宋 磊,周 銳,何 磊,肖 軍,代 飛

(1.陸軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院骨科,重慶 400038；2.火箭軍廣州特勤療養(yǎng)中心特勤生理訓練科,廣東 廣州 515515)

因創(chuàng)傷、感染、腫瘤、骨壞死及先天畸形等多種疾病引起的骨缺損在臨床上較為常見，但治療仍較為困難。近年來，骨組織工程的發(fā)展為骨缺損的修復開辟了新的途徑，其中支架材料是骨組織工程研究的關鍵[1]。盡管支架材料在基礎研究方面取得了較大進展，但在大規(guī)模臨床應用中仍存在許多需要解決的問題，如慢性炎癥反應和異物反應導致的骨修復失敗等[2]。通過人工引入免疫調(diào)控因子將有可能克服支架材料帶來的不利因素，營造有利于成骨的骨免疫微環(huán)境。細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4(cytotoxic T lymphocyte-associated protein 4,CTLA4)是一種T淋巴細胞表面蛋白，作為一類免疫抑制因子，對激活T淋巴細胞具有負性調(diào)控的作用[3]。研究發(fā)現(xiàn)，在體外免疫激活的環(huán)境下，過表達CTLA4可以顯著提高骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs)的成骨分化能力[4]。體內(nèi)實驗表明，與脫鈣骨基質(zhì)(demineralized bone matrix，DBM)復合的CTLA4修飾的BMMSCs成骨分化能力明顯增強[4-5]。另外，通過對相關機制的研究發(fā)現(xiàn)，在免疫激活環(huán)境下，CTLA4可通過促進BMMSCs中骨膜蛋白(periostin，POSTN)和促紅細胞生成素肝細胞受體B4(erythropoietin-producing hepatocellular receptor B4，EphB4)的表達增強BMMSCs的成骨分化能力[4-5]，且CTLA4修飾的BMMSCs可以在免疫激活環(huán)境下增強異體BMMSCs的遷移能力[6]。這些研究結果提示，CTLA4修飾的BMMSCs具有免疫調(diào)控作用。但是目前異體間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)移植治療在臨床中的安全性及有效性尚無明確定論，導致其在臨床上的推廣應用受限。另外，構建攜帶異體MSCs的組織工程骨由于受細胞培養(yǎng)時間及無菌環(huán)境要求的限制，不能很好地滿足戰(zhàn)場環(huán)境大批量傷員及時救治的需要。因此，我們提出新的構想：去除異體MSCs這一因素，構建復合CTLA4的新型骨移植修復材料。本文通過分析復合CTLA4的DBM對T淋巴細胞免疫能力和BMMSCs遷移能力的體外調(diào)控作用，以期為該新型骨移植修復材料的臨床應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

豬源纖維蛋白凝膠(廣州倍繡生物)、人CTLA4蛋白(Abbexa)、DBM(北京鑫康辰)、植物血凝素(PHA,SIGMA)、EasySep人外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)全血直接分選試劑盒(上海珞焱生物)、Human IL-2 Quantikine ELISA Kit(R&D Systems)、Human IFN-γ Quantikine ELISA Kit(R&D Systems)、Cell Counting Kit-8試劑盒(日本同仁化學)、Transwell小室(Corning)、24孔細胞培養(yǎng)板(Corning)、RPMI1640和胎牛血清(Gibco)。

1.2 方法

1.2.1 復合CTLA4的DBM的制備 制備纖維蛋白凝膠復合CTLA4溶液，CTLA4濃度為100 μg/mL。將DBM制成直徑12 mm、厚度5 mm的圓片，使用前高溫滅菌。通過特殊負壓灌注裝置(專利號：ZL201320058080.7)構建復合CTLA4的DBM。按照常規(guī)方法進行掃描電鏡樣品的制備，觀察復合CTLA4的DBM的微觀形態(tài)。

1.2.2 PBMCs分離 抽取健康成人(志愿者)外周血10 mL，置于含有3 000 U肝素的50 mL離心管中；按照EasySep人PBMC全血直接分選試劑盒的方法步驟進行PBMCs分離；最后用RPMI1640+10%胎牛血清培養(yǎng)基重懸PBMCs，計數(shù)備用。

