侯國珺,張民揚(yáng),汪晶,朱偉云

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院/國家動(dòng)物消化道營(yíng)養(yǎng)國際聯(lián)合研究中心/動(dòng)物科學(xué)類國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心,江蘇 南京 210095)

早期斷奶使仔豬從母乳中獲得的被動(dòng)免疫逐漸喪失,容易受到致病菌的感染,從而易引發(fā)仔豬腹瀉[1]。在這一時(shí)期通過飲食干預(yù)有助于緩解仔豬的斷奶應(yīng)激。本課題組研制的殼聚糖螯合鋅由殼聚糖與無機(jī)鋅螯合而成。本課題組前期研究表明,殼聚糖螯合鋅可以改善斷奶仔豬小腸的形態(tài)結(jié)構(gòu),提高抗氧化及屏障功能,降低斷奶仔豬腹瀉發(fā)生率[2]。殼聚糖是甲殼素脫乙?；蟮漠a(chǎn)物,是自然界中一種堿性多糖[3]。由于殼聚糖可以緩解機(jī)體的氧化損傷,提高免疫功能,且有很好的抑菌效果,故作為飼料添加劑廣泛應(yīng)用于動(dòng)物生產(chǎn)中[4]。鋅作為機(jī)體必需的一種微量元素,參與體內(nèi)多種酶的合成。鋅具有增強(qiáng)上皮細(xì)胞屏障,調(diào)節(jié)微生物組成及促進(jìn)腸道發(fā)育等功能[5]。在日糧中添加無機(jī)鋅有助于仔豬的生長(zhǎng)發(fā)育,降低腹瀉率,但是較高濃度的鋅離子會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞毒性。連續(xù)添加藥理劑量(2 000～3 000 mg·kg-1Zn)的氧化鋅21 d后其毒性就會(huì)表現(xiàn)出來,包括仔豬平均日增重降低,腸道中沙門氏菌增多,腸黏膜產(chǎn)生炎癥反應(yīng)等[6-7]。此外,高劑量的無機(jī)鋅被動(dòng)物攝入后,大約80%不會(huì)被動(dòng)物利用,而是排出體外導(dǎo)致環(huán)境污染和鋅源浪費(fèi)。因此,尋找綠色高效的無機(jī)鋅替代品十分必要。殼聚糖作為一種絡(luò)合劑,通過氮、氧或它們的組合與機(jī)體正常生長(zhǎng)所需的金屬離子結(jié)合后,可能留下一些潛在的供體原子,這些供體原子增強(qiáng)了生物學(xué)活性,比如使螯合物具有更強(qiáng)的抗菌性能[8]。然而,殼聚糖螯合鋅對(duì)于盲腸的作用卻不清楚。盲腸作為大腸的一部分,是微生物聚集和發(fā)酵的重要場(chǎng)所。微生物利用腸道中的底物發(fā)酵生成一些有益的代謝產(chǎn)物,有助于改善腸道屏障、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答及抑制病原菌增殖,對(duì)仔豬的生長(zhǎng)發(fā)育十分重要[9]。因此,本試驗(yàn)選用盲腸作為研究對(duì)象,探究殼聚糖螯合鋅對(duì)斷奶仔豬盲腸形態(tài)、菌群組成、代謝產(chǎn)物以及黏膜炎癥反應(yīng)的影響,旨在為納米殼聚糖螯合鋅在斷奶仔豬生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用殼聚糖螯合鋅(直徑50～150 nm)是由本課題組制備的一種分別含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%～10%的鋅和50%～60%殼聚糖的配合物(專利號(hào):201910039700.4),所用殼聚糖(CS)脫乙酰度大于95%,相對(duì)分子質(zhì)量80 000～90 000,購于海得貝海洋生物工程有限公司。氧化鋅(ZnO)購于中國醫(yī)藥集團(tuán)。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取48頭21日齡的“杜長(zhǎng)大”(杜洛克×長(zhǎng)白豬×大約克夏)斷奶仔豬,初始體重平均為6.21 kg。將仔豬隨機(jī)分為4組,每組4個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)3頭。具體分組為對(duì)照組(CON)、氧化鋅組(ZnO)、殼聚糖螯合鋅組(CS-Zn)和殼聚糖組(CS)。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧;氧化鋅組在基礎(chǔ)日糧中添加鋅含量為1 600 mg·kg-1的氧化鋅;殼聚糖螯合鋅組在基礎(chǔ)日糧中添加殼聚糖螯合鋅,其中鋅含量為100 mg·kg-1,殼聚糖含量為766 mg·kg-1;殼聚糖組在基礎(chǔ)日糧中添加766 mg·kg-1殼聚糖。試驗(yàn)期間,仔豬不使用抗生素,自由采食和飲水。于試驗(yàn)15 d時(shí),每組隨機(jī)選取6頭仔豬(包含所有重復(fù)),每頭口服含1010CFU的大腸桿菌K88培養(yǎng)液進(jìn)行攻毒試驗(yàn)。攻毒后48 h,屠宰取樣。將仔豬解剖分離盲腸,采集盲腸食糜,存于無菌凍存管中,保存在-80 ℃液氮中。用無菌載玻片刮取盲腸黏膜于凍存管中并置于液氮中保存?；A(chǔ)日糧配方參照NRC(2012)豬營(yíng)養(yǎng)需要進(jìn)行配制,飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。本試驗(yàn)在江蘇省徐州市正大集團(tuán)豬場(chǎng)進(jìn)行,試驗(yàn)前對(duì)豬舍環(huán)境及器具進(jìn)行消毒。試驗(yàn)期間嚴(yán)格遵守豬場(chǎng)飼養(yǎng)管理制度。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet %

