結(jié)果看出，共有16份材料含有花青素，不同色系蘭花材料的TAC含量表現(xiàn)為棕色系>紫色系>紅紫色系>灰橙色系>黃綠色系>黃色系，在紅紫色、紫色和棕色系花瓣中含有大量花青素，而灰橙色系花瓣中TAC含量較低，黃綠色系外瓣不含TAC或含量極低，黃色系外瓣中無花青素。在檢出花青素的16份樣品中，花青素類型均以矢車菊素為主，其中有8個樣品以矢車菊素 3-O-蕓香糖苷為主，7個樣品以矢車菊素3-O-丙二酰葡萄糖苷為主。所有樣品中均檢出花黃素，其中黃酮醇占比最大，且以槲皮素為主，槲皮素3-O-蕓香糖苷含量最高，這與前人的研究結(jié)果相似。Wang等[12]研究發(fā)現(xiàn)，矢車菊素3-O-蕓香糖苷、芍藥花素3-O-蕓香糖苷為大花蕙蘭的主要花青素苷，在黃色、綠色和白色系大花蕙蘭外瓣中沒有花青素。莊于彥[11]在研究有紅色斑點的文心蘭花色素成分時檢出矢車菊素、芍藥花素2種苷元，并認(rèn)為紫花品種具有較高的花青素含量，且以矢車菊素為主，綠色系、白色系蝴蝶石斛蘭花中不含花青素[9]。以上研究結(jié)果表明，矢車菊素是蘭屬植物花中主要的花青素，其次為芍藥花素，以矢車菊素 3-O-蕓香糖苷為主要成分；槲皮素、山柰酚和異鼠李素為普遍存在的黃酮醇類物質(zhì)，并且以槲皮素為主，槲皮素-3-O-蕓香糖苷為主要成分。

3.2 24份蘭屬樣品花色素對花色的影響

為了探究花色素對花色表型的影響，本研究統(tǒng)計了花青素、花黃素、類胡蘿卜素、葉綠素及類黃酮主成分與花色的相關(guān)性。前人研究發(fā)現(xiàn)，文心蘭、蝴蝶蘭的總花青素苷含量與花色的明度(L*)、色相(b*)呈顯著負(fù)相關(guān)[9,16]。本研究結(jié)果與之相似，由不同色系的花色表型與花色素含量之間的相關(guān)性分析結(jié)果可知，L*與TAC、Cy含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，說明總花青素及矢車菊素含量是影響L*的重要因素，隨著TAC或Cy含量的增加，可使花色變暗，反之可使明度提高；L*與a1和a5含量呈顯著負(fù)相關(guān)，說明矢車菊素 3-O-葡萄糖苷、矢車菊素 3-O-丙二酰葡萄糖苷是影響L*的主要花色素。紅綠程度(a*)與葉綠素含量呈顯著負(fù)相關(guān)，表明當(dāng)a*>0時，隨著葉綠素的積累，花瓣的紅色程度會減弱；當(dāng)a*<0時，花瓣的綠色程度會加深，說明葉綠素是影響花色紅綠程度的重要因素。b*與TAC含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，與Cy、a1、a3、a5和a6含量呈顯著負(fù)相關(guān)，說明總花青素、矢車菊素及矢車菊素 3-O-葡萄糖苷、矢車菊素 3-O-蕓香糖苷-5-O-葡萄糖苷、矢車菊素 3-O-丙二酰葡萄糖苷、芍藥花素3-O-丙二酰葡萄糖苷含量是影響b*的重要花色素，并且隨著TAC、Cy、a1、a3、a5和a6含量的增加，當(dāng)b*>0時，花瓣的黃色程度會隨之下降；當(dāng)b*<0時，花瓣的藍色程度會隨之增加，花色向紅紫色和紫色方向變化；隨著TAC、Cy、a1、a3、a5和a6含量的降低，b*發(fā)生相反變化。飽和度(C)與TAC、Cy含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，與a1、a3和a5含量呈顯著負(fù)相關(guān)，說明總花青素、矢車菊素以及矢車菊素 3-O-葡萄糖苷、矢車菊素 3-O-蕓香糖苷-5-O-葡萄糖苷、矢車菊素 3-O-丙二酰葡萄糖苷為影響花色飽和度的主要色素，并且隨著TAC、Cy、a1、a3、a5的積累，花瓣的色彩飽和度會隨之下降。而除Sy含量與C呈顯著負(fù)相關(guān)外，花黃素含量與花色表型沒有顯著的相關(guān)性，說明花黃素不是顏色參數(shù)的主要影響因素，與Li等[34]的研究結(jié)果一致，但可作為輔助色素，影響花青素色素的顏色，有研究結(jié)果表明，花黃素與糖苷發(fā)生的共色作用可以使花青素更加穩(wěn)定[35]。

