劉建利，袁鳳霞

（北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，寧夏 銀川 750021）

膽固醇具有非常重要的生理功能，但過多的膽固醇攝入體內(nèi)可能造成血清膽固醇偏高，從而誘發(fā)各種疾病[1]。研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌具有降膽固醇的特性[2-3]，相對(duì)于藥物治療和飲食控制這兩種臨床上治療高膽固醇血癥的方式，用含乳酸菌的保健食品控制血清膽固醇濃度，簡(jiǎn)便易行[4]。目前，已從開菲爾粒和陳年泡菜水[5]、黏面子[6]、辣白菜[6]、辣醬[6]、西藏牦牛乳[7]、發(fā)酵香腸[8]等發(fā)酵食品及糞便[9]、海洋[10]和水果[11]等環(huán)境中分離篩選出降膽固醇的乳酸菌。這些菌株或可通過分泌膽鹽來(lái)水解酶來(lái)水解膽鹽，產(chǎn)生游離的膽汁酸，共沉淀膽固醇；或可使細(xì)胞膜通過吸附固定或同化吸收膽固醇；或調(diào)控膽固醇在人體內(nèi)的代謝，進(jìn)而減少膽固醇在血液中的含量[12-13]。

以發(fā)酵酸乳的方式攝入功能乳酸菌菌株，可以補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，容易被消費(fèi)者所接受。雖然目前關(guān)于降解膽固醇乳酸菌株篩選的研究不少，但功能菌株資源的發(fā)掘仍需進(jìn)行，而且現(xiàn)有研究對(duì)降解菌株是否能用于酸乳發(fā)酵關(guān)注的較少。我國(guó)各地區(qū)人民制作各種乳酸菌發(fā)酵食品歷史悠久，產(chǎn)品風(fēng)味獨(dú)特、組織細(xì)膩、口感純正，在當(dāng)?shù)刈匀粶囟认麓娣泡^長(zhǎng)時(shí)間還能保證其口感和狀態(tài)[14-15]。因此，在這些傳統(tǒng)乳酸菌發(fā)酵食品中含有豐富、獨(dú)特的優(yōu)良乳酸菌資源。本試驗(yàn)擬以前期從傳統(tǒng)乳酸菌發(fā)酵食品中分離的250株乳酸菌為候選菌株，篩選具有體外降膽固醇能力的菌株，并評(píng)價(jià)應(yīng)用酸乳發(fā)酵的潛力和體外胃腸道耐受性，為開發(fā)功能發(fā)酵酸乳奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

250株乳酸菌菌株：從新疆、西藏、青海、內(nèi)蒙、甘肅等地生產(chǎn)的奶疙瘩、曲拉、乳扇、漿水、泡菜、酵頭等傳統(tǒng)乳酸菌發(fā)酵食品中分離篩選，寧夏特殊生境微生物資源開發(fā)與利用實(shí)驗(yàn)室-80℃保存。

膽固醇（化學(xué)純）：美國(guó)Sigma-Aldrich公司；胰蛋白酶（250U/mg）：北京拜耳迪生物公司；胃蛋白酶（550U/mg）：北京博奧拓達(dá)科技有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物：英國(guó)Oxoid公司；鄰苯二甲醛（化學(xué)純）：上海笛柏化學(xué)品有限公司；牛肉浸粉：青島海博生物公司；牛膽鹽：上海瑞永生物科技有限公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒：康為世紀(jì)生物科技有限公司；2×EasyTaq PCR SuperMix（+dye）：北京全式金生物技術(shù)有限公司；氯化鈉、鹽酸、濃硫酸、鄰苯二甲醛、葡萄糖、乙酸鈉、檸檬酸二胺、吐溫-80、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸錳、碳酸鈣、無(wú)水乙醇：以上均為化學(xué)純，天津市大茂化學(xué)試劑廠；純牛奶：伊利乳業(yè)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TMS-PRO型質(zhì)構(gòu)儀：美國(guó)FTC公司；NDJ-8S型黏度計(jì)：上海庚庚儀器設(shè)備公司；S1000型快速梯度基因擴(kuò)增儀（PCR儀）：美國(guó)Bio-Rad公司；1-14型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：美國(guó)Sigma公司；754N紫外分光光度計(jì)：上海精密儀器儀表有限公司；ND100氮吹儀：杭州瑞誠(chéng)儀器有限公司；MJ-54A全自動(dòng)立式高壓滅菌鍋：施都凱儀器設(shè)備（上海）有限公司；DYY-12C電泳儀：北京六一生物科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 溶液和培養(yǎng)基配制