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 盲腸形態(tài)學(xué)分析取出固定24 h后的盲腸組織,制作HE染色切片。主要步驟:先將固定的盲腸組織脫水,然后進(jìn)行石蠟包埋,將包埋后的組織切成5 μm左右的切片,最后進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色,制作HE染色切片。將制作好的切片在光學(xué)顯微鏡下觀察盲腸的形態(tài)。每個(gè)切片選取至少6個(gè)視野清晰、結(jié)構(gòu)完整的視野進(jìn)行盲腸隱窩深度和黏膜厚度測(cè)定。參照Hayakawa等[10]的方法,對(duì)仔豬盲腸形態(tài)進(jìn)行病理評(píng)分。

1.3.2 盲腸食糜微生物DNA的提取及16S rRNA的測(cè)序參照Zoetendal 等[11]所描述的bead-beating法,稱取0.2 g的盲腸食糜并提取細(xì)菌總DNA,然后用Nanodrop 2000分光光度計(jì)(Thermo Scientific Inc.,美國)檢測(cè)DNA的濃度和純度。當(dāng)D260/D280為1.8～2.0,表明DNA相對(duì)較純,符合試驗(yàn)要求。使用引物對(duì)338F/806R(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′/5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因的V3—V4區(qū)域。PCR程序:95 ℃ 3 min;95 ℃ 30 s,53 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s,29個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。用20 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物,再用AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒(Axygen Biosciences,美國)純化PCR產(chǎn)物。最后,按照標(biāo)準(zhǔn)方案在Illumina HiSeq平臺(tái)上對(duì)純化的文庫進(jìn)行配對(duì)末端的高通量測(cè)序[12]。

1.3.3 盲腸食糜細(xì)菌代謝產(chǎn)物及pH值的測(cè)定參照Zhou等[13]的方法,使用氣相色譜儀(Shimadzu GC-14A,日本島津)測(cè)定盲腸內(nèi)容物中乙酸、丙酸、丁酸等短鏈脂肪酸的含量。使用乳酸試劑盒(南京建成生物工程研究所)測(cè)定盲腸食糜中乳酸含量。采樣過程中,收集盲腸食糜后立即用pH計(jì)測(cè)定盲腸食糜pH值。

1.3.4 盲腸黏膜細(xì)胞因子濃度測(cè)定從液氮中取出0.1 g盲腸黏膜,加入900 μL磷酸鹽緩沖液(PBS),用勻漿機(jī)粉碎黏膜組織,然后4 ℃、12 000 r·min-1離心15 min。取上清液,用ELISA試劑盒(南京建成生物工程研究所)測(cè)定盲腸黏膜中白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素10(IL-10)、髓過氧化物酶(MPO)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、干擾素 γ(IFN-γ)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 殼聚糖螯合鋅對(duì)大腸桿菌K88攻毒斷奶仔豬盲腸組織形態(tài)的影響

