王新玲,李書杰,林紅,裴明財,朱靖,韓兆玉

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院乳牛科學(xué)研究所,江蘇 南京 210095)

反芻動物的瘤胃中棲息著繁雜多樣的細菌、原蟲和厭氧真菌等,它們被統(tǒng)稱為瘤胃微生物。反芻動物自身與瘤胃微生物之間存在著極其復(fù)雜的相互作用。一方面,宿主遺傳信息決定瘤胃微生物結(jié)構(gòu)并為其提供生存和繁衍的環(huán)境條件;而另一方面,瘤胃微生物又可以消化機體攝入的一些物質(zhì),保證反芻動物個體獲取所需的營養(yǎng)[1]。宿主的健康和胃腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持很大一部分原因得益于瘤胃微生物群落的穩(wěn)定性,也就意味著微生物群的紊亂會導(dǎo)致瘤胃代謝異常進而誘發(fā)胃腸道疾病,如瘤胃酸中毒和腸道炎癥[2-3]。以往的研究表明,瘤胃中的某些微生物(如Prevotella和Ruminococcus等)與反芻動物飼料的利用率有著很強的相關(guān)性[4-5]。飼料利用率的提高不但減少了動物生產(chǎn)對環(huán)境的負面影響,而且大大提高了經(jīng)濟效益。因此,維持瘤胃微生物菌群穩(wěn)態(tài)是保障反芻動物宿主健康和高效生產(chǎn)的關(guān)鍵。

凹凸棒石是一種具有棒晶形貌及孔道結(jié)構(gòu)的鎂鋁硅酸鹽礦物。凹凸棒石由于其優(yōu)異的吸附能力被作為一種飼料添加物,其可吸附腸道致病菌、霉菌毒素等有毒有害物質(zhì),對動物機體的腹瀉以及胃腸疾病的防治起到關(guān)鍵作用[6-8]。在養(yǎng)殖業(yè)抗生素濫用導(dǎo)致耐藥病原菌增多、腸道微生物多樣性降低、動物免疫機能下降和藥物殘留等一系列安全問題的背景下,凹凸棒石可作為一種安全、便捷的飼料抗生素替代品。2013年,凹凸棒石已被我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部納入飼料原料[9]。已有研究者對凹凸棒石進行了大量改性研究,以進一步優(yōu)化其抗菌性能,便于更好地應(yīng)用于動物生產(chǎn)中[10]。常見改性方式有酸改性、熱改性和有機化改性等[10]。作為功能性飼料添加劑,凹凸棒石被廣泛應(yīng)用于豬、雞等單胃動物飼料生產(chǎn)中。Zhang等[11]報道,日糧添加凹凸棒石(2 000 mg·kg-1)可以增加斷奶仔豬的腸道絨毛高度,提高腸道完整性和屏障功能。Chen等[12]發(fā)現(xiàn)在日糧中添加凹凸棒石能夠改善肉雞早期腸道免疫功能和增強抗氧化機能。我們先前的體外研究結(jié)果顯示,熱改性的凹凸棒石和載鋅凹凸棒石可以改善瘤胃微生物的發(fā)酵,提高細菌多樣性,促進揮發(fā)性脂肪酸(VFA)的形成和氮的利用[13-14]。然而,凹凸棒石在反芻動物生產(chǎn)中的研究還鮮有報道。

本試驗利用在凹凸棒石棒狀形貌表面擔(dān)載具有較強抗菌活性的ZnO和季銨化改性的殼寡糖,進而制備得到一種安全、高效、廣譜和生物相容性好的殼寡糖/ZnO/凹凸棒石納米復(fù)合劑(又稱改性坡縷石modified palygorskite,MPal)[15]。先前研究結(jié)果已經(jīng)表明,飼糧中添加該復(fù)合劑有提高湖羊生長性能和屠宰性能的趨勢,并且能夠改善肉品質(zhì)[16]。在本試驗中,以湖羊作為研究對象,在日糧中添加此復(fù)合劑(500 mg·kg-1),再結(jié)合16S高通量測序和代謝組學(xué),分析研究殼寡糖/ZnO/凹凸棒石復(fù)合劑對湖羊瘤胃微生物菌群組成和代謝產(chǎn)物的影響,旨在為養(yǎng)殖業(yè)提供高效、安全的飼料添加劑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用殼寡糖/ZnO/凹凸棒石復(fù)合劑從江蘇神力特生物科技股份有限公司獲得,是以天然凹凸棒石為原料,采用“表面改性—電荷—抗菌因子—組裝—表面交聯(lián)”的綜合工藝制備而成。該復(fù)合劑的主要成分:凹凸棒石73%、氧化鋅10%、月桂酸甘油酯8%、殼寡糖9%。

