張 琳，鄧貴華，楊 亮，肖大立

(1.廣東省婦幼保健院藥學(xué)部，廣東 廣州 510010；2.廣東省婦幼保健院醫(yī)務(wù)科，廣東 廣州 510010)

宮頸癌是我國中青年女性第二大常見惡性腫瘤，近些年的發(fā)病率和病死率均呈顯著上升趨勢[1-2]。目前，手術(shù)及放化療是宮頸癌的主要治療方法，但是其有效性卻不盡人意。因此，找到更安全、更有效的方法是當(dāng)前治療宮頸癌亟待解決的問題。苦木堿F(Picrasidine F)是一種二聚體β-卡巴林生物堿，從苦木(Picrasmaquassioides)的根莖中分離出來。越來越多的研究報道苦木中的生物堿類成分具有抗腫瘤的作用，如苦木生物堿類成分抑制肝癌細(xì)胞的增殖[3]。但是苦木生物堿類成分抗腫瘤的分子機(jī)制仍有待深入研究。微小核糖核酸(microRNAs，miRNA)是內(nèi)源性單鏈小RNA，可通過翻譯后修飾在人類腫瘤的發(fā)展和進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[4-5]。已有研究報道m(xù)iRNA與宮頸癌細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲密切相關(guān)，被認(rèn)為是宮頸癌診斷、治療和預(yù)后評估的新靶點[6-7]。既往研究發(fā)現(xiàn)，miR-331-3p對調(diào)控宮頸癌細(xì)胞增殖有顯著影響，可能具有抗癌作用[8]。而且近年來研究報道顯示miRNA廣泛參與中藥的抗腫瘤作用過程中，如青藤堿通過調(diào)控miR-324-5p抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲和遷移[9]。然而，miR-331-3p是否參與苦木堿F對宮頸癌的作用尚不清楚。因此，本研究旨在從miR-331-3p水平深入探討苦木堿F對宮頸癌細(xì)胞增殖和凋亡中的作用及其可能的分子機(jī)制，為臨床治療宮頸癌提供新的靶點。

與苦木堿 F 0 μg/ml組比較，*P<0.01；與苦木堿 F 6.25 μg/ml組比較，#P<0.01；與苦木堿 F 12.5 μg/ml組比較，$P<0.01

與苦木堿F 0 μg/ml組比較，*P<0.01；與苦木堿F 6.25 μg/ml組比較，#P<0.01；與苦木堿F 12.5 μg/ml組比較，$P<0.01

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑 主要試劑：人宮頸癌HeLa細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫；RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；MTT細(xì)胞檢測試劑盒購自上海碧云天生物有限公司；Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；Trizol試劑、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司；PrimeScript RT-PCR試劑盒購自Takara公司；SYBR Green試劑盒購自Takara公司；引物均由Takara公司設(shè)計合成；BCA蛋白含量測定試劑盒購自美國Thermo Scientific公司；β-catenin、Bcl-2、Bax、β-actin抗體購自美國Abcam公司；雙熒光素酶報告基因載體pGL3以及雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒均購自美國Promega公司；miR-331-3p mimic、NC mimic、miR-331-3p inhibitor、NC inhibitor、蛋白酶體活化復(fù)合物3(Proteasome activator complex subunit 3,PSME3)-siRNA、NC-siRNA購自華大基因。

主要儀器：實時熒光定量PCR儀購自德國Eppendorf公司；Thermo Varioskan LUX多功能酶標(biāo)儀購自美國的Thermo Fisher Scientific公司；CO2培養(yǎng)箱購自美國SHELDON；倒置普通光學(xué)顯微鏡購自日本OLYMPUS公司；BD FACS Calibur流式細(xì)胞儀購自美國BD公司；免疫印記系統(tǒng)和凝膠成像分析系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 藥物配備：本研究根據(jù)前人研究方法[10]從苦木Picrasmaquassioides Bennet的根中分離得到β-卡巴林生物堿成分苦木堿F。經(jīng)1H-NMR和HPLC分析，該化合物的純度>98%。

