陳 鑫，李錦峰，陳艷炯，郭昱成

1.西安交通大學醫(yī)學部基礎醫(yī)學院病原生物學與免疫學系，陜西西安 710061；西安交通大學口腔醫(yī)院：2.口腔醫(yī)學檢測中心；3.頜面外科；4.正畸科，陜西西安 710004

口腔鱗狀細胞癌(OSCC)是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率占頭頸部惡性腫瘤的90%，其5年生存率相對較低，約為50%。導致OSCC的危險因素包括吸煙、大量飲酒、口腔衛(wèi)生差、不健康飲食和微生物感染[1]。由于OSCC的全球患病率增加，其發(fā)生機制還未清楚，因此需要進行深入的多因素分析以了解OSCC發(fā)生的潛在機制，以及與其他風險因素(尤其是生物病原體)的可能關聯(lián)[2]?？谇恢写嬖?00多種微生物，其最主要的種類是假絲酵母菌、擬桿菌、變形桿菌和放線菌[3]。假絲酵母菌是一種二倍體無性酵母菌，屬于機會致病菌，其導致的口腔疾病包括口腔扁平苔蘚、口腔念珠菌病和纖維上皮息肉[4]。正常情況下，微生物在宿主中平衡存在，這種平衡的破壞可引起宿主免疫反應，從而可能導致腫瘤發(fā)生[5]。越來越多的證據(jù)表明，長期暴露于微生物和(或)其產(chǎn)物(內(nèi)毒素、蛋白酶、膠原酶、纖維蛋白溶酶、磷脂酶等)可對宿主細胞造成損害，并可能誘導突變，影響細胞的信號通路、增殖和凋亡。本研究旨在了解從OSCC患者口腔中分離出的假絲酵母菌的生物膜形成能力及其毒力因子(蛋白酶、磷脂酶、溶血性和酯酶)活性。比較OSCC和健康人假絲酵母菌菌株之間毒力因子的差異，進一步揭示假絲酵母菌在OSCC中的致病機制，為OSCC的診斷、治療奠定基礎。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2018年1月至2020年10月就診于西安交通大學口腔醫(yī)院的100例OSCC患者，無手術、放化療及其他輔助治療史，所有病例均經(jīng)組織病理學確診，作為OSCC組。同時收集該院體檢的年齡與性別相匹配的100例健康人作為對照組。OSCC組年齡為31～85歲，平均(60.2±11.3)歲，對照組年齡為26～78歲，平均(59.1±12.4)歲。排除標準：最近使用含有抗真菌劑的漱口水或藥物的患者、人類免疫缺陷病毒(HIV)陽性患者、糖尿病患者。

1.2儀器與試劑 恒溫培養(yǎng)箱(天津泰斯特)、酶免分析儀(深圳雷杜)。葡萄糖、結(jié)晶紫、亞甲藍購于天津科密歐公司。腦心浸出液肉湯、PBS緩沖液、卵黃乳液、牛血清清蛋白購于青島高科海博。MH瓊脂、麥氏比濁管購于溫州康泰公司。蛋白胨、瓊脂粉購于北京奧博星。CaCl2、K2HPO4、吐溫80購于天津天力公司。酵母膏粉購于杭州天和公司。血瓊脂培養(yǎng)基購于安圖生物。標準菌株白念珠菌ATCC 90028、近平滑念珠菌ATCC 22019購于溫州康泰公司。使用文獻[6]中的方法配制牛血清清蛋白培養(yǎng)基、卵黃瓊脂培養(yǎng)基[7]、吐溫80瓊脂培養(yǎng)基[8]及0.5%的結(jié)晶紫儲存液。

1.3方法

1.3.1菌株分離鑒定 所有研究對象標本采集前漱口，采用無菌拭子收集標本，OSCC組收集病灶區(qū)域標本，對照組采集頰黏膜標本。標本接種于沙保弱瓊脂培養(yǎng)基，于25～30 ℃孵育5～7 d，對分離的可疑菌落采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間生物質(zhì)譜儀(德國布魯克)進行鑒定。

1.3.24種毒力因子活性檢測 配制濃度為1麥氏濁度的菌懸液，取10 μL滴于牛血清清蛋白瓊脂培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基倒置放入培養(yǎng)箱，經(jīng)35 ℃、4 d培養(yǎng)檢測磷脂酶活性。取10 μL滴于卵黃瓊脂培養(yǎng)基，經(jīng)35 ℃、7 d培養(yǎng)檢測蛋白酶活性。取10 μL滴于吐溫80瓊脂培養(yǎng)基，經(jīng)35 ℃、5 d培養(yǎng)檢測酯酶活性[9]。取10 μL滴于血瓊脂培養(yǎng)基，經(jīng)35 ℃、48 h培養(yǎng)檢測溶血活性。試驗以白念珠菌ATCC 90028測定結(jié)果作為陽性對照，近平滑念珠菌ATCC 22019測定結(jié)果作為陰性對照。結(jié)果判讀：達到培養(yǎng)時間后，平板上菌落周圍會出現(xiàn)沉淀圈或透明圈，量取菌落直徑與沉淀區(qū)直徑，并將其計算為菌落直徑與沉淀區(qū)直徑之比。酶活性的測定是基于酶活性指數(shù)(EAI),根據(jù)EAI指數(shù)確定活動范圍：EAI≤0.99表示產(chǎn)此活性，EAI=1,表示不產(chǎn)此活性[10-11]。

1.3.3生物膜檢測 采用結(jié)晶紫染色法檢測其生物膜的形成。將培養(yǎng)液加入96孔板中,使用酶標儀測定570 nm波長的吸光度 (A570)，吸光度大于臨界值的樣品為陽性，吸光度小于或等于臨界值的樣品為陰性[12]。試驗以不含微生物的無菌BHIB作為陰性對照，所有試驗重復3次。