1.2 動物飼養(yǎng)與試驗設(shè)計

試驗于江蘇省宿遷康喜肉羊養(yǎng)殖公司開展,選取48只60～70日齡的健康湖羊[(15±5)kg],隨機分為2組,每組24只,公母各半,6個重復(fù),每個重復(fù)4只。羊飼養(yǎng)在獨立的圍欄內(nèi),每天08:00和18:00喂養(yǎng)2次,自由飲水。其中對照組(Con)飼喂全混合配方顆粒料,復(fù)合劑組(MPal)于日糧中添加復(fù)合劑(500 mg·kg-1),預(yù)飼期7 d,正式試驗期80 d。每個重復(fù)隨機選取1只試驗湖羊,即最終對照組與復(fù)合劑組各隨機選取6只湖羊(公母各半)屠宰采樣。湖羊飼喂日糧的具體成分見表1。

表1 湖羊全混合日糧配方及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diet(dry matter basis)

1.3 樣品采集與制備

湖羊屠宰后,采集瘤胃液,用4層紗布過濾后于-80 ℃保存,用于后續(xù)微生物測序和代謝組學(xué)分析。

1.4 瘤胃液總菌DNA提取及Illumina MiSeq 16S rDNA微生物測序

利用E.Z.N.A.?Stool DNA Kit(D4015,Omega,USA)按照說明書進行提取瘤胃液中基因組總DNA。

為了進行細菌多樣性分析,以瘤胃液DNA樣本為模板,通過應(yīng)用引物對343F(5′-TACGGRAGGCAGCAG-3′)/798R(5′-AGGGTATCTAATCCT-3′)擴增16SrRNA基因V3—V4區(qū)域。用凝膠電泳觀察擴增子的質(zhì)量,經(jīng)純化后進行另一輪PCR擴增,然后進行定量分析。后續(xù)高通量測序工作由上海歐易生物科技有限公司完成。

使用Trimmomatic軟件對原始雙端序列去雜,并采用滑窗法檢查平均堿基質(zhì)量,當(dāng)質(zhì)量低于20時,截取前面高質(zhì)序列。去雜后的雙端序列利用FLASH軟件進行拼接。拼接參數(shù):overlap最小為10 bp、最大為200 bp、最大錯配率為20%。為保證結(jié)果的準(zhǔn)確性,可進行精準(zhǔn)去雜,去除含有模糊堿基(ambiguous)、單堿基高重復(fù)區(qū)(homologous)的序列以及長度過短的序列。精準(zhǔn)去雜參數(shù):去掉含有模糊堿基的序列,保留堿基質(zhì)量分?jǐn)?shù)(Q20)≥75%的序列。同時利用UCHIME檢測并去除序列中的嵌合體序列。測序數(shù)據(jù)進行預(yù)處理生成優(yōu)質(zhì)序列之后,采用Vsearch軟件分析序列的相似度,序列相似度大于或等于97%被歸為一個OTU單元(主操作分類單元)。使用QIIME軟件包挑選出各個OTU的代表序列,并將所有代表序列與數(shù)據(jù)庫進行比對注釋。通過數(shù)據(jù)平臺網(wǎng)站(https://www.microbiomeanalyst.ca/)對微生物數(shù)據(jù)進行后續(xù)分析。