如圖1所示:對(duì)照組仔豬盲腸形態(tài)異常,損傷較為嚴(yán)重;氧化鋅組和殼聚糖組仔豬盲腸形態(tài)得到一定改善,表現(xiàn)為輕度或中度異常;而殼聚糖螯合鋅組仔豬盲腸形態(tài)得到明顯改善,黏膜結(jié)構(gòu)完整,損傷較輕。此外,如表2所示:與對(duì)照組相比,氧化鋅和殼聚糖螯合鋅處理顯著降低了仔豬盲腸隱窩深度(P<0.05)。盲腸病理評(píng)分結(jié)果顯示,殼聚糖螯合鋅組和殼聚糖組仔豬盲腸病理評(píng)分顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。

圖1 盲腸組織切片的HE染色Fig.1 The HE staining of cecum slice CON:對(duì)照組(基礎(chǔ)日糧)Control group(basal diet);ZnO:氧化鋅組 Zinc oxide group(Zn 1 600 mg·kg-1);CS-Zn:殼聚糖螯合鋅組Chitosan-chelated zinc group(CS 766 mg·kg-1,Zn 1 600 mg·kg-1);CS:殼聚糖組 Chitosan group(CS 766 mg·kg-1). 下同The same as follows.

表2 殼聚糖螯合鋅對(duì)大腸桿菌K88攻毒斷奶仔豬盲腸形態(tài)的影響Table 2 Effects of chitosan-chelated zinc on cecum morphology in weaned piglets challenged with Escherichia coli K88

2.2 殼聚糖螯合鋅對(duì)大腸桿菌K88攻毒斷奶仔豬盲腸微生物多樣性的影響

16S rRNA測(cè)序長(zhǎng)度為PE300,將測(cè)序得到的雙端序列數(shù)據(jù)根據(jù)PE reads間的overlap關(guān)系,將成對(duì)的reads拼接成一條序列,同時(shí)對(duì)reads的質(zhì)量和拼接效果進(jìn)行質(zhì)控過濾,根據(jù)序列首尾兩端的條碼和引物序列區(qū)分樣品得到有效序列,并校正序列方向,得到優(yōu)化后的有效序列1 411 779個(gè),平均每個(gè)樣本有效序列為58 824個(gè)。如表3所示:4組間的α多樣性指數(shù)包括Shannon、Simpson、ACE和Chao指數(shù)均沒有顯著變化?；赽ray-curtis距離進(jìn)行盲腸微生物的主坐標(biāo)分析(PCoA分析),并用ANOSIM進(jìn)行組間差異檢驗(yàn),結(jié)果(圖2)顯示,4個(gè)不同處理組盲腸微生物顯示出明顯的聚類分開(P=0.028)。

表3 殼聚糖螯合鋅對(duì)大腸桿菌K88攻毒斷奶仔豬盲腸微生物多樣性的影響Table 3 Effects of chitosan-chelated zinc on microbial diversity of cecum in weaned

圖2 盲腸微生物的主坐標(biāo)分析(PCoA分析)Fig.2 Principal coordinate analysis(PCoA)of cecum microbiota

2.3 殼聚糖螯合鋅對(duì)大腸桿菌K88攻毒斷奶仔豬盲腸微生物組成的影響

如圖3-A所示:在盲腸食糜微生物門水平上,厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)為優(yōu)勢(shì)菌門,占微生物總數(shù)的90%以上。如圖3-B所示:與對(duì)照組相比,殼聚糖組和殼聚糖螯合鋅組中仔豬盲腸變形菌門的相對(duì)豐度均顯著降低(P<0.05)。

圖3 殼聚糖螯合鋅對(duì)大腸桿菌K88攻毒斷奶仔豬盲腸微生物門水平(A)和變形菌門(B)的影響Fig.3 Effect of chitosan-chelated zinc on the phylum level(A)and Proteobacteria(B)of cecum microbiota in weaned piglets challenged with E.coli K88不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。Different small letters indicate significant differences at 0.05 level. The same belows.