1.4統(tǒng)計學處理 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。采用LSD-t檢驗和單因素方差分析(ANOVA)比較OSCC組與對照組及不同分離菌種屬之間毒力因子的差異。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1假絲酵母菌菌種檢出情況分布 OSCC組標本分離出假絲酵母菌82株，明顯高于對照組的24株，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。OSCC組和對照組分離率最高的均為白假絲酵母菌。OSCC組白假絲酵母菌59株(72.0%)、熱帶假絲酵母菌8株(9.7%)、近平滑假絲酵母菌7株(8.5%)、克柔假絲酵母菌5株(6.1%)、杜氏假絲酵母菌3株(3.7%)，且存在9株混合感染，包括2株白假絲酵母菌和熱帶假絲酵母菌混合感染、2株白假絲酵母菌和近平滑假絲酵母菌混合感染、2例近平滑假絲酵母菌和熱帶假絲酵母菌混合感染、3株杜氏假絲酵母菌和熱帶假絲酵母菌混合感染。對照組檢出白假絲酵母菌[20株(83.3%)]和克柔假絲酵母菌[4株(16.7%)]。

2.2兩組分離株毒力因子的比較 OSCC組不同假絲酵母菌均產(chǎn)生蛋白酶、酯酶、溶血活性及生物膜。兩組標本分離的假絲酵母菌產(chǎn)生的磷脂酶活性、蛋白酶活性、酯酶活性、溶血活性及生物膜形成能力進行比較，結(jié)果顯示：OSCC組磷脂酶活性平均EAI(0.685)低于對照組(0.852),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；OSCC組蛋白酶活性平均EAI(0.733)低于對照組(0.883),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；OSCC組溶血活性平均EAI(0.585)低于對照組(0.674),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；OSCC組酯酶活性平均EAI(0.714)與對照組(0.708)比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；OSCC組吸光度(2.032)明顯比對照組(1.017)低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1～5。

表1 兩組不同假絲酵母菌磷脂酶活性比較[n(%)]

表2 兩組不同假絲酵母菌蛋白酶活性比較[n(%)]

表3 兩組不同假絲酵母菌酯酶活性比較[n(%)]

表4 兩組不同假絲酵母菌溶血活性比較[n(%)]

表5 兩組不同假絲酵母菌生物膜比較[n(%)]

2.3不同分離株之間毒力因子比較 在所研究的假絲酵母菌中杜氏假絲酵母菌沒有磷脂酶活性，將OSCC組中分離出的5種假絲酵母菌毒力因子進行比較，不同菌種間的磷脂酶活性、蛋白酶活性、酯酶活性、溶血活性及生物膜形成能力比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表6。

表6 OSCC組中不同假絲酵母菌毒力因子比較(平均EAI/吸光度)

3 討 論

本研究結(jié)果顯示，OSCC患者口腔中定植的酵母菌具有多樣性，其中白假絲酵母菌的定植率最高，其他依次是熱帶假絲酵母菌及近平滑假絲酵母菌。白假絲酵母菌的存在被認為是OSCC的重要危險因素，但也需要關注非白假絲酵母菌對疾病的影響。白假絲酵母菌是一種機會致病菌，可通過攻擊宿主細胞導致疾病的發(fā)生，其在某些條件下會引起口腔疾病，尤其是在機體抵抗力下降時[13]。酵母菌致病性被認為是一個多因素過程，其可通過毒力因子的侵襲機制參與感染的發(fā)生和發(fā)展[14]。

酵母菌的致病性可歸因于各種毒力因子，如可黏附宿主表面的磷脂酶、蛋白酶、酯酶，其黏附宿主的過程可調(diào)節(jié)酵母菌在宿主中的定植，同時這些毒力因子的分泌導致黏膜屏障受損，有助于感染及侵襲的發(fā)生[15]。在本研究中，幾乎所有的OSCC患者口腔中酵母菌都具有磷脂酶、蛋白酶活性，且此兩種酶活性高于健康人，對照組分離菌株中檢測出的蛋白酶活性和磷脂酶活性明顯低于OSCC組，表明這些因子在疾病的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。本研究結(jié)果顯示，OSCC組酯酶活性平均EAI與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。OSCC組溶血活性平均EAI低于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，可能是不同酵母菌產(chǎn)生的溶血素酶導致從紅細胞釋放的鐵所致。

酵母菌從孢子到菌絲的形態(tài)轉(zhuǎn)換被認為是侵入宿主細胞的毒力因素。白假絲酵母菌產(chǎn)生的生物膜促進了菌絲的廣泛生長，并成為侵入性酵母菌感染的來源。微生物黏附是生物膜形成的第一步，酵母菌特別是白假絲酵母菌，通過與上皮細胞的互相作用在疾病的發(fā)展中起重要作用，從而導致上皮細胞侵襲性表現(xiàn)[16]。當白假絲酵母菌產(chǎn)生生物膜時，很有可能發(fā)生上述作用。

綜上所述，OSCC患者口腔分離的假絲酵母菌菌株具多樣性，且分離株的磷脂酶活性、蛋白酶活性、溶血活性、生物膜形成能力均高于健康人，為酵母菌的致病性與疾病損害嚴重程度之間的聯(lián)系提供了證據(jù)。本研究提示酵母菌在OSCC的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用，但酵母菌的具體致癌分子機制尚需要進一步研究，以明確宿主與酵母菌之間的多重復雜作用，為其進一步診斷、治療奠定了基礎。