1.2.2 HeLa細(xì)胞培養(yǎng)：人宮頸癌細(xì)胞株HeLa接種于RPMI 1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、100 IU/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素)中，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。每3 d進(jìn)行1/2換液，待細(xì)胞融合到70%左右進(jìn)行轉(zhuǎn)染。選取對數(shù)生長期的HeLa細(xì)胞接種到96孔板中，使用Lipofectamine 2000TM試劑將miR-331-3p mimic、NC mimic、miR-331-3p inhibitor、NC inhibitor、PSME3-siRNA轉(zhuǎn)染到HeLa細(xì)胞中，37 ℃孵育24 h，轉(zhuǎn)染后收集各組細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.2.3 MTT實驗：轉(zhuǎn)染24 h后，將HeLa細(xì)胞以每孔1×104個細(xì)胞接種于96孔板中。分別于24、48、72 h收取細(xì)胞，于每個孔中加入25 μl 1 mg/ml MTT溶液。繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸掉培養(yǎng)基上清液，向每個孔中加入100 μl DMSO。10 min后待晶體充分溶解后，用酶標(biāo)儀測量490 nm處的吸光度。

1.2.4 RT-qPCR：根據(jù)Trizol試劑說明書從細(xì)胞中提取總RNA，然后使用Prime Script RT試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。當(dāng)檢測miRNA表達(dá)時，使用Taq Man microRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒根據(jù)其說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用SYBR Green進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件如下：預(yù)變性95 ℃30 s；95 ℃變性5 s；在60 ℃退火30 s，共35個循環(huán)。使用2-△△Ct方法計算相對基因表達(dá)。采用GAPDH和U6分別作為mRNA和miRNA的內(nèi)參。基因引物序列如下：PSME3 正向:5’-TCTGACATGAATCTCCCAGTCC-3’,反向:5’-CTCATCCAACCTTCGCTTCTTAT-3’;GAPDH 正向:5’-CAGCAAGAGCACAAGAGGAA-3’,反向:5’-ATGGTACATGACAAGGTGCGG-3’;miR-331-3p 正向:5’-GCGCTAGGTATGGTCCCAG-3’,反向:5’-GTG CAG GGT CCG AGG T-3’;U6 正向:5’-GCT TCG GCA GCA CAT ATACTA AAA T-3’,反向:5’-CGC TTC ACG AAT TTG CGTGTC AT-3’。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)：轉(zhuǎn)染到細(xì)胞后，各組細(xì)胞用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化，制備單細(xì)胞懸液，PBS洗滌3次。將細(xì)胞重懸于預(yù)冷的1×Binding Buffer中，反復(fù)吹打細(xì)胞，并用移液器充分混合使細(xì)胞密度約為1×106個/ml。加入5 μl Annexin V-FITC，輕輕混合，室溫避光反應(yīng)15 min。細(xì)胞重懸于0.5 ml預(yù)冷的1×Binding Buffer中。加入碘化丙啶(PI)10 μl，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.2.6 雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)：將野生和突變的PSME3的3’UTRs(PSME3 3’UTR-WT或3’UTR-MUT)分別插入pGL3報告基因載體的下游。然后將帶有miR-331-3p mimic和PSME3-pGL3報告基因的載體共轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，在37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h。然后收集細(xì)胞，利用雙熒光素酶報告基因進(jìn)行裂解和分析，將F/R作為各種細(xì)胞的相對熒光素酶活性值。

1.2.7 Western blot：收集各組轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞，加入RIPA細(xì)胞裂解液，冰上提取細(xì)胞總蛋白。然后，采用BCA蛋白檢測試劑盒檢測蛋白濃度。將蛋白質(zhì)樣品在沸水浴中加熱變性。將等量變性后的蛋白樣品加到上樣孔，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。蛋白質(zhì)分離后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上進(jìn)行電轉(zhuǎn)移。將轉(zhuǎn)化的膜用5%脫脂牛奶封閉液室溫封閉1 h。稀釋一抗(1∶1000)并在4 ℃下孵育過夜。然后稀釋二抗(1∶3000)于室溫下孵育30 min，然后用TBST洗滌3次。用化學(xué)發(fā)光法檢測蛋白，采用Image J分析軟件計算各組細(xì)胞蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 苦木堿F對宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖和凋亡的影響 通過6.25、12.5、25 μg/ml苦木堿F處理宮頸癌HeLa細(xì)胞后，檢測苦木堿F對HeLa細(xì)胞增殖和凋亡的影響，結(jié)果顯示與對照組比較，6.25、12.5、25 μg/ml苦木堿F組的細(xì)胞活力均顯著降低，細(xì)胞凋亡率均顯著升高，隨著濃度的增加，細(xì)胞存活率逐漸降低，提示苦木堿F呈濃度依賴性抑制HeLa細(xì)胞的存活(P<0.01)，見圖1。

