彭雪峰 劉毅 趙飛 王瑞敏 張譯心 賈躍進

摘要：目的 利用網(wǎng)絡(luò)藥理學和分子對接的方法分析血府逐瘀湯治療失眠障礙的有效成分、靶點及通路，探討其作用機制。方法 檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫，獲取方劑各藥物有效成分及靶點;在GeneCards等數(shù)據(jù)庫中檢索疾病相關(guān)靶點，獲得方劑與疾病的交集靶點，并使用String數(shù)據(jù)庫及CytoscapeV3.7.2構(gòu)建疾病-藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)和核心蛋白互作網(wǎng)絡(luò);在Metascape平臺對交集靶點進行GO和KEGG通路富集分析;選取核心成分與核心靶點分子對接。結(jié)果 總共得到血府逐瘀湯有效成分107種，對應靶點188個，與失眠障礙交集靶點70個，核心成分13種，核心靶點11個;GO富集分析共得1182條結(jié)果，主要有細胞對激素刺激的反應、腎上腺素受體活性、突觸前膜等;KEGG通路富集分析共得88條通路，主要有：神經(jīng)活性配體-受體相互作用、多巴胺能突觸、膽堿能突觸等;分子對接結(jié)果表明絕大多數(shù)核心靶點與核心成分能形成穩(wěn)定結(jié)合。結(jié)論 初步揭示血府逐瘀湯治療失眠障礙的關(guān)鍵成分、靶點及關(guān)鍵通路，以供臨床使用和進一步研究參考。

關(guān)鍵詞：網(wǎng)絡(luò)藥理學;分子對接;失眠障礙;作用機制;血府逐瘀湯

中圖分類號：R256.23?? 文獻標志碼：A?? 文章編號：1007-2349（2022）01-0041-10

Network Pharmacological Study on the Mechanism of Xuefu Zhuyu Decoctionin the Treatment of Insomnia

PENG Xue-feng1， LIU Yi1， ZHAO Fei1， WANG Rui-min1， ZHANG Yixin1， JIA Yue-jin1

（1. Shanxi University of Traditional Chinese Medicine， Taiyuan 030024， China;2. The Affiliated Hospital of Shanxi University of Traditional Chinese Medicine， Taiyuan 030024， China）

【Abstract】Objective： To analyze the effective components， targets and pathways of Xuefu Zhuyu Decoction in the treatment of insomnia disorders by means of network pharmacology and molecular docking， and to explore its mechanism of action. Methods： The TCMSP database was searched to obtain the effective ingredients and targets of the prescriptions and to find disease-related targets in databases such as GeneCards to obtain the intersection targets of the prescriptions and diseases and to construct disease-drug-components -Target network and core protein interaction network by using the String database and CytoscapeV3.7.2， to conduct GO and KEGG pathway enrichment analysis on the intersection target on the Metascape platform and to select the core component to dock with the core target molecule. Results： A total of 107 active ingredients of Xuefu Zhuyu Decoction were obtained， corresponding to 188 targets， 70 targets that intersect with insomnia， 13 core components， and 11 core targets. The GO enrichment analysis yielded a total of 1182 results， mainly including cell response to hormone stimulation， adrenergic receptor activity， presynaptic membrane， etc. The KEGG pathway enrichment analysis yielded a total of 88 pathways， including： neuroactive ligand-receptor interactions， dopaminergic synapses， cholinergic synapses， etc. The molecular docking results showed that most of the core targets and core components could form a stable combination. Conclusion： The study preliminarily reveals the key components， targets and key pathways of Xuefu Zhuyu Decoction in the treatment of insomnia， and provides reference for clinical use and further research.

【Key words】Network Pharmacology; Molecular Docking; Insomnia; Mechanism of Action; Xuefu Zhuyu Decoction

失眠障礙（insomnia disorder，ID）是最常見的睡眠障礙，全世界約有10%的人口受其影響[1]。國際睡眠障礙分類（ICSD-3）中，將其定義為：有足夠的睡眠機會和條件下，仍存在持續(xù)的入睡困難，睡眠維持困難，早醒或睡眠質(zhì)量差，并導致某種形式的日間功能障礙的睡眠障礙[2]。研究證實ID是一些精神及軀體疾病發(fā)展的危險因素，是人們身心健康的潛在威脅，然而目前在其治療上仍缺乏較為理想的藥物[3-4]。中醫(yī)藥具有整體性以及多靶點、多途徑發(fā)揮作用的特點，因此挖掘中醫(yī)藥可為ID的藥物治療提供新思路。