膽固醇標(biāo)準(zhǔn)液：準(zhǔn)確稱取膽固醇0.1 g，無(wú)水乙醇定容100 mL，混勻。

鄰苯二甲醛溶液：準(zhǔn)確稱取鄰苯二甲醛0.05 g，加冰乙酸溶解定容至100 mL。

50%KOH溶液：準(zhǔn)確稱取KOH固體50 g溶于100 mL蒸餾水中。

酸溶液：參考文獻(xiàn)[16-20]有所修改，將生理鹽水的pH值調(diào)至3.0，121℃下滅菌20 min。

膽鹽溶液：參考文獻(xiàn)[16-20]有所修改，稱取0.3 g牛膽鹽加水溶解定容至100mL，于121℃下滅菌20min。

人工模擬胃液：參考文獻(xiàn)[16-20]有所修改，用5%NaCl溶液配制3 mg/mL胃蛋白酶溶液，調(diào)節(jié)pH值為2.5，經(jīng)微孔濾膜過濾除菌后備用。

人工模擬胰液：參考文獻(xiàn)[16-20]有所修改，用5%NaCl溶液配制1 mg/mL胰蛋白酶溶液，調(diào)整pH值為8.0，經(jīng)微孔濾膜過濾除菌后備用。

高膽固醇培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)液中滅菌后加入除菌膽固醇至濃度0.1 mg/mL。

1.3.2 體外篩選降膽固醇菌株

1.3.2.1 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

分別精確吸取 100、200、300、400、500 μL 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)液于10 mL容量瓶中，再用無(wú)水乙醇定容，配成10、20、30、40、50 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。精確吸取各梯度溶液1.0 mL，加入10 mL試管中，并用氮吹儀吹干溶劑，然后準(zhǔn)確加入2.0 mL鄰苯二甲醛溶液，振蕩使其充分溶解，在室溫25℃下靜置10 min，再加入1.0 mL濃硫酸，混合均勻，靜置10 min使其顯色，取2.0 mL鄰苯二甲醛溶液加入1.0 mL濃硫酸，在室溫25℃下靜置10 min后作為對(duì)照組調(diào)零，在波長(zhǎng)550 nm處測(cè)定其吸光度。以膽固醇濃度為橫坐標(biāo)，波長(zhǎng)550 nm處的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.022 9X-0.018 4，R2=0.992 9。

1.3.2.2 菌株降解膽固醇能力測(cè)定

取保藏的菌株50 μL接入5 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37℃100 r/min搖床培養(yǎng)24 h活化；按1%的比例接種高膽固醇培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)24 h；以不接種菌、相同培養(yǎng)條件的高膽固醇培養(yǎng)基為空白對(duì)照。準(zhǔn)確吸取培養(yǎng)液2 mL，12 000 r/min離心10 min。吸取上清液1 mL到50 mL比色管中，加入50%KOH 4.0 mL，混勻后加入6.0 mL 95%乙醇，漩渦振蕩1 min。60℃水浴加熱15 min，取出冷卻至室溫25℃后，向比色管中加入5.0 mL正己烷，混勻并加入3.0 mL蒸餾水，漩渦振蕩15 min，然后靜置15 min，取1.0 mL正己烷層溶液于試管中，用氮吹儀吹干，加入鄰苯二甲醛溶液2.0 mL，混勻，室溫25℃靜置10 min，加入1.0 mL濃硫酸，并迅速渦旋振蕩1 min，放置10 min后，在550 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度，代入標(biāo)曲計(jì)算膽固醇含量，按下列公式計(jì)算菌株膽固醇降解率。