1.5 瘤胃液代謝組學(xué)分析

將10 μL溶于甲醇中的2-氯-L-苯丙氨酸(0.3 mg·mL-1)作為內(nèi)標(biāo)物和80 μL樣品共同加入1.5 mL離心管中,然后在冷凍干燥器中干燥。向每個樣品中加入240 μL甲醇/乙腈混合物,冰水浴超聲波處理 5 min,然后4 ℃、12 000 r·min-1離心10 min。取上清液轉(zhuǎn)移到玻璃取樣瓶中,室溫真空干燥。在吡啶中添加80 μL 15 mg·mL-1甲氧基胺鹽酸鹽后渦旋2 min,37 ℃培養(yǎng)1.5 h。

瘤胃液的代謝物由上海鹿明生物技術(shù)有限公司采用GC/MS方法鑒定。樣品在安捷倫7890B氣相色譜系統(tǒng)和安捷倫5977A MSD系統(tǒng)(Agilent Technologies Inc.,USA)上進行分析。采用DB-5MS熔融石英毛細管柱(30 m × 0.25 mm × 0.25 μm,Agilent J & W Scientific,USA)分離衍生物。氦氣(>99.999%)作為載氣,以1 mL·min-1的恒定流速通過色譜柱。注射器溫度260 ℃,柱溫箱最終溫度305 ℃。質(zhì)譜條件:電子轟擊離子源(EI),離子源溫度230 ℃,四級桿溫度150 ℃,電子能量70 eV。掃描方式為全掃描模式(SCAN),質(zhì)量(m/z)掃描范圍50～500。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

微生物數(shù)據(jù)通過SPSS 20.0軟件進行分析,使用獨立樣本t檢驗分析瘤胃液菌群多樣性指數(shù),使用非參數(shù)Kruskal-Wallis檢驗微生物門、屬水平相對豐度的變化。利用PICRUSt軟件預(yù)測微生物的功能,通過iPath 3.0(https://pathways.embl.de)對預(yù)測的 KEGG orthology groups(KO)進行匯總分析,并將預(yù)測的功能可視化地呈現(xiàn)于代謝通路中。代謝組學(xué)數(shù)據(jù)經(jīng)MetaboAnalyst 在線網(wǎng)站(https://www.metaboanalyst.ca/)進行偏最小二乘判別分析(PLS-DA)和差異代謝物篩選,以錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)<0.05 和變量權(quán)重重要性排序(VIP)>1為篩選標(biāo)準(zhǔn)。Pearson相關(guān)性分析使用 Graphpad Prism 7.00(Graphpad Software,USA),分析0.05水平的差異顯著性(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 殼寡糖/ZnO/凹凸棒石復(fù)合劑對湖羊瘤胃菌群豐富度和多樣性的影響

如圖1-A所示,與對照組(Con)湖羊相比,復(fù)合劑組(MPal)湖羊的豐富度指數(shù)Chao1、Ace和多樣性指數(shù)Shannon均顯著升高(P<0.05)。此外,主坐標(biāo)分析(PCoA)結(jié)果也顯示,對照組與復(fù)合劑組微生物菌群明顯分開(P<0.05)(圖1-B)。

圖1 復(fù)合劑對湖羊瘤胃細菌多樣性的影響(A)及主坐標(biāo)分析(B)Fig.1 Effects of MPal supplementation on the diversity of ruminal bacterial communities(A) and principle-coordinate analysis(B)Con:對照組 Control group;MPal:殼寡糖/ZnO/凹凸棒石復(fù)合劑組Modified palygorskite group. *P<0.05. 下同The same as follows.

2.2 殼寡糖/ZnO/凹凸棒石復(fù)合劑對湖羊瘤胃微生物門、屬水平相對豐度的影響

如圖2所示,在門水平上,擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、纖維桿菌門(Fibrobacteres)和軟壁菌門(Tenericutes)是瘤胃微生物的優(yōu)勢菌門,復(fù)合劑飼喂后,瘤胃中厚壁菌門和纖維桿菌門的相對豐度顯著升高(P<0.05),擬桿菌門豐度有下調(diào)趨勢(P=0.065),而其他優(yōu)勢菌門均沒有發(fā)生變化。