有研究者認(rèn)為，蘭花紅色部分(暗紅色和暗紫紅色)的花色主要取決于花青素苷元比例，芍藥花素含量越高，花色越偏向紅色；矢車菊素含量越高，花色越偏向紫色；類胡蘿卜素可以使花呈現(xiàn)黃色、橙色[11]。本研究中所有檢出花青素的樣品均以矢車菊素為主，并且花色呈現(xiàn)紅紫色至紫色。

本研究對春蘭大富貴花朵不同部位花色素進行了檢測，結(jié)果表明，TAC含量表現(xiàn)為苞片>舌瓣>外瓣，類胡蘿卜素含量表現(xiàn)為苞片>外瓣>舌瓣，葉綠素含量表現(xiàn)為外瓣>苞片>舌瓣，均存在顯著差異。大富貴苞片呈現(xiàn)紫色，其花青素、類胡蘿卜素和葉綠素含量均具有較高水平，由于具有較高含量的花青素，使花色向紅紫色、紫色方向變化，明度降低，而較高含量的葉綠素使花色綠色程度加深，同時由于類胡蘿卜素與花青素協(xié)同作用，可使花色呈現(xiàn)出單一類花色素?zé)o法呈現(xiàn)的橘紅色至紅色、青銅色至棕色的變化[36]，在上述3種花色素的綜合作用下，大富貴苞片顏色向紫色方向變化。同理，黑墨花中含有極高含量的花青素(為大富貴苞片的3.14倍)，使其花色較暗，在與較高含量的類胡蘿卜素、葉綠素協(xié)同作用下呈現(xiàn)出棕色。大富貴舌瓣呈白底紅斑，其類胡蘿卜素、葉綠素含量較低，而花青素含量較高，前人研究發(fā)現(xiàn)，大花蕙蘭綠色、白色花的舌瓣紅斑明顯則表明花青素含量較高，紅斑淺淡則表明只含有微量花青素[12]。此外，在文心蘭舌瓣為黃色、綠色的材料中也未檢出花青素[16]。以上研究結(jié)果表明，參試蘭屬植物花舌瓣紅斑部分主要由花青素決定，舌瓣底色主要受類胡蘿卜素、葉綠素影響；大富貴外瓣為綠色并有1條紅筋，其葉綠素、類胡蘿卜素含量較高，TAC含量較低，推測其瓣綠色主要受葉綠素影響，而瓣紅筋部分由花青素產(chǎn)生。

在所有參試材料中都檢測到了類胡蘿卜素、葉綠素，黃色系和黃綠色系花瓣中類胡蘿卜素水平與紅紫色系沒有明顯差異，但黃色系不含有花青素，黃綠色系含有低含量或不含有花青素，表明使參試蘭屬植物花色呈黃色的主要花色素是類胡蘿卜素。與本研究結(jié)果相似的是，Hieber等[37]發(fā)現(xiàn)切花文心蘭Onc. Gower Ramsey系列的黃色唇瓣中的主要黃色色素是幾種類胡蘿卜素。與粉紅色、紅色系月季相比，黃色月季花瓣中的花青素苷含量很低，總黃酮醇含量適中，類胡蘿卜素含量最高[8]。