如圖4-A所示:在屬水平上,將在所有樣本中豐度比例大于1%的菌屬進(jìn)行歸類,結(jié)果顯示乳桿菌屬(Lactobacillus)、巨球型菌屬(Megasphaera)、普氏菌屬9(Prevotella9)、擬普雷沃氏菌屬(Alloprevotella)、鏈球菌屬(Streptococcus)是主要的優(yōu)勢(shì)菌屬。如圖4-B所示:與對(duì)照組相比,殼聚糖螯合鋅組盲腸食糜中乳桿菌屬和普氏菌屬9的相對(duì)豐度顯著提高(P<0.05),鏈球菌屬和布勞特氏菌屬(Blautia)的相對(duì)豐度顯著降低。與氧化鋅組相比,殼聚糖螯合鋅組中鏈球菌屬的相對(duì)豐度顯著降低(P<0.05)。

圖4 殼聚糖螯合鋅對(duì)大腸桿菌K88攻毒斷奶仔豬盲腸微生物屬水平組成(A) 和主要菌屬(B)的影響Fig.4 Effect of chitosan-chelated zinc on genus level composition(A)and main bacterial genus(B) of cecum microbiota in weaned piglets challenged with E.coli K88

2.4 殼聚糖螯合鋅對(duì)大腸桿菌K88攻毒斷奶仔豬盲腸內(nèi)容物pH和微生物代謝產(chǎn)物的影響

如表4所示:與其他3組相比,殼聚糖螯合鋅組仔豬的盲腸食糜pH值顯著降低(P<0.05)。與對(duì)照組相比,殼聚糖螯合鋅處理顯著提高了盲腸食糜中乙酸、丁酸、總短鏈脂肪酸及乳酸的水平(P<0.05)。其中,丁酸、總短鏈脂肪酸和乳酸的濃度在殼聚糖螯合鋅和殼聚糖組間無顯著差異(P>0.05)。

表4 殼聚糖螯合鋅對(duì)大腸桿菌K88攻毒斷奶仔豬盲腸微生物代謝產(chǎn)物的影響Table 4 Effects of chitosan-chelated zinc on cecum microbial metabolites in weaned piglets

2.5 殼聚糖螯合鋅對(duì)大腸桿菌K88攻毒斷奶仔豬盲腸黏膜髓過氧化物酶和細(xì)胞因子水平的影響

如圖5所示:與對(duì)照組相比,氧化鋅組、殼聚糖螯合鋅組以及殼聚糖組盲腸黏膜中髓過氧化物酶(MPO)、白細(xì)胞介素1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)的水平均顯著降低(P<0.05)。與氧化鋅組和殼聚糖組相比,殼聚糖螯合鋅組中IL-1β水平顯著降低(P<0.05)。與其他3組相比,殼聚糖螯合鋅組中干擾素γ(INF-γ)水平顯著降低(P<0.05)。白細(xì)胞介素10(IL-10)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)在4組間沒有顯著差異(P>0.05)。

圖5 殼聚糖螯合鋅對(duì)大腸桿菌K88攻毒斷奶仔豬盲腸黏膜MPO和細(xì)胞因子水平的影響Fig.5 Effect of chitosan-chelated zinc on MPO and cytokines level in cecum mucosa of weaned piglets challenged with E.coli K88 MPO:髓過氧化物酶 Myeloperoxidase;IL-1β:白細(xì)胞介素1β Interleukin-1β;IL-10:白細(xì)胞介素10 Interleukin-10;TNF-α:腫瘤壞死因子α Tumour necrosis factor-α;IFN-γ:干擾素γ Interferon-γ;TGF-β:轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β Transforming growth factor-β.