血府逐瘀湯（XFZYT）是清代醫(yī)家王清任所創(chuàng)治瘀血名方，方含：柴胡（CH）、赤芍（CS）、川牛膝（CNX）、川芎（CX）、當歸（DG）、地黃（DH）、甘草（GC）、紅花（HH）、桔梗（JG）、桃仁（TR）、枳殼（ZQ）十一味藥物，具有行氣活血的功效。臨床研究認為其治療ID有理想效果，現(xiàn)代藥理學研究亦表明該方藥物具有保護神經(jīng)和腦血管、改善微循環(huán)、抗抑郁、增強記憶等作用與ID有較大相關(guān)性[5-15]。另外該方通過多成分、多靶點、多通路發(fā)揮作用，因此有復雜網(wǎng)絡(luò)的特質(zhì)，所以通過網(wǎng)絡(luò)藥理學研究可一定程度揭示其作用機制，為臨床應用及進一步研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 藥物有效成分與靶點搜集 在TCMSP數(shù)據(jù)庫（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）中分別檢索XFZYT中各藥物有效成分，按照OB（oral bioavailability）≥30%，BBB（blood brain barrier）≥-0.3，DL（drug—likeness）≥0.18的限定標準進行篩選，獲得其有效成分后匹配相應靶點，再將得到的靶點在Uniprot數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）中匹配基因名。

1.2 疾病靶點與藥物-疾病交集靶點搜集 在GeneCards（https：//www.genecards.org/）、OMIM（https：//omim.org/）、TTD（http：//db.idrblab.net/ttd/）數(shù)據(jù)庫中，檢索“insomnia disorder”，得到疾病的相關(guān)靶點，并取藥物有效成分靶點與疾病靶點交集，以Venn圖表示。

1.3 疾病-藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)和蛋白互作關(guān)系（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 使用CytoscapeV3.7.2，將ID、XFZYT、有效成分、相關(guān)靶點作為節(jié)點，其相互關(guān)系作為邊，構(gòu)建方劑-藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)及疾病-藥物-成分-交集靶點網(wǎng)絡(luò);再將藥物-疾病交集靶點運用String數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，并在Cytoscape中通過篩選得出核心PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.4 GO（Gene Ontology）富集分析和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路富集分析 在Metascape平臺（https：//metascape.org/）中導入1.2中交集靶點并分別進行GO分子功能、細胞成分、生物過程和KEGG通路富集分析，然后利用在線作圖平臺ImageGP（http：//www.ehbio.com/ImageGP/）繪制富集氣泡圖。

1.5 核心成分和核心靶點分子對接 選取1.3疾病-藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點度>2倍中位數(shù)的核心有效成分及核心PPI網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點分別在ZINC（http：//zinc.docking.org/）、PDB（http：//www.rcsb.org/）數(shù)據(jù)庫中找到其3D結(jié)構(gòu)，預處理后使用Autodock vina分子對接，并在Pymol中將其構(gòu)象可視化。

2 結(jié)果

2.1 XFZYT有效成分與靶點搜集結(jié)果 通過檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫并限定OB、BBB、DL值，獲得CH有效成分9種，對應靶點85個;CS有效成分9種，對應靶點130個;CNX有效成分2種，對應靶點62個;CX有效成分6種，對應靶點54個;DG有效成分2種，對應靶點46個;DH有效成分2種，對應靶點34個;GC有效成分69種，對應靶點1270個;HH有效成分12種，對應靶點174個;JG有效成分2種，對應靶點29個;TR有效成分5種，對應靶點82個;ZQ有效成分3種，對應靶點82個。將其合并、排除并去重，共計得到XFZYT有效成分107種，包括重復成分5種，對應靶點188個，具體信息見表1。

2.2 ID疾病靶點與藥物-疾病交集靶點搜集結(jié)果 在GeneCards、OMIM及TTD數(shù)據(jù)庫中檢索ID，分別獲得靶點2281、673、28個，合并去重后共得ID靶點2916個。將其與2.1中XFZYT的188個靶點取交集，如圖1，可得交集靶點70個，該70個靶點分屬95種成分。