圖2 MPal對湖羊瘤胃微生物門水平上的組成(A)和差異(B)影響Fig.2 Effects of MPal supplementation on the composition(A)and difference(B) of the bacterial phylum level in rumen of Hu sheep

在細菌聚類屬水平上,我們重點分析了豐度在前30的細菌屬(圖3)。其中,與對照組相比,復(fù)合劑組理研菌科RC9菌屬(Rikenellaceae RC9 gut group)、Ambiguoustaxa、纖維桿菌屬(Fibrobacter)、瘤胃球菌科UCG-002(Ruminococcaceae UCG-002)和瘤胃球菌科UCG-014(Ruminococcaceae UCG-014)的相對豐度顯著升高(P<0.05);而普雷沃氏菌屬1(Prevotella1)、新月形單胞菌屬1(Selenomonas1)、普雷沃氏菌科YAB2003菌屬(Prevotellaceae YAB 2003 group)和Eubacteriumruminantiumgroup的相對豐度顯著降低(P<0.05)。

圖3 MPal對湖羊瘤胃相對豐度Top30細菌屬水平的影響Fig.3 Effects of MPal supplementation on ruminal microbial community of the genus level(Top30)

2.3 湖羊瘤胃微生物PICRUSt功能預(yù)測

通過PICRUSt預(yù)測瘤胃菌群代謝功能,并利用iPath數(shù)據(jù)庫將分析的結(jié)果進行整合(圖4)。結(jié)果顯示,與對照組相比,復(fù)合劑提高了細胞運動、信號傳導(dǎo)、轉(zhuǎn)運催化和分泌系統(tǒng)等相關(guān)途徑的豐度,同時降低了核酸代謝和感染性疾病等相關(guān)途徑的豐度(P<0.05)。

圖4 湖羊瘤胃微生物基因富集KEGG通路PICRUSt功能預(yù)測Fig.4 The KEGG enrichment analysis on PICRUSt-predicted metabolic pathways of ruminal microbiota in Hu sheep

2.4 殼寡糖/ZnO/凹凸棒石復(fù)合劑對湖羊瘤胃代謝產(chǎn)物的影響

我們進一步通過代謝組學(xué)分析試驗組與對照組瘤胃液代謝產(chǎn)物的差異。結(jié)果顯示:瘤胃液中共檢測出288種代謝物,主要分為氨基酸類、有機酸類、脂肪酸類、胺類、脂類、糖類等。如圖5所示,偏最小二乘判別分析(partial least squares discriminant analysis,PLS-DA)結(jié)果顯示:2組間代謝產(chǎn)物可以被顯著區(qū)分開,說明2組間代謝產(chǎn)物存在差異。通過統(tǒng)計分析及PLS-DA獲得VIP值,以FDR<0.05和VIP>1為篩選標(biāo)準(zhǔn),共篩選出73種差異代謝產(chǎn)物。表2所示為排名前30的差異代謝物,主要是脂肪酸類、有機酸類、糖類、固醇類等。與對照組湖羊相比,復(fù)合劑組湖羊瘤胃中丙酸、磷酸葡萄糖酸、白藜蘆醇和丁香酸等含量顯著升高,而與脂質(zhì)代謝有關(guān)的亞油酸、花生四烯酸、膽固醇、膽汁酸、棕櫚酸、2-單硬脂酸酯、1-單十七烷基甘油酯等含量顯著降低(FDR<0.05)。這表明飼喂復(fù)合劑對瘤胃脂質(zhì)代謝具有重要的調(diào)節(jié)作用。

圖5 湖羊瘤胃代謝物的偏最小二乘判別分析(PLS-DA)Fig.5 Partial least squares discriminant analysis(PLS-DA) of ruminal metabolites of Hu sheep

表2 湖羊瘤胃差異代謝物Top30Table 2 List of ruminal fluid metabolites that showed Top30 significant difference between Con and MPal groups

