侯雯,苗春麗,董雙林

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,江蘇 南京 210095)

小菜蛾(Plutellaxylostella)為世界性重要農(nóng)業(yè)害蟲,專一取食甘藍(lán)、油菜、蘿卜等十字花科蔬菜和油料作物,每年造成全球40～50億美元的經(jīng)濟(jì)損失[1]。在我國,小菜蛾普遍發(fā)生,尤以長江流域及以南地區(qū)嚴(yán)重,每年造成經(jīng)濟(jì)損失和防治費(fèi)用達(dá)7.7億美元[2]。芥子油苷(glucosinolate,GS)是十字花科植物的特征性次生防御物質(zhì),當(dāng)植物組織被昆蟲取食后,黑芥子酶和芥子油苷充分接觸并發(fā)生水解反應(yīng),迅速并大量生成異硫氰酸酯(isothiocyanate,ITC)等有毒物質(zhì)而對害蟲發(fā)生毒害。小菜蛾之所以能專一性取食十字花科植物而不被GS毒害,是因為其幼蟲消化道內(nèi)存在一種特殊的硫酸酯酶,可在食物被攝入后很快將GS脫硫,形成既無毒性又不能被黑芥子酶降解的脫硫GS[3-4]。更有趣的是,小菜蛾分別以GS及ITC為重要嗅覺和味覺信號來定位和識別寄主植物并進(jìn)行產(chǎn)卵或取食[5-7]。Liu等[8]發(fā)現(xiàn)嗅覺受體OR35和OR49共同參與小菜蛾對ITC氣味的特異性感受,但有關(guān)小菜蛾感受GS的味覺分子機(jī)制尚不明確。

昆蟲的味覺感器主要分布于觸角、口器附肢、足跗節(jié)和產(chǎn)卵器等組織[9-10]。小菜蛾雌蛾在植物葉片產(chǎn)卵時,常伴有以前足和觸角碰觸葉片的行為[11-13],因此推測前足跗節(jié)和觸角可能參與了對葉面芥子油苷等信號化合物的感受。前人研究發(fā)現(xiàn),去除觸角使小菜蛾雌蛾在不同介質(zhì)間的產(chǎn)卵選擇性及雄蛾的交配率降低[14],去除觸角和足跗節(jié)使小菜蛾雌蛾對薄荷等5種非寄主植物乙醇提取物的產(chǎn)卵忌避反應(yīng)降低[15]。為了明確在小菜蛾對芥子油苷介導(dǎo)的產(chǎn)卵刺激反應(yīng)中觸角和前足跗節(jié)的作用,本研究首先利用不同濃度芥子油苷粗提液測定并證實(shí)了芥子油苷對小菜蛾雌蛾產(chǎn)卵的刺激作用,然后利用2種產(chǎn)卵介質(zhì)(保鮮膜和植物葉片),通過去除前足跗節(jié)或/和觸角后的雌蛾產(chǎn)卵選擇性試驗,研究前足跗節(jié)和觸角在芥子油苷刺激產(chǎn)卵中的作用。研究結(jié)果為進(jìn)一步研究小菜蛾對芥子油苷的感受機(jī)制提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 昆蟲飼養(yǎng)及處理

小菜蛾幼蟲以人工飼料[16]飼養(yǎng),成蟲用10%(體積分?jǐn)?shù))蜂蜜水飼養(yǎng),養(yǎng)蟲室溫度為(27±1)℃,濕度為(65±5)%,光周期(光/暗時間)為15 h/9 h。

選擇2日齡雌、雄成蟲進(jìn)行產(chǎn)卵選擇性試驗。酸蝕前足跗節(jié)和去除觸角采用Yan等[14]和Zhang等[17]的方法。共設(shè)3個處理:1)酸蝕前足跗節(jié)(CP):用二氧化碳麻醉試蟲10 s,然后用棉簽蘸取5 mol·L-1鹽酸溶液,在體視鏡下接觸試蟲2個前足跗節(jié)各50 s;2)去除觸角(CA):用二氧化碳麻醉試蟲10 s,然后在體視鏡下剪去2個觸角;3)去除觸角+酸蝕前足跗節(jié)(CA+CP)。對照試蟲在麻醉后用水涂抹前足跗節(jié)。

1.2 供試植物

蘿卜(Raphanussativus)和豌豆(Pisumsativum)種子購自汕頭市澄海區(qū)金沙蔬菜研究所,種植溫度為(22±1)℃,濕度為(65±5)%,光周期為16 h/8 h。