1.2.3 T淋巴細胞免疫激活誘導 在體外利用植物血凝素(phytohaemagglutinin,PHA)20 μg/mL激活PBMCs中的T淋巴細胞，構建免疫激活微環(huán)境。

1.2.4 CTLA4蛋白緩釋實驗 將制備的復合CTLA4的DBM依次放入24孔細胞培養(yǎng)板中，加入約1 mL的RPMI1640細胞基礎培養(yǎng)基。放置于細胞培養(yǎng)箱中，分別于5、10、20、30、40 d后取約200 μL的培養(yǎng)基，通過ELISA檢測培養(yǎng)基中CTLA4的濃度。根據(jù)以下公式計算CTLA4的累積釋放率：CTLA4的累積釋放率=(培養(yǎng)基中CTLA4的濃度×1 mL)/復合DBM中的CTLA4總量×100%。

1.2.5 ELISA檢測IL-2和IFN-γ的表達 按照如下條件進行分組，構建Transwell共培養(yǎng)模型。DBM組：在Transwell下室接種PBMCs，PHA預處理24 h后，在上室加入不復合CTLA4的DBM，共培養(yǎng)12 h后，收集下室細胞培養(yǎng)基。CTLA4+DBM組：在Transwell下室接種PBMCs，PHA預處理24 h后，在上室加入復合CTLA4的DBM，共培養(yǎng)12 h后，收集下室細胞培養(yǎng)基。ELISA檢測：按照Human IL-2 Quantikine ELISA Kit和Human IFN-γ Quantikine ELISA Kit的方法檢測IL-2和IFN-γ在上述培養(yǎng)基中的含量。

1.2.6 BMMSCs增殖能力分析 參照本研究小組以往的實驗方法分離BMMSCs[7-8]。將600 μL含1×105BMMSCs的細胞懸液加入到Transwell下室，上室中加入復合CTLA4的DBM或不復合CTLA4的DBM，并加入200 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育，分別于2 d和3 d后按照CCK8試劑盒說明書測定每組樣品的吸光度(optical density，OD)值，測定波長為450 nm。

1.2.7 BMMSCs遷移能力分析 將100 μL含1×104BMMSCs的細胞懸液加入到Transwell上室，下室中加入復合CTLA4的DBM或不復合CTLA4的DBM，并加入600 μL含20%胎牛血清的培養(yǎng)基，置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育24 h后，取出Transwell小室，用PBS洗2次，5%戊二醇固定，加入0.5%結晶紫染色液染色5 min，PBS洗2次，用棉花球擦去上表面未穿過的細胞，顯微鏡下觀察穿過的細胞，計數(shù)5個200倍鏡視野下細胞的數(shù)量，取平均值作為每組的遷移細胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 復合CTLA4的DBM的電鏡形態(tài)

制備的復合CTLA4的DBM結構完整有序，具有良好的三維網(wǎng)絡結構(圖1)。

圖1 復合CTLA4的DBM的掃描電鏡形態(tài)圖

2.2 CTLA4蛋白累積釋放率

復合CTLA4的DBM在培養(yǎng)基中孵育5、10、20、30、40 d后，CTLA4的累積釋放率分別為(11.3%±1.9%)、(27.9%±3.7%)、(48.4%±3.6%)、(62.8%±3.8%)和(83.0%±2.5%)，見圖2。

圖2 復合CTLA4的DBM的CTLA4累積釋放率

2.3 復合CTLA4的DBM對IL-2和IFN-γ表達的影響

DBM組培養(yǎng)基中IL-2的含量為(292.0±12.3)pg·mL-1,CTLA4+DBM組培養(yǎng)基中IL-2的含量為(187.0±11.0)pg·mL-1，二者比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000 4)。DBM組培養(yǎng)基中IFN-γ的含量為(525.3±23.1)pg·mL-1，CTLA4+DBM組培養(yǎng)基中IFN-γ的含量為(387.0±11.0)pg·mL-1，二者比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000 7)，見圖3。與單純的DBM相比，復合CTLA4的DBM共培養(yǎng)可顯著減少培養(yǎng)基中IL-2和IFN-γ的含量。

*：與DBM組比較，P<0.05

2.4 復合CTLA4的DBM對BMMSCs增殖能力的影響

共培養(yǎng)2 d時，DBM組的OD值為(0.71±0.05)，CTLA4+DBM組的OD值為(1.12 ±0.07)，二者比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.003 1)；共培養(yǎng)3 d時，DBM組的OD值為(0.95±0.04)，CTLA4+DBM組的OD值為(1.59±0.05)，二者比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000 6)，見圖4。與單純的DBM相比，復合CTLA4的DBM共培養(yǎng)可顯著增強BMMSCs的增殖能力。