2.2 苦木堿F上調(diào)HeLa細(xì)胞miR-331-3p的表達(dá) 通過使用6.25、12.5、25 μg/ml苦木堿F處理HeLa細(xì)胞24 h后，RT-qPCR實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，6.25、12.5、25 μg/ml苦木堿F組中HeLa細(xì)胞miR-331-3p水平均顯著升高，并且呈濃度依賴性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖2。結(jié)合上述結(jié)果得知25 μg/ml苦木堿F更加顯著抑制HeLa細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并且上調(diào)miR-331-3p的表達(dá)，因此進(jìn)一步選擇25 μg/ml苦木堿F用于后續(xù)實驗。

2.3 苦木堿F通過調(diào)控miR-331-3p對HeLa細(xì)胞增殖和凋亡的影響 結(jié)果顯示，與NC mimic組比較，miR-331-3p mimic組中miR-331-3p的水平較顯著升高，細(xì)胞存活率降低，細(xì)胞凋亡率升高，Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低，Bax蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)；而miR-331-3p inhibitor+苦木堿F組細(xì)胞存活率較NC inhibitor+苦木堿F組顯著升高，細(xì)胞凋亡率降低，Bcl-2蛋白表達(dá)水平升高，Bax蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)，見圖3。以上結(jié)果表明過表達(dá)miR-331-3p可以抑制HeLa細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而miR-331-3p inhibitor可以逆轉(zhuǎn)苦木堿F對宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖和凋亡的作用。

與NC mimic組比較，*P<0.05；與NC inhibitor組比較，#P<0.05

2.4 miR-331-3p靶向PSME3并抑制其表達(dá) 通過Targetscan數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-331-3p與PSME3-3’UTR的靶向結(jié)合位點。進(jìn)一步通過雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)驗證，結(jié)果顯示與NC mimic+WT-PSME3-3’UTR組相比，miR-331-3p mimic+WT-PSME3-3’UTR組熒光素酶活性顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與NC mimic+MUT-PSME3-3’UTR組相比，miR-331-3p mimic+MUT-PSME3-3’UTR組熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與NC mimic組比較，miR-331-3p mimic組中PSME3 mRNA水平顯著降低；與NC inhibitor組比較，miR-331-3p inhibitor組中PSME3 mRNA水平顯著升高(P<0.05)，見圖4。

與NC mimic組比較，*P<0.05；與NC inhibitor組比較，#P<0.05

2.5 PSME3在苦木堿F介導(dǎo)miR-331-3p影響HeLa細(xì)胞增殖和凋亡中的潛在作用 與苦木堿F+NC inhibitor+NC-siRNA組比較，苦木堿F+miR-331-3p inhibitor+NC-siRNA組中細(xì)胞存活率升高，細(xì)胞凋亡率降低，β-catenin和Bcl-2蛋白表達(dá)水平升高，Bax蛋白表達(dá)降低；與苦木堿F+miR-331-3p inhibitor+NC-siRNA組比較，苦木堿F+miR-331-3p inhibitor+PSME3-siRNA組中細(xì)胞存活率降低，細(xì)胞凋亡率升高，β-catenin和Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低，Bax蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)，見圖5。

與苦木堿F+NC inhibitor+NC-siRNA組比較，*P<0.05；與苦木堿F+miR-331-3p inhibitor+NC-siRNA組比較，#P<0.05

3 討 論

宮頸癌是一種常見的婦科惡性腫瘤，是世界各國特別是發(fā)展中國家婦女癌癥相關(guān)死亡的主要原因。因此，需要篩選宮頸癌發(fā)生發(fā)展的有效治療藥物，探討其分子機(jī)制。本研究探討苦木堿F對宮頸癌細(xì)胞的抗腫瘤作用。我們發(fā)現(xiàn)苦木堿F能抑制HeLa細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。在HeLa細(xì)胞中，苦木堿F可以上調(diào)miR-331-3p的表達(dá)水平。此外，在HeLa細(xì)胞中，低表達(dá)miR-331-3p可逆轉(zhuǎn)苦木堿F對HeLa細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控作用。苦木堿F通過miR-331-3p/PSME3調(diào)控HeLa細(xì)胞的增殖及凋亡?？嗄緣AF是一種從苦木根莖中分離得到的β-卡巴林生物堿成分?？嗄局械纳飰A類成分具有一定的抗腫瘤活性。Yamashita等[11]報道一種苦木生物堿成分能顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖。石國華等[12]研究發(fā)現(xiàn)3個二聚β-卡巴林生物堿在抑制胃癌MKN-28以及黑色素瘤B-16細(xì)胞中起著重要作用。與這些研究結(jié)果相似，本實驗的結(jié)果顯示苦木堿F能抑制HeLa細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。表明苦木堿F對宮頸癌的治療可能有一定的抗腫瘤作用。