1.3 芥子油苷粗提液制備

參考何洪巨等[18]的方法制備芥子油苷粗提液。稱取3 g蘿卜種子,在105 ℃下烘干1 h使黑芥子酶失活,然后用液氮研磨成粉。將粉末加到45 mL煮沸的甲醇(100%)中,80 ℃恒溫水浴15 min。提取液通過0.28 μm濾膜過濾,殘留物經(jīng)40 mL甲醇水溶液(80%)再次提取10 min,再通過0.28 μm濾膜過濾。將2次濾液混合,加入4 mL 0.4 mol·L-1醋酸鋇(以去除蛋白質(zhì)),反應(yīng)2 min后,7 000 r·min-1離心10 min,上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后濃縮至40 mL,所得即為芥子油苷粗提液。

1.4 不同含量芥子油苷粗提液對小菜蛾產(chǎn)卵選擇的影響

取芥子油苷粗提液,用甲醇配成含量分別為5%、1%、0.1%和0.01%的溶液。將2個培養(yǎng)皿(直徑 9 cm)用封口膜覆蓋后,在膜上涂抹500 μL芥子油苷粗提液(處理)或甲醇溶液(對照),對角放置于產(chǎn)卵籠(35 cm×24 cm×20 cm)[11]中,籠中間放置10%蜂蜜水(圖1)。在光期向籠內(nèi)放入20對2日齡小菜蛾成蟲,24 h后記錄培養(yǎng)皿封口膜上的卵量。產(chǎn)卵選擇指數(shù)=(處理封口膜上卵量-對照卵量)/(處理封口膜上卵量+對照卵量)。每個芥子油苷粗提液濃度重復(fù)4次(籠)。

圖1 小菜蛾對芥子油苷粗提液的產(chǎn)卵刺激反應(yīng)測定示意圖Fig.1 Determination of oviposition response of Plutella xylostella to crude extract of glucosinolates

1.5 酸蝕前足跗節(jié)或去除觸角對小菜蛾向芥子油苷產(chǎn)卵選擇性的影響

分別以封口膜和植物葉片為產(chǎn)卵介質(zhì)進(jìn)行測定。以封口膜為產(chǎn)卵介質(zhì)的測定同1.4節(jié)的試驗方法。在產(chǎn)卵籠內(nèi)對角放置的2個培養(yǎng)皿,分別在其封口膜上涂抹500 μL 1%芥子油苷粗提液和500 μL甲醇溶液(100%);向籠內(nèi)接入20對2日齡雌、雄小菜蛾,其中雌蛾設(shè)3個處理:酸蝕前足跗節(jié)(CP)、去除觸角(CA)、去除觸角+酸蝕前足跗節(jié)(CA+CP),以不進(jìn)行組織去除處理的雌蛾為對照。分別測定不同處理雌蛾的產(chǎn)卵選擇性并與對照雌蛾進(jìn)行比較。每個小菜蛾雌蛾處理重復(fù)測定8或15次(籠),CA+CP為15次重復(fù),其他處理為8次重復(fù)。

以植物葉片為產(chǎn)卵介質(zhì)的測定方法同上,只是產(chǎn)卵介質(zhì)改為新鮮的植物葉碟。產(chǎn)卵籠內(nèi)四角共放置4個培養(yǎng)皿,其中2個皿內(nèi)放置十字花科植物蘿卜的葉碟(直徑1 cm),另2個放置非十字花科植物豌豆的葉碟;皿內(nèi)底部墊有濕潤濾紙以保濕葉片;同種植物葉碟的培養(yǎng)皿在籠內(nèi)對角放置。分別測定不同處理雌蛾的產(chǎn)卵選擇性并與對照雌蛾進(jìn)行比較。每個雌蛾處理重復(fù)7次(籠)。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 35.0軟件利用單因素方差分析(One-way ANOVA)法分析小菜蛾在不同處理產(chǎn)卵選擇指數(shù)間的差異,用Tukey HSD 測驗法比較處理間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 芥子油苷對小菜蛾雌蛾產(chǎn)卵的刺激作用

分別用5%、1%、0.1%和0.01%芥子油苷粗提液測試小菜蛾雌蛾產(chǎn)卵偏好性。結(jié)果表明,不同含量的芥子油苷粗提液均能引起小菜蛾的產(chǎn)卵選擇偏好,并具有明顯的劑量效應(yīng),選擇偏好性隨著粗提液含量的增加而顯著增強(qiáng)(圖2)。說明芥子油苷粗提液對小菜蛾雌蛾產(chǎn)卵具有顯著的刺激作用。

圖2 芥子油苷粗提液對小菜蛾產(chǎn)卵選擇指數(shù)(A)和產(chǎn)卵量(B)的影響Fig.2 Effect of glucosinolate crude extract on oviposition preference index(A)and deposited eggs(B) on glucosinolates-treated and control parafilms by Plutella xylostella 不同小寫字母表示不同處理間差異顯著。 Different lowercase letters indicate significant difference among treatments.*P<0.05, **P<0.01, *** P<0.001。下同 The same as follows.