2.3 疾病-藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)和PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果 方劑-藥物-成分-靶點和疾病-方劑-成分-交集靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果如圖2、3所示，其中圖2中有307節(jié)點，1371條邊;圖3中有167個節(jié)點，762條邊。結(jié)合以上兩個網(wǎng)絡(luò)并利用Cytoscape的NetworkAnalyzer插件計算節(jié)點度，得出節(jié)點度較大（DC>二倍中位數(shù)）的核心有效成分13個，具體如表2中核心成分列所示。再將70個交集靶點導入String數(shù)據(jù)庫，選定物種為智人，得出以靶點為節(jié)點，蛋白互作關(guān)系為邊的PPI網(wǎng)絡(luò)，如圖4，其中節(jié)點數(shù)為70，邊數(shù)為509，平均節(jié)點度為14.5，平均局部聚類系數(shù)為0.656;同時使用Cytoscape分析PPI網(wǎng)絡(luò)，篩選節(jié)點度大于1.5倍中位數(shù)的靶點為核心靶點并構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，可得核心靶點為：ALB、AKT1、FOS、VEGFA、CREB1、CCND1、ESR1、CTNNB1、AR、FGF2、ACHE，如圖5。

2.4 GO富集分析和KEGG通路富集分析結(jié)果 使用Metascape平臺對交集靶點分別進行GO和KEGG通路富集分析，其中GO富集分析得到1182條結(jié)果，包括GO生物過程、分子功能和細胞成分各1005、121和56條結(jié)果;KEGG通路富集分析則得到88條結(jié)果。然后以P值<0.01，最小計數(shù)為3，富集因子>1.5篩選其前20、20、13和17項結(jié)果，繪制富集氣泡圖，如圖6、7。結(jié)果可見，主要生物過程包括：細胞對激素刺激的反應、行為、化學突觸傳遞、循環(huán)系統(tǒng)中的血管過程、神經(jīng)遞質(zhì)水平調(diào)節(jié)等;分子功能主要涉及：腎上腺素受體活性、激素結(jié)合、銨離子結(jié)合、單胺跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性等;細胞成分則主要有：突觸前膜、受體復合體、膜筏等;通路則包含：神經(jīng)活性配體-受體相

互作用、內(nèi)分泌抵抗、多巴胺能突觸、雌激素信號通路、膽堿能突觸等。再以通路、交集靶點作為節(jié)點，其相互關(guān)系為邊構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，如圖8，其中神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路基因占比、q值都明顯高于其他通路，因此可以判斷藥物最可能藉由該通路發(fā)揮作用，其具體作用機制如圖9。

2.5 核心成分與核心靶點分子對接結(jié)果 核心成分與核心靶點分子對接結(jié)果絕大多數(shù)都小于-5.0 kcal/mol，如表2所示，可見絕大部分的核心成分與核心靶點組合都可形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。然后使用Pymol將與每個核心靶點對接最穩(wěn)定的核心成分的對接構(gòu)象可視化，如圖10，其中灰色部分為靶點，綠色部分為成分分子，其余各色標記殘基，并顯示名稱，黃色虛線為氫鍵，并標示距離。

3 討論

祖國醫(yī)學將ID稱為“不寐”，認為其總病機為“營衛(wèi)失合，陰陽不交”[16]，如《黃帝內(nèi)經(jīng)》所述：“衛(wèi)氣不得入于陰，長留于陽，則陽氣滿，……不得入與陰則陰氣虛，故不目瞑[17]。”可見營衛(wèi)的運行是不寐發(fā)病的決定性因素。而與營衛(wèi)運行最為相關(guān)的是周身氣血的運行，所謂“氣血沖和，萬病不生，一有怫郁，諸病生焉”[18]。因此氣滯血瘀可導致營衛(wèi)運行紊亂發(fā)為不寐，另外不寐往往病程較長，“久病多瘀”，故綜合來看治療不寐當行氣活血，且以活血化瘀為主，因此認為XFZYT可對證治療ID。

本研究通過疾病-藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)綜合分析篩選所得的核心成分中：成分A是天然植物甾醇，動物實驗證實其可通過激活雌激素或NMDA受體，增強膽堿能神經(jīng)傳遞系統(tǒng)而介導認知改善作用，并可通過升高γ-氨基丁酸（GABA）、谷胱甘肽及降低多巴胺（DA）、乙酰膽堿酯酶（AChE）等神經(jīng)遞質(zhì)的水平而發(fā)揮改善精神癥狀和腦功能的作用[19-20];成分B是植物甾醇的主要成分，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）中可表現(xiàn)抗焦慮和鎮(zhèn)靜作用，在小鼠腦中可通過增加去甲腎上腺素（NE）及5-羥色胺（5-HT）而介導抗抑郁樣活性[21-22];D成分是天然黃酮類，在體內(nèi)體外均有有效的神經(jīng)保護作用，試驗證實其在CNS中表現(xiàn)抗焦慮和鎮(zhèn)靜作用，其藥理活性取決于GABA能非苯二氮卓類藥物的位點[23-24];以上3種成分皆是藥物的共有成分，分屬8種藥物，因此可以看出XFZYT中各藥物存在協(xié)同作用。此外GC3、GC4、GC5、GC9、GC11、GC23、GC38、GC49、GC53、GC58都是甘草中的黃酮類物質(zhì)，多項研究報道該類物質(zhì)存在抗抑郁及神經(jīng)保護作用[25]。