近年來，越來越多的證據(jù)表明miRNAs在宮頸癌中異常表達(dá)參與調(diào)控腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移，如miR-203、miR-41、miR-221[13-15]，提示miRNAs可能作為新的預(yù)后標(biāo)志物或?qū)m頸癌患者的前瞻性藥物治療靶點。研究報道，miR-331-3p在多種癌癥中具有重要作用[16-17]。在宮頸癌中，有研究報道m(xù)iR-331-3p抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)G2/M期阻滯和凋亡[8]。本研究發(fā)現(xiàn)苦木堿F使miR-331-3p表達(dá)水平升高。miR-331-3p過表達(dá)能抑制HeLa細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡，這與之前的研究結(jié)果一致。miR-331-3p抑制劑可逆轉(zhuǎn)苦木堿F對HeLa細(xì)胞增殖抑制和凋亡促進(jìn)作用。這些結(jié)果表明苦木堿F抗腫瘤作用可能是通過上調(diào)miR-331-3p介導(dǎo)的。國內(nèi)外大量研究表明，miRNA在轉(zhuǎn)錄后通過負(fù)向調(diào)控靶基因的穩(wěn)定性或翻譯效率來調(diào)控基因表達(dá)，從而在生物體中發(fā)揮致癌或抑癌作用[18-19]。研究[20]發(fā)現(xiàn)miR-331-3p通過靶向人表皮生長因子受體2參與結(jié)直腸癌細(xì)胞生長調(diào)控。研究報道m(xù)iR-331-3p通過靶向髓系/淋巴/混合系白血病易位基因10在肺癌細(xì)胞增殖、上皮-間充質(zhì)表型轉(zhuǎn)換介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移和侵襲中發(fā)揮抑制作用[21]。本實驗的研究結(jié)果顯示PSME3是miR-331-3p的下游靶基因，miR-331-3p過表達(dá)可抑制PSME3的表達(dá),表明PSME3可能參與宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展。

PSME3是一種蛋白酶體成分，大量研究強調(diào)了PSME3在癌變中的重要性。在乳腺癌中，沉默PSME3會抑制細(xì)胞活力誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯[22]。在子宮內(nèi)膜癌中，PSME3敲低可抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力[23]。與上述結(jié)果一致的是，本實驗發(fā)現(xiàn)苦木堿F處理抑制宮頸癌細(xì)胞增殖，轉(zhuǎn)染miR-331-3p抑制劑削弱了這一作用，而敲除PSME3再一次逆轉(zhuǎn)了miR-331-3p抑制劑對HeLa細(xì)胞的作用，表明苦木堿F通過miR-331-3p/PSME3抑制HeLa細(xì)胞的增殖能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Wnt/β-catenin通路調(diào)控細(xì)胞過程，如增殖，侵襲和分化等。已有研究表明，激活Wnt/β-catenin通路可促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡[24]。因此，通過分析Wnt/β-catenin信號通路，探討miR-331-3p抑制劑對苦木堿F誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞的作用機(jī)制。結(jié)果顯示，miR-331-3p抑制劑能削弱苦木堿F對Wnt/β-catenin信號通路的抑制作用，而沉默PSME3逆轉(zhuǎn)了這一結(jié)果。表明苦木堿F是通過上調(diào)HeLa細(xì)胞中的miR-331-3p表達(dá)來抑制Wnt/β-catenin通路的激活，提示W(wǎng)nt/β-catenin通路參與宮頸癌細(xì)胞中苦木堿F的抗腫瘤活性。

綜上所述，苦木堿F通過miR-331-3p/PSME3途徑抑制HeLa細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究表明苦木堿F對宮頸癌具有一定的抗腫瘤作用，為臨床治療宮頸癌提供了新的思路?？嗄緣AF對宮頸癌的潛在作用仍需進(jìn)一步研究。