2.2 酸蝕前足跗節(jié)和去除觸角的小菜蛾對芥子油苷粗提液的產(chǎn)卵選擇性

與對照雌蛾(CK)相比,去除觸角+酸蝕前足跗節(jié)(CA+CP)、酸蝕前足跗節(jié)(CP)和去除觸角(CA)處理雌蛾對芥子油苷粗提液的產(chǎn)卵選擇指數(shù)分別降低97%、36%和22%(圖3-A),同時在2種介質(zhì)上的產(chǎn)卵總量顯著減少,幅度分別為84%、44%和72%(圖3-B)。其中,CA+CP處理雌蛾對芥子油苷的選擇性幾乎喪失,說明芥子油苷主要由前足跗節(jié)和觸角來感受。

圖3 酸蝕前足跗節(jié)及去除觸角后芥子油苷粗提液對小菜蛾產(chǎn)卵選擇性(A)和產(chǎn)卵量(B)的影響Fig.3 Effects of acid ablation of foreleg tarsus or/and removal of antennae on oviposition preference index(A)to glucosinolate crud extract and deposited eggs(B)on glucosinolates-treated and control parafilms by Plutella xylostella CK:對照Control;CA:去除觸角Removal of antennae;CP:酸蝕前足跗節(jié)Acid ablation of foreleg tarsus;CA+CP:去除觸角和酸蝕前足跗節(jié)Removal of antennae and acid ablation of foreleg tarsus. 下同The same as follows.

2.3 酸蝕前足跗節(jié)或/和去除觸角對小菜蛾寄主植物產(chǎn)卵選擇性的影響

從圖4可知:對照組小菜蛾(CK)對蘿卜葉片有強(qiáng)烈的產(chǎn)卵偏好(選擇指數(shù)為0.94),而去除觸角+酸蝕前足跗節(jié)(CA+CP)、酸蝕前足跗節(jié)(CP)和去除觸角(CA)的小菜蛾,對蘿卜葉片的產(chǎn)卵偏好均顯著降低,和對照相比其選擇指數(shù)分別降低55%、15%和23%(圖4-A);3個處理小菜蛾在2種葉片上的產(chǎn)卵總量分別較對照降低79%、45%和76%(圖4-B)。制作蘿卜葉碟時造成的葉片損傷可能導(dǎo)致少量芥子油苷的降解并釋放出ITC物質(zhì),因此,所得產(chǎn)卵選擇性可能還包含部分ITC的作用。

圖4 酸蝕前足跗節(jié)及去除觸角后蘿卜和豌豆葉片對小菜蛾產(chǎn)卵選擇指數(shù)(A)和產(chǎn)卵量(B)的影響Fig.4 Effects of acid ablation of foreleg tarsus or/and removal of antennae on oviposition preference index(A) to Raphanus sativus leaf disc and deposited eggs(B)on Raphanus sativus and Pisum sativum leaf discs by Plutella xylostella

3 討論

芥子油苷是十字花科植物的特征次生代謝物質(zhì),在對昆蟲取食及病原微生物侵染的化學(xué)防御中起重要作用。經(jīng)過長期的適應(yīng)性進(jìn)化,小菜蛾等十字花科植物專食性昆蟲不但克服了芥子油苷的毒性,而且雌成蟲還將芥子油苷及其揮發(fā)性降解產(chǎn)物ITC等作為重要的化學(xué)信號,幫助其對寄主植物的定向識別并產(chǎn)卵。在自然條件下,小菜蛾雌蛾主要通過ITC等嗅覺信號來尋找十字花科寄主植物[8],而當(dāng)降落到植物后則通過對芥子油苷的感受進(jìn)行寄主識別并產(chǎn)卵[7]。本研究證實(shí)了芥子油苷對小菜蛾雌蛾產(chǎn)卵的刺激作用,同時表明芥子油苷主要由觸角和前足跗節(jié)來感受,去除這2個器官后芥子油苷的刺激作用顯著降低。研究結(jié)果為進(jìn)一步解析小菜蛾識別寄主植物的化感分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