根據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)篩選出的核心靶點中：ALB編碼人類血液中最豐富的物質(zhì)——血清白蛋白，已證實其是哺乳動物血清中存在的神經(jīng)保護因子，且有動物實驗表明其有增加睡眠的作用[26-28];AKT1基因編碼的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶對神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育和功能至關(guān)重要[29];FOS的表達則被認為和覺醒有關(guān)[30];VEGFA和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子可共同發(fā)揮抗抑郁和神經(jīng)營養(yǎng)作用，還可能對GABA能神經(jīng)元產(chǎn)生影響[31-32];CREB1編碼磷酸化依賴性轉(zhuǎn)錄因子，可參與包括晝夜節(jié)律同步等多種細胞過程，并且與快速眼動（REM）睡眠在抑郁癥中的作用有關(guān)[33-34];CTNNB1編碼的連環(huán)蛋白β1可介導Wnt信號而發(fā)揮DA能神經(jīng)元保護作用[35];FGF2編碼的成纖維細胞生長因子2有抗抑郁作用[36];ESR1和AR編碼雌激素和雄激素受體，而性激素可對睡眠過程產(chǎn)生重要影響，雌激素和孕酮調(diào)控女性一生荷爾蒙周期相關(guān)的睡眠方式變化，雄激素則可影響晝夜節(jié)律的時相[37-38];ACHE編碼的AChE通過水解乙酰膽堿而終止信號傳導，其抑制劑可治療REM睡眠行為障礙[39]。

GO富集分析所獲得的主要生物過程中：細胞對激素刺激的反應是主要的生物過程，因XFZYT的核心有效成分多數(shù)有激素樣作用，核心靶點中ESR1、AR等都與激素有關(guān)，而睡眠的生物過程是多種激素作用的結(jié)果，如：食欲素、褪黑素、生長激素、皮質(zhì)醇等[40];睡眠和很多行為可相互影響，而與之相關(guān)的認知行為療法（CBT）是目前治療ID安全有效的一種方法[41];神經(jīng)遞質(zhì)水平調(diào)節(jié)和化學突觸傳遞生物過程則是腺苷、GABA、5-HT、褪黑素等促睡眠因子及DA、NE、組胺等促覺醒因子均涉及的生物過程[42];循環(huán)系統(tǒng)則與睡眠不同階段顯著變化有關(guān)，其中人腦血液循環(huán)與睡眠-覺醒的關(guān)聯(lián)尤為重要[43-44]。KEGG通路富集分析所得主要通路中：神經(jīng)活性配體-受體相互作用、多巴胺能突觸、膽堿能突觸都與睡眠的神經(jīng)化學機制相關(guān);內(nèi)分泌抵抗、雌激素信號通路則與睡眠的激素調(diào)節(jié)相關(guān);二者在之前GO富集分析中已做敘述，此處省略。由分子對接結(jié)果可得，絕大部分核心成分可與核心靶點形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，將其進一步進行數(shù)據(jù)分析，得出對接較好的核心成分為：GC38（shinpterocarpin）、GC53（4-甲氧基光甘草定）、D（黃芩素）、A（豆甾醇），對接較好的核心靶點有：ALB、AKT1、AR、ESR、ACHE，可將這些成分和靶點認為是關(guān)鍵成分和關(guān)鍵靶點。

綜合以上，可得XFZYT治療ID的關(guān)鍵成分為：shinpterocarpin、4-甲氧基光甘草定、黃芩素、豆甾醇，作用于ALB、AKT1、AR、ESR、ACHE等關(guān)鍵靶點，通過調(diào)節(jié)血清白蛋白、AKT1激酶、性激素以及AChE，并藉由神經(jīng)活性配體-受體相互作用、多巴胺能突觸、膽堿能突觸、內(nèi)分泌抵抗、雌激素信號通路等通路發(fā)揮作用。該結(jié)論可為進一步研究提供一定參考與思路。

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（收稿日期：2021-11-08）