*：與DBM組比較，P<0.05

2.5 復合CTLA4的DBM對BMMSCs遷移能力的影響

DBM組遷移細胞數(shù)為(17.3±2.5)個，CTLA4+DBM組遷移細胞數(shù)為(56.0±5.6)個，二者比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000 4)，見圖5。與單純的DBM相比，復合CTLA4的DBM共培養(yǎng)可顯著增強BMMSCs的遷移能力。

a：顯微鏡下遷移細胞數(shù)(×200)；b：遷移細胞數(shù)統(tǒng)計結果 *：與DBM組比較，P<0.05

3 討論

目前，對于異體MSCs移植治療在臨床中的安全性及有效性尚無明確定論，導致其在臨床上的推廣運用十分受限[9-10]。與此同時，考慮到在戰(zhàn)場環(huán)境中需要及時大批量的進行傷員救治，而構建攜帶異體MSCs的組織工程骨由于受細胞培養(yǎng)時間及無菌環(huán)境要求的限制，不能很好地滿足戰(zhàn)場救治的需要。有研究提示，作為免疫負調(diào)控因子的CTLA4可能具備骨微環(huán)境免疫調(diào)控的能力[11]。因此，本研究去除異體MSCs這一因素，通過將CTLA4復合于DBM中，以此來構建復合CTLA4的新型組織工程骨，以期優(yōu)化骨免疫微環(huán)境，營造有利的成骨微環(huán)境，解決骨支架材料存在的“骨微環(huán)境調(diào)控缺陷”[12]。

本研究發(fā)現(xiàn)，復合CTLA4的DBM具有CTLA4緩釋的特點，在長達40 d的孵育過程中，CTLA4一直有緩慢的釋放。相比攜帶異體MSCs的組織工程骨，該材料更加易于保存和運輸，有更加廣闊的應用前景。

免疫反應與骨再生的過程密切相關。免疫細胞是骨再生微環(huán)境的中心調(diào)控者，其創(chuàng)造的免疫微環(huán)境對成骨與破骨活動具有顯著影響，在骨再生過程中發(fā)揮了關鍵作用[13]。T淋巴細胞是免疫系統(tǒng)的重要成員。IL-2是促進T淋巴細胞增殖和分化的關鍵分子，被稱作T淋巴細胞生長因子[14-15]。本研究結果顯示，復合CTLA4的DBM對IL-2的表達具有抑制作用，說明復合CTLA4的DBM對T淋巴細胞的活化具有抑制作用。在干細胞促骨形成方面，促炎的T淋巴細胞通過IFN-γ降低干細胞內(nèi)Runx-2通路并增強TNF-α信號，抑制外源性BMMSCs介導的骨修復能力[16-17]。本研究結果顯示，復合CTLA4的DBM可以抑制T淋巴細胞分泌IFN-γ，說明CTLA4可以改善DBM的成骨免疫微環(huán)境，促進成骨。去除MSCs這一因素，重組CTLA4蛋白仍可發(fā)揮免疫抑制的作用。因此，重組CTLA4蛋白有可能替代CTLA4修飾的MSCs成為新的組織工程骨成骨效能優(yōu)化因子。

我們前期的研究表明，即使在免疫激活的微環(huán)境下，過表達CTLA4的BMMSCs的成骨能力仍明顯增強[4]，且能增強異體BMMSCs的遷移能力，提示過表達CTLA4的BMMSCs可能具有誘導宿主干細胞歸巢的能力[6]。本研究結果顯示，復合CTLA4的DBM能增強BMMSCs的遷移能力。提示去除MSCs這一因素，重組CTLA4蛋白仍具有促進干細胞遷移的能力。本研究結果還顯示，復合CTLA4的DBM能增強BMMSCs的增殖能力。因此我們推測，在體內(nèi)環(huán)境下，復合CTLA4的DBM可能具有誘導宿主BMMSCs遷移至損傷部位并促進其增殖的功能，在今后的體內(nèi)實驗中將進一步驗證該材料的功能，為其臨床應用提供更加扎實的理論基礎。

綜上，復合CTLA4的DBM在體外環(huán)境下具有T淋巴細胞免疫抑制的能力，是一種新型骨移植修復材料，這種材料可以提前構建，在無菌封裝后進行冷凍保存，可保證在戰(zhàn)場條件下滿足攜帶方便、隨時補給、高效簡潔的需求。但其臨床應用效果仍需要大量的實驗數(shù)據(jù)支撐。我們將在今后的實驗中探討其在體內(nèi)環(huán)境下對免疫微環(huán)境的調(diào)控功能以及是否具有促進成骨的效能。