2.5 瘤胃液差異微生物菌屬與差異代謝物相關(guān)性分析

對瘤胃變化的微生物菌屬與差異代謝產(chǎn)物進行了皮爾森相關(guān)性分析(圖6)。結(jié)果顯示,纖維桿菌屬(Fibrobacter)、理研菌科RC9菌屬(Rikenellaceae RC9 gut group)和瘤胃球菌科UCG-014(Ruminococcaceae UCG-014)與瘤胃丙酸含量均呈現(xiàn)顯著正相關(guān)(P<0.05)。亞油酸、花生四烯酸、膽固醇等代謝物與普雷沃氏菌屬1(Prevotella1)呈顯著正相關(guān),而其與瘤胃球菌科 UCG-014(Ruminococcaceae UCG-014)呈顯著負相關(guān)(P<0.05)。

圖6 湖羊瘤胃差異菌屬與差異代謝物相關(guān)性分析Fig.6 Pearson correlation analysis of significantly changed bacterial genera and metabolites in rumen 紅色、綠色和白色分別代表顯著正相關(guān)(P<0.05)、顯著負相關(guān)(P<0.05)和不相關(guān)(P>0.05)。The red,green and white color represent significant positive correlation(P<0.05),significant negative correlation(P<0.05),and no correlation(P>0.05),respectively.

3 討論

3.1 殼寡糖/ZnO/凹凸棒石復(fù)合劑對湖羊瘤胃微生物區(qū)系的影響

瘤胃微生物中的細菌種類繁多,各種細菌協(xié)同作用將飼料降解轉(zhuǎn)化為短鏈脂肪酸等代謝產(chǎn)物,為宿主提供充足的能量和養(yǎng)分。腸道菌群的多樣性是保障其完善功能的前提。腸道菌群多樣性與宿主對病原微生物的抵御能力成正相關(guān)[17]。在本試驗中,2組微生物菌群顯著不同,這表明飼喂復(fù)合劑改變了湖羊瘤胃微生物菌群結(jié)構(gòu)。與對照組相比,復(fù)合劑組瘤胃微生物的豐富度指數(shù)(Chao1、Ace)和多樣性指數(shù)(Shannon)均顯著升高。這表明飼喂復(fù)合劑增加了湖羊瘤胃微生物多樣性。湖羊瘤胃微生物主要以擬桿菌門和厚壁菌門為主[18]。本試驗結(jié)果顯示,湖羊瘤胃中相對豐度大于1%的菌門主要有擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門、纖維桿菌門和軟壁菌門。與對照組相比,復(fù)合劑組瘤胃中厚壁菌門和纖維桿菌門的相對豐度顯著升高,擬桿菌門相對豐度有下調(diào)趨勢。厚壁菌門和纖維桿菌門的主要作用為分解纖維類物質(zhì),對植物性纖維轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性脂肪酸(乙酸、丙酸等)發(fā)揮重要作用[19-20]。而擬桿菌門主要參與瘤胃中的蛋白質(zhì)和非纖維植物多糖的降解[21]。

在本試驗中,普雷沃氏菌屬1是瘤胃液中豐度最高的屬,與先前的研究相一致[22]。分析Top30的屬水平相對豐度發(fā)現(xiàn),與對照組相比,復(fù)合劑組瘤胃中理研菌科RC9菌屬、纖維桿菌屬、瘤胃球菌科UCG-002和瘤胃球菌科UCG-014的相對豐度顯著升高;而普雷沃氏菌屬1、新月形單胞菌屬1和普雷沃氏菌科YAB2003菌屬的相對豐度顯著降低。理研菌科RC9菌屬能夠促進纖維素的降解,其豐度與日糧纖維含量呈正相關(guān)[23]。瘤胃球菌科UCG-002和瘤胃球菌科UCG-014都屬于瘤胃球菌科。已有研究指出,瘤胃菌科與瘤胃中纖維素類物質(zhì)的降解密切聯(lián)系,當(dāng)飼喂高纖維飼糧時其豐度會大大提高[24-25]。同樣,纖維桿菌屬也是一種重要的纖維降解菌。普雷沃氏菌屬1能夠參與飼糧蛋白質(zhì)的降解,其相對豐度與飼糧蛋白質(zhì)水平相關(guān)[26]。這些結(jié)果表明,殼寡糖/ZnO/凹凸棒石復(fù)合劑增加了湖羊瘤胃中纖維降解菌的豐度,而降低了蛋白降解菌的豐度。