3 討論

在動(dòng)物生產(chǎn)中,高劑量氧化鋅的使用存在許多副作用。根據(jù)中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部的規(guī)定,仔豬斷奶后2周內(nèi)飼料中鋅的最高含量為 1 600 mg·kg-1。減少斷奶仔豬飼料中鋅的使用量是本試驗(yàn)的目的之一。為了探究CS-Zn是否能發(fā)揮與高劑量氧化鋅類似的效果,替代高劑量氧化鋅的使用,我們?cè)O(shè)置了鋅含量為 1 600 mg·kg-1的ZnO組。有研究表明,斷奶仔豬日糧中添加100 mg·kg-1納米鋅替代高劑量氧化鋅具有較好的效果[14-15]。在日糧中添加殼聚糖螯合鋅(鋅含量100 mg·kg-1,非納米顆粒形式)可以提高斷奶仔豬的抗氧化能力和免疫功能[16],提供有益的抗凋亡作用和維持?jǐn)嗄套胸i的腸屏障功能以及黏膜免疫功能[17],降低斷奶仔豬腹瀉率和提高生長(zhǎng)性能[18]。因此,本研究中,在日糧中添加鋅含量為100 mg·kg-1的納米殼聚糖螯合鋅(CS-Zn),以研究CS-Zn對(duì)高劑量氧化鋅的替代效果。此外,根據(jù)CS-Zn生產(chǎn)工藝,在日糧中添加CS-Zn使鋅含量為100 mg·kg-1,此時(shí)日糧中殼聚糖的含量為766 mg·kg-1。早期斷奶容易誘發(fā)仔豬斷奶應(yīng)激綜合征,導(dǎo)致腹瀉。我們之前的研究發(fā)現(xiàn),在飼糧中添加殼聚糖螯合鋅可以改善大腸桿菌K88攻毒斷奶仔豬的生長(zhǎng)性能,降低腹瀉的發(fā)生率[2],此外在大鼠試驗(yàn)中,也證明了殼聚糖螯合鋅可以改善大腸桿菌攻毒大鼠的腸道微生物組成和腸道功能[19-20]。因此,我們利用大腸桿菌K88攻毒的斷奶仔豬腹瀉模型,研究殼聚糖螯合鋅對(duì)仔豬盲腸微生物組成和腸道功能的影響。同時(shí),研究其作用效果和高劑量氧化鋅間的區(qū)別與聯(lián)系,以評(píng)估殼聚糖螯合鋅對(duì)高劑量氧化鋅的替代作用。

正常的腸道黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)是保障仔豬腸道健康和發(fā)揮腸道功能的重要基礎(chǔ)。盲腸形態(tài)結(jié)果顯示,對(duì)照組仔豬由于大腸桿菌K88攻毒導(dǎo)致盲腸形態(tài)明顯損傷,而殼聚糖螯合鋅處理明顯改善了仔豬盲腸黏膜形態(tài),表明日糧中添加殼聚糖螯合鋅在一定程度上緩解了大腸桿菌K88攻毒造成的斷奶仔豬腸黏膜損傷。此外,和對(duì)照組相比,殼聚糖螯合鋅處理顯著降低了仔豬盲腸的隱窩深度,且與高劑量氧化鋅處理效果相似。通常情況下,腸道隱窩深度和腸黏膜中細(xì)胞的生成率密切相關(guān)。隱窩深度增加表明隱窩基部細(xì)胞不斷分化成腸上皮細(xì)胞,加快組織周轉(zhuǎn),提高營(yíng)養(yǎng)素以及能量的消耗,影響仔豬腸道正常生理功能[21-22]。而隱窩深度降低則表明隱窩基部細(xì)胞轉(zhuǎn)化成腸上皮細(xì)胞的速率變慢,細(xì)胞成熟度提高,分泌能力增強(qiáng)[23]。因此,殼聚糖螯合鋅處理改善了大腸桿菌K88攻毒斷奶仔豬的盲腸形態(tài)結(jié)構(gòu),有利于維持仔豬盲腸的正常腸道功能。

仔豬腸道形態(tài)損傷會(huì)使腸道通透性提高,導(dǎo)致外界病原體更容易入侵,造成腸道功能和腸道微生物群落的紊亂。因此,我們進(jìn)一步對(duì)盲腸菌群組成進(jìn)行分析。盲腸菌群α多樣性指數(shù)結(jié)果顯示,4組仔豬盲腸菌群的α多樣性指數(shù)無顯著差異。因此,本試驗(yàn)結(jié)果表明,殼聚糖螯合鋅對(duì)盲腸微生物群落種類未造成顯著影響,但可能改變了某些微生物的豐度。β多樣性結(jié)果顯示各組之間微生物組成總體上存在差異。表明殼聚糖螯合鋅對(duì)盲腸微生物組成有調(diào)節(jié)作用。門水平上的微生物組成分析結(jié)果顯示厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門為盲腸中的優(yōu)勢(shì)菌門。與對(duì)照組相比,殼聚糖螯合鋅組和殼聚糖組中變形菌門的相對(duì)豐度顯著降低。變形菌門包括多種潛在致病菌,如大腸桿菌、沙門氏菌、幽門螺桿菌等。變形菌門豐度的增多會(huì)破壞腸道菌群的穩(wěn)態(tài),引起腸道功能的失調(diào),導(dǎo)致宿主代謝紊亂和腸道炎癥反應(yīng)[24],因此,飼糧中添加殼聚糖螯合鋅可以降低變形菌門的相對(duì)豐度從而有助于維持盲腸菌群的穩(wěn)態(tài)。

