劉曉華，張 飛，劉利芳，王建國(guó)，陳昕宇，郭 靜，張 靜

(內(nèi)蒙古鴻茅藥業(yè)有限責(zé)任公司，內(nèi)蒙古 烏蘭察布 013750)

鴻茅藥酒由蓽茇、小茴香、肉桂、高良姜、紅曲等六十七味藥材組成的復(fù)方制劑。標(biāo)準(zhǔn)收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第十四冊(cè)(標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)：WS3-B-2792-97)，目前沒(méi)有含量測(cè)定項(xiàng)。因此，本文根據(jù)蓽茇藥材在鴻茅藥酒中占有較多(0.50 mg/100mL)的特點(diǎn)，選擇蓽茇中胡椒堿為指標(biāo)成分，進(jìn)行HPLC含量測(cè)定方法的驗(yàn)證。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀(島津LC-20AT、島津LC-10AT)；百萬(wàn)分之一電子天平(XPR10型)；萬(wàn)分之一電子天平(ESJ182-4型)。

1.2 試劑與試藥

鴻茅藥酒各批號(hào)供試品由內(nèi)蒙古鴻茅藥業(yè)有限責(zé)任公司提供；胡椒堿對(duì)照品(批號(hào)：110775-202107,含量：98.2%)，由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；甲醇為色譜純,水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法學(xué)考察

2.1 色譜條件

采用Shim-pack GIST C18, 250mm×4.6mm I.D，5μm色譜柱和BETASIL C184.6mm*250mm，5μm色譜柱；以甲醇-水(77∶23)為流動(dòng)相，胡椒堿的分離度大于1.5；40℃柱溫；檢測(cè)波長(zhǎng)343nm；理論板數(shù)以胡椒堿峰計(jì)1500以上。

2.2 實(shí)驗(yàn)用溶液的制備

精密量取鴻茅藥酒100mL，用石油醚(60～90℃)振搖提取三次，每次50mL，合并石油醚液，揮干，殘?jiān)蛹状既芙?，定容?0mL容量瓶中，微孔濾膜濾過(guò)，續(xù)濾液作為供試品溶液。取胡椒堿對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇制成每1mL含20μg的溶液，作為對(duì)照品溶液。再取按處方比例并以相同工藝制備的缺蓽茇的陰性對(duì)照樣品，按供試品溶液制備法制得陰性對(duì)照溶液。

2.3 專(zhuān)屬性考察

在上述色譜條件下,分別精密吸取對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照溶液、供試品溶液各10μL，分別注入液相色譜儀。

測(cè)得結(jié)果為：陰性對(duì)照色譜圖中在與胡椒堿對(duì)照品以及供試品色譜圖相應(yīng)的保留時(shí)間處無(wú)色譜峰出現(xiàn)，表明其他組分對(duì)胡椒堿的測(cè)定無(wú)干擾。見(jiàn)陰性對(duì)照?qǐng)D譜、胡椒堿對(duì)照品圖譜、供試品圖譜、數(shù)據(jù)比較圖譜。

圖1 陰性對(duì)照?qǐng)D譜、胡椒堿對(duì)照品圖譜、供試品圖譜、數(shù)據(jù)比較圖譜

2.4 線性關(guān)系

取胡椒堿對(duì)照品約2.0mg，精密稱(chēng)定，置100mL量瓶中，加甲醇使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液(對(duì)照品溶液實(shí)際濃度為20.9μg/mL)；分別吸取對(duì)照品溶液6.0μL、8.0μL、10.0μL、12.0μL、14.0μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。胡椒堿在0.1254μg～0.2926μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=156311x-7011.79，r=0.9999。標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)值見(jiàn)表1。標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖2。

表1 胡椒堿標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)值表

圖2 胡椒堿標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.5 精密度

取同一份供試品(批號(hào)：20220601)，連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定。6針精密度RSD(%)=0.06%，見(jiàn)表2。

表2 同一供試品連續(xù)進(jìn)樣6針精密度結(jié)果

2.6 溶液穩(wěn)定性

取同一份供試品(批號(hào)：20220601)，15h穩(wěn)定性RSD(%)=1.23%，見(jiàn)表3。

表3 同一供試品15小時(shí)穩(wěn)定性結(jié)果

2.7 耐用性試驗(yàn)

取同一份供試品(批號(hào)：20220601)，不同型號(hào)的色譜儀、不同的色譜柱測(cè)定，結(jié)果基本一致，見(jiàn)表4。

表4 同一供試品不同色譜柱型號(hào)及色譜儀型號(hào)穩(wěn)定性結(jié)果

2.8 重復(fù)性

取同一樣品的6份供試品，測(cè)定，其RSD(%)=0.60%，見(jiàn)表5。

表5 同一批號(hào)6份供試樣品重復(fù)性結(jié)果

2.6 加樣回收試驗(yàn)

精密量取含有胡椒堿為0.4478mg/100mL的鴻茅藥酒6份，各100mL，加入0.506mg/mL胡椒堿對(duì)照品溶液1mL，按供試品制備方法制備并測(cè)定。加樣回收率結(jié)果見(jiàn)表6。本方法的平均回收率為101.98%，符合《中國(guó)藥典》2020年版四部9101“藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則”中“表2 樣品中待測(cè)定成分含量和回收率限度”的要求。

表6 胡椒堿加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

3 樣品含量測(cè)定

取樣品約100mL，各兩份，精密量取，制備并測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 樣品中胡椒堿的含量測(cè)定結(jié)果

4 討論

4.1 提取方法的選擇

由于鴻茅藥酒是由67味藥材和大量的糖、白酒構(gòu)成，每味藥材的量很少，再加上大量的糖的干擾，供試品前處理比較難。經(jīng)過(guò)對(duì)前處理方法比較，其中，氯仿萃取法、乙醇提取法處理樣品，方法基本可行，但是，氯仿毒性大，乙醇提取雜峰多，因此，均沒(méi)有采用。

本文采用直接用石油醚(60～90℃)萃取被測(cè)組分同時(shí)可以排除大量糖的干擾，殘?jiān)眉状既芙庾鳛楣┰嚻啡芤旱闹苽浞椒?。?yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單，能夠除去大量糖的影響，對(duì)待測(cè)組分有富集作用，該方法的回收率較高，制備的供試品溶液黏度很小，沒(méi)有造成對(duì)色譜柱的堵塞等現(xiàn)象。故采用此制備方法作為前處理樣品的方法。

4.2 柱溫的選擇

采用40℃可以保證柱壓較低，消除殘留在樣品溶液的糖分影響，分離效果穩(wěn)定，保留時(shí)間變化小。溫度的變化，對(duì)胡椒堿出峰時(shí)間有影響，但對(duì)峰面積的影響較小。

5 結(jié)果

HPLC對(duì)鴻茅藥酒中蓽茇藥材的指標(biāo)性成分進(jìn)行測(cè)定，經(jīng)分析方法驗(yàn)證，表明該方法重現(xiàn)性好，專(zhuān)屬性強(qiáng)，方中其它組分對(duì)胡椒堿的測(cè)定無(wú)干擾。