根據(jù)RHCSS評價指標(biāo)，本研究有8份材料被判斷為黃綠色系，但目測又可將其分為綠色、黃綠色，綠色包括大富貴外瓣以及蒼巖素、瑞梅、白墨、蓮瓣素、翠玉外瓣，其中白墨、蓮瓣素和翠玉外瓣葉綠素含量較低，為11.87～110.64 μg/g，類胡蘿卜素含量也較低，為72.99～513.38 μg/g，且不含花青素，葉綠素為這3個材料的主要花色素；蒼巖素、大富貴和瑞梅外瓣葉綠素含量水平較高，為154.6～316.23 μg/g，雖然類胡蘿卜素含量均為黃色系材料的2～5倍，達799.60～1 611.13 μg/g，且大富貴、瑞梅外瓣含有少量的花青素，含量為52.87～99.95 μg/g，但可能由于葉綠素水平較高因而呈現(xiàn)綠色，表明葉綠素對蘭屬植物花色呈現(xiàn)綠色有重要影響。此外，凝香紫、黑墨與韓國小姐外瓣的葉綠素含量在種群內(nèi)也處于較高水平，但其外瓣分別呈現(xiàn)紫色、棕色及紅紫色，可能與其同時含有高含量的花青素有關(guān)。

綜上，推測花青素、葉綠素是本研究中參試蘭屬植物花呈色的關(guān)鍵色素，類胡蘿卜素是黃色花的主要色素。

3.3 24份蘭屬材料花中類黃酮代謝途徑推測

根據(jù)花中代謝物的相對含量，結(jié)合前人的研究結(jié)果[12,29]，推測蘭屬植物花瓣中類黃酮代謝途徑如下：香豆酰-COA和丙二酰-COA依次在查耳酮合成酶(CHS)、查耳酮異構(gòu)酶(CHI)的催化下生成柚皮素(是合成所有類黃酮所必需的)。柚皮素在黃酮合酶(FNS)催化下生成芹菜素，進而在F3′H催化下生成木樨草素，在甲基轉(zhuǎn)移酶(MT)催化下生成金圣草黃素[38-39]，這是黃酮合成的關(guān)鍵分支步驟。柚皮素受黃烷酮-3-羥化酶(F3H)的催化，生成二氫山柰酚(DHK)，DHK分別受類黃酮-3′-羥化酶(F3′H)、類黃酮-3′-5′-羥化酶(F3′5′H)的作用，合成二氫槲皮素(DHQ)和二氫楊梅素(DHM)。DHK、DHQ和DHM在黃酮醇合成酶(FLS)作用下分別生成山柰酚、槲皮素和楊梅素，這是黃酮醇合成的關(guān)鍵分步驟[40]。槲皮素、楊梅素進而在甲基轉(zhuǎn)移酶MT作用下分別生成異鼠李素、丁香亭。另外，DHK、DHQ和DHM 在二氫黃酮醇還原酶(DFR)和花青素苷元合成酶(ANS)的催化下分別產(chǎn)生著色的花青素如天竺葵素、矢車菊素和飛燕草素[36]，其中矢車菊素受到MT的催化而合成芍藥花素，飛燕草素接連受到MT的催化，分別合成矮牽牛素和錦葵素(圖9)。綜合分析可知，本研究參試蘭屬花組織中檢測到矢車菊素和芍藥色素的衍生物，表明花青素的形成涉及ABP通路中的矢車菊素合成分支。

虛線框表示本研究未涉及的代謝途徑；CHS：查爾酮合成酶；CHI：查爾酮異構(gòu)酶；FNS：黃酮合成酶；F3H：黃烷酮-3-羥化酶；F3′H：類黃酮-3-羥化酶； F3′5′H：類黃酮 3′5′-羥化酶；FLS：黃酮醇合成酶；DFR：二氫黃酮醇還原酶；ANS：花青素合成酶； 3GT：類黃酮 3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶；MT：轉(zhuǎn)甲基酶。圖9 24份蘭屬材料花中類黃酮代謝途徑Fig.9 Metabolic pathways of flavonoids in flowers of 24 Cymbidium Sw. samples