屬水平上微生物組成的分析結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,日糧中添加殼聚糖螯合鋅可以顯著提高乳桿菌屬和普雷沃氏菌屬的相對(duì)豐度,并降低鏈球菌屬和布勞特氏菌屬的相對(duì)豐度。氧化鋅組布勞特氏菌屬的相對(duì)豐度也顯著降低,但乳桿菌屬、普雷沃氏菌屬和鏈球菌屬的相對(duì)豐度在氧化鋅組以及殼聚糖組中沒有顯著變化。高劑量鋅對(duì)仔豬盲腸中乳桿菌屬?zèng)]有顯著影響[25],我們的結(jié)果與之相一致。殼聚糖對(duì)盲腸中乳桿菌屬豐度的影響較低[26],這也許與盲腸中菌群結(jié)構(gòu)更復(fù)雜,影響因素更多有關(guān)。乳桿菌屬是盲腸食糜中的主要菌屬,它可以通過爭(zhēng)奪營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來抑制條件致病菌生長(zhǎng),維持腸道微生物的平衡,通過促進(jìn)緊密連接蛋白的表達(dá),增強(qiáng)腸道屏障功能,并且能夠促進(jìn)腸黏膜免疫系統(tǒng)的成熟,激發(fā)局部免疫調(diào)節(jié)活性[27]。因此,殼聚糖螯合鋅組中乳桿菌屬豐度的增加有助于改善腸道健康狀況。普雷沃氏菌是豬腸道中一種主要的膳食纖維發(fā)酵菌,以往的相關(guān)性分析結(jié)果顯示,普雷沃氏菌9的豐度與腸道中短鏈脂肪酸的濃度呈顯著正相關(guān)[28],并且與斷奶后腹瀉的仔豬相比,健康仔豬糞便微生物群中普雷沃氏菌科的豐度更高[29]。本研究中,殼聚糖螯合鋅顯著上調(diào)了普雷沃氏菌屬的相對(duì)豐度,并且普雷沃氏菌屬的相對(duì)豐度在殼聚糖組也有上升趨勢(shì)。因此,推測(cè)殼聚糖為菌群發(fā)酵提供所需的碳水化合物,刺激普雷沃氏菌屬豐度上升,促進(jìn)碳水化合物的分解,提高腸道免疫功能,減少腹瀉的發(fā)生。此外,鏈球菌是一種致斷奶仔豬發(fā)病的機(jī)會(huì)致病菌[30]。因此,本試驗(yàn)中殼聚糖螯合鋅組的鏈球菌的減少可能表明殼聚糖螯合鋅有助于降低腸道疾病發(fā)生率,維持腸道健康。布勞特氏菌屬在近期的研究中被發(fā)現(xiàn)具有促進(jìn)短鏈脂肪酸產(chǎn)生等維持腸道穩(wěn)態(tài)活性的作用,具有潛在益生菌特性[31]。布勞特氏菌屬在腸應(yīng)激綜合征和高血脂患者的糞便中豐度增加[32-33]。此外,在一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn),仔豬糞便中布勞特氏菌屬與血清中促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和 TNF-α 呈正相關(guān)[34]。同種菌屬中的不同物種功能還可能存在一定差異,因此,在本研究中,殼聚糖螯合鋅處理造成布勞特氏菌屬的降低對(duì)仔豬的健康是否有益還需要我們后續(xù)進(jìn)一步的研究。綜上所述,殼聚糖螯合鋅調(diào)節(jié)了大腸桿菌K88攻毒斷奶仔豬的盲腸菌群結(jié)構(gòu),使?jié)撛谟幸婢南鄬?duì)豐度上升,潛在致病菌相對(duì)豐度下降,從而有利于維持腸道良好的微生態(tài)環(huán)境。