本研究中,利用芥子油苷粗提液進(jìn)行的產(chǎn)卵選擇性試驗表明,不同含量的粗提液均可吸引小菜蛾產(chǎn)卵,且吸引作用隨芥子油苷含量的增加而增強(qiáng),具有明顯的劑量效應(yīng);進(jìn)一步以植物葉片進(jìn)行的試驗也表明,小菜蛾更喜歡在蘿卜(十字花科植物)葉片而不是豌豆(非十字花科植物)葉片上產(chǎn)卵。本研究證實(shí)了芥子油苷對小菜蛾產(chǎn)卵的刺激作用,與前人的結(jié)果一致[19-20]。Reed等[19]用芥菜(十字花科植物)提取物進(jìn)行試驗,發(fā)現(xiàn)加有提取物的容器之中小菜蛾的產(chǎn)卵量更多,且在一定范圍內(nèi)產(chǎn)卵量與濃度成正比;喻國泉等[20]將不同濃度芥子油苷噴在非十字花科植物通菜上進(jìn)行產(chǎn)卵選擇測定,發(fā)現(xiàn)小菜蛾在通菜上的著卵量與所噴的芥子油苷粗提液的濃度呈正相關(guān)。芥子油苷在植物組織遭到機(jī)械損傷后會與黑芥子酶接觸并發(fā)生水解反應(yīng),形成ITC、硫氰酸酯、腈類或環(huán)硫腈、唑烷-2-硫酮等化合物[21],其中揮發(fā)性的ITC可以吸引小菜蛾雌蛾產(chǎn)卵[6,8]。由于黑芥子酶在100 ℃以上失活[22],因此我們在提取芥子油苷粗提液前,將蘿卜種子在105 ℃高溫處理1 h,避免了ITC的產(chǎn)生,所得結(jié)果排除了ITC的影響。

小菜蛾雌蛾在產(chǎn)卵時常伴有以前足和觸角碰觸葉片的行為[11-13],因此推測前足跗節(jié)和觸角可能參與了其對葉片上芥子油苷等信號化合物的感受。本研究發(fā)現(xiàn),前足跗節(jié)和觸角分別缺失后,小菜蛾雌蛾對十字花科植物蘿卜葉片的產(chǎn)卵偏好均顯著降低,說明前足跗節(jié)和觸角上均存在芥子油苷敏感的味覺感器。味覺感器主要為錐形感器、栓錐感器、毛形感器、刺形感器、板形感器等[23]。小菜蛾雌蛾觸角存在毛形感器、刺形感器和栓錐感器等8種感器[24]。魏輝等[15]利用掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn),小菜蛾前足跗節(jié)存在毛形感器、刺形感器和具彎端感器。此外,小菜蛾觸角和前足分別表達(dá)16和19個味覺受體(gustatory receptor,GR)基因[11]。在小菜蛾的觸角和前足跗節(jié)上,哪些感器及GR負(fù)責(zé)對芥子油苷的感受,有待進(jìn)一步研究。

本研究利用植物葉碟和封口膜2種產(chǎn)卵介質(zhì)的測試結(jié)果表明,觸角和前足跗節(jié)在芥子油苷引起的產(chǎn)卵選擇性中的作用大致相當(dāng)。當(dāng)觸角和跗節(jié)均去除后,2種產(chǎn)卵介質(zhì)所得結(jié)果有較大差異:葉碟法中雌蛾對蘿卜葉的產(chǎn)卵偏好性雖有顯著降低,但選擇指數(shù)仍近0.4;而封口膜涂抹芥子油苷粗提液的測定中,雌蛾對芥子油苷的產(chǎn)卵偏好性基本喪失。其主要原因可能是受蘿卜葉碟中ITC等吸引產(chǎn)卵或豌豆葉碟中某些驅(qū)避產(chǎn)卵氣味的影響。在自然狀態(tài)下,植物葉片會釋放多種揮發(fā)物;制備葉碟時造成的機(jī)械損傷也會誘導(dǎo)葉片釋放新的植物揮發(fā)物或使原有揮發(fā)物的釋放量增加,如蘿卜葉片的機(jī)械損傷會引起ITC的釋放并吸引小菜蛾產(chǎn)卵[6,8]。此外,除觸角和足外,在蛾類昆蟲對產(chǎn)卵介質(zhì)選擇時,產(chǎn)卵器通常也起到重要作用。Li等[25]發(fā)現(xiàn)煙青蟲產(chǎn)卵器上的毛形感器可以感受植物揮發(fā)物順-3-己烯丁酸酯,在選擇寄主植物產(chǎn)卵中起作用;我們對小菜蛾感受ITC的2個受體基因(OR35和OR49)的組織表達(dá)譜分析表明,這2個基因在產(chǎn)卵器中也有表達(dá)(未發(fā)表資料),也說明產(chǎn)卵器在小菜蛾產(chǎn)卵選擇性中起作用。

不同十字花科植物所含芥子油苷的種類及含量不同,同種植物不同組織間通常以種子中的含量較高[26-27],因此本研究以蘿卜種子的芥子油苷粗提液進(jìn)行相關(guān)試驗。蘿卜中含有8種芥子油苷組分,主要有4-甲基亞磺?；?3-丁烯基芥子油苷、2-羥基-3-丁烯基芥子油苷和1-甲氧基-3-吲哚甲基芥子油苷[26,28-29]。其中,2-羥基-3-丁烯基芥子油苷和1-甲氧吲哚基-3-甲基芥子油苷已被證實(shí)能刺激小菜蛾產(chǎn)卵[19],其他組分的作用尚不明確,需要進(jìn)一步研究。