3.2 殼寡糖/ZnO/凹凸棒石復(fù)合劑對湖羊瘤胃代謝組學(xué)的影響

胃腸道微生物結(jié)構(gòu)與其代謝產(chǎn)物直接關(guān)聯(lián)。本試驗中,我們通過代謝組學(xué)分析了復(fù)合劑對湖羊瘤胃內(nèi)容物代謝組學(xué)的影響。主成分分析結(jié)果顯示,對照組與復(fù)合劑組的代謝物組成明顯區(qū)分開,表明復(fù)合劑顯著改變了瘤胃代謝產(chǎn)物組成。差異代謝物結(jié)果顯示,與對照組相比,復(fù)合劑組湖羊瘤胃中丙酸和磷酸葡萄糖酸含量顯著升高。瘤胃微生物通過將宿主自身不能消化的植物性飼料降解,產(chǎn)生大量的VFA為宿主提供養(yǎng)分。成年反芻動物大約70%的能量來源于VFA提供,而相較于乙酸和丁酸,瘤胃丙酸發(fā)酵對機體的供能效率最高[27]。因此,促進瘤胃中丙酸的發(fā)酵有助于提高反芻動物的飼料轉(zhuǎn)化利用率。Zeng等[14]通過體外發(fā)酵試驗發(fā)現(xiàn),熱改性凹凸棒石處理能夠促進瘤胃中乙酸和丙酸的產(chǎn)生。張心壯等[28]研究發(fā)現(xiàn),飼糧添加丙酸鹽能夠促進犢牛瘤胃發(fā)酵,提高瘤胃內(nèi)丙酸的含量,并且能夠促進瘤胃上皮細胞發(fā)育和提高犢牛生長性能。對瘤胃差異菌屬和差異代謝物進行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),纖維桿菌屬、理研菌科RC9菌屬和瘤胃球菌科UCG-014與瘤胃丙酸含量均呈現(xiàn)顯著正相關(guān)。這些結(jié)果表明,飼喂復(fù)合劑改變了瘤胃微生物組成,從而促進了纖維類物質(zhì)的分解和丙酸的生成。

此外,飼喂復(fù)合劑顯著降低了湖羊瘤胃中與脂質(zhì)代謝相關(guān)的代謝物含量,包括亞油酸、花生四烯酸、膽固醇、膽汁酸、棕櫚酸、2-單硬脂酸酯、1-單十七烷基甘油酯等。高濃度的多不飽和脂肪酸具有毒性,其與瘤胃微生物的細胞壁形成復(fù)合物從而抑制瘤胃微生物的生長[29]。瘤胃微生物能夠通過氫化作用將不飽和脂肪酸降解脫毒,瘤胃球菌科和纖維桿菌屬等細菌與氫化產(chǎn)物存在關(guān)聯(lián)[25,30-31]。Hu等[32]研究發(fā)現(xiàn)腸道中普氏菌屬的含量與甘油三酯和總膽固醇的含量成正相關(guān)。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),亞油酸、花生四烯酸、膽固醇等代謝物與普雷沃氏菌屬1顯著正相關(guān),而其與瘤胃球菌科UCG-014顯著負相關(guān)。因此,日糧添加復(fù)合劑影響了湖羊瘤胃脂質(zhì)代謝,但其具體調(diào)節(jié)機制還有待進一步研究。

綜上,日糧中添加殼寡糖/ZnO/凹凸棒石復(fù)合劑能夠提高瘤胃菌群豐富度和多樣性水平,有利于湖羊的胃腸道健康,同時對瘤胃菌群豐度具有調(diào)節(jié)作用。復(fù)合劑促進了瘤胃中丙酸的生成,并降低了瘤胃中多種不飽和脂肪酸的含量,對湖羊瘤胃脂質(zhì)代謝起到重要的調(diào)節(jié)作用。湖羊瘤胃差異微生物與差異代謝產(chǎn)物具有較強的正/負相關(guān)關(guān)系。