我們進(jìn)一步分析了盲腸中微生物代謝產(chǎn)物的變化,結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,殼聚糖螯合鋅組仔豬盲腸內(nèi)乙酸、丁酸、總SCFA和乳酸的濃度顯著增加。同時(shí),殼聚糖組盲腸食糜中丁酸、總短鏈脂肪酸和乳酸的濃度顯著提高,高劑量的氧化鋅處理提高了盲腸食糜中丁酸和總短鏈脂肪酸的濃度。這些結(jié)果表明與殼聚糖和高劑量的氧化鋅處理相比,殼聚糖螯合鋅組的盲腸微生物具有更強(qiáng)的發(fā)酵能力。以往研究表明,普雷沃氏菌9是短鏈脂肪酸產(chǎn)生菌,它的豐度與腸道中乙酸、丙酸和丁酸的濃度呈顯著正相關(guān)[13],因此,殼聚糖螯合鋅組中普雷沃氏菌9豐度的提高或許是其短鏈脂肪酸濃度增加的原因之一。乙酸被證明是一種維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)并具有抗炎功能的代謝產(chǎn)物,而丁酸有利于調(diào)節(jié)腸道通透性[35]。短鏈脂肪酸特別是丁酸可以抑制脂多糖誘導(dǎo)的核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)炎癥信號(hào)通路,從而緩解腸道的炎癥反應(yīng)[36]。此外,殼聚糖螯合鋅和殼聚糖組盲腸食糜中的乳酸濃度顯著增加,殼聚糖螯合鋅和殼聚糖組乳桿菌屬豐度增加是導(dǎo)致乳酸濃度提高的原因。隨著乳酸濃度的變化,盲腸內(nèi)容物pH值也隨之下降。在盲腸中,較低的pH值更適宜乳酸桿菌等有益菌的生長(zhǎng),且可以抑制潛在致病菌的生長(zhǎng)和定殖[37]。因此,殼聚糖螯合鋅可以提高大腸桿菌攻毒仔豬盲腸食糜中SCFA和乳酸的濃度,降低盲腸pH值,有助于維持盲腸內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。

腸道微生物群落失衡,機(jī)會(huì)致病菌豐度增加,其釋放的腸毒素使得腸上皮通透性提高,破壞腸道屏障功能,打破促炎因子與抗炎因子的平衡,促炎因子釋放增多,導(dǎo)致腸黏膜的局部炎癥反應(yīng)[38]。本研究結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,殼聚糖螯合鋅組盲腸黏膜中促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和INF-γ水平顯著降低,這與前人報(bào)道的殼聚糖鋅具有抑制促炎細(xì)胞因子釋放的結(jié)果一致[39]。在動(dòng)物發(fā)生應(yīng)激或組織器官處于炎癥狀態(tài)時(shí),中性粒細(xì)胞聚集到炎癥部位并釋放MPO,增強(qiáng)機(jī)體免疫反應(yīng)[40]。在本試驗(yàn)中,殼聚糖螯合鋅處理下調(diào)了盲腸黏膜中的MPO水平,表明腸道炎癥反應(yīng)受到了抑制,這可能是由于殼聚糖螯合鋅改善了斷奶仔豬盲腸的微生物組成,乳酸菌等有益菌的比例增加,調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的丁酸等短鏈脂肪酸濃度提高,對(duì)腸道起到一定的保護(hù)作用,從而緩解了腸道黏膜的炎癥反應(yīng)。因此,飼糧中添加殼聚糖螯合鋅可以減輕大腸桿菌K88攻毒仔豬盲腸黏膜的炎癥反應(yīng),保護(hù)腸道健康。

綜上所述,殼聚糖螯合鋅可以改善大腸桿菌K88攻毒斷奶仔豬的盲腸形態(tài)結(jié)構(gòu),調(diào)節(jié)盲腸微生物群落組成,通過提高潛在有益菌的相對(duì)豐度,抑制潛在致病菌的生長(zhǎng),改善了腸道微生態(tài)環(huán)境。同時(shí),殼聚糖螯合鋅提高了盲腸中短鏈脂肪酸及乳酸的濃度,有助于調(diào)節(jié)腸道免疫功能,抑制腸道炎癥反應(yīng),對(duì)于維持腸道健康具有積極的作用。