式中：X為膽固醇降解率，%；A為空白對(duì)照中膽固醇含量，mg/mL；B為接種各乳酸菌株的培養(yǎng)基中膽固醇含量，mg/mL。

1.3.3 評(píng)估菌株發(fā)酵酸乳能力

1.3.3.1 乳酸菌的活化及菌懸液制備

取各菌株MRS培養(yǎng)液，4℃6000r/min離心5min，棄上層培養(yǎng)液，加入無(wú)菌生理鹽水制成菌懸液，調(diào)整菌液濃度大于1×108cfu/mL。

1.3.3.2 發(fā)酵酸乳的制備

取滅菌后的酸乳瓶，每瓶加入30 mL含蔗糖15%的牛奶，95℃滅菌5 min，待冷卻后，接種5 mL菌懸液，40℃培養(yǎng)8 h～12 h，凝乳后取出，4℃保存。

1.3.3.3 發(fā)酵酸乳感官評(píng)定

將冷藏12 h的酸乳取出后，從食品科學(xué)與工程專業(yè)選8名～15名學(xué)生依據(jù)感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)其氣味、質(zhì)地、口感3個(gè)指標(biāo)進(jìn)行感官評(píng)定，評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表1，記錄數(shù)據(jù)計(jì)算平均值。

表1 酸乳感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation scale of yoghourt

1.3.3.4 發(fā)酵酸乳質(zhì)構(gòu)測(cè)定

測(cè)試探頭型號(hào)為圓盤擠壓探頭P/75。測(cè)試條件：測(cè)前速率30 mm/min；測(cè)后速率與測(cè)前速率一致；兩次壓縮之間的停留間隔0 s；采樣速度10 Hz；最小觸發(fā)力0.3 N。

1.3.4 菌株體外模擬腸胃道耐受性試驗(yàn)

準(zhǔn)確吸取0.5 mL菌懸液分別接種于4.5 mL pH 2.0的生理鹽水、酸溶液、膽鹽溶液、人工模擬胰液和人工模擬胃液中，處理4 h后，取500 μL處理液接種于5 mL MRS培養(yǎng)基中，于37℃下?lián)u床培養(yǎng)8 h后，在600 nm處測(cè)量其吸光度，按下列公式計(jì)算存活率。

式中：X為存活率，%；A為各菌株在生理鹽水中處理后培養(yǎng)液吸光度；B為各菌株在酸溶液、膽鹽溶液、人工模擬胰液和人工模擬胃液中處理后培養(yǎng)液吸光度。

1.3.5 菌株分子生物學(xué)鑒定

參照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株DNA，16SrDNA擴(kuò)增反應(yīng)體系（50μL）：10×PCR Mix 25μL、10 μmol/L 的上下游引物各 1 μL、模板 DNA 1 μL、雙蒸水 22 μL；PCR 反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性10min；94℃ 變性1 min；56℃退火1 min；72℃延伸1 min；重復(fù)擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)；72℃后延伸5 min。取3 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖電泳檢測(cè)，剩余PCR擴(kuò)增產(chǎn)物由南京金斯瑞生物公司進(jìn)行測(cè)序。用CIPRES Science Gateway中在線RAxML-HPC2 Blackbaox建ML進(jìn)化樹；在Figtree中編輯系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理及分析

采用SPSS11.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析（ANOVA），用Tukey進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 各菌株膽固醇降解率測(cè)定結(jié)果

各菌株膽固醇降解率分布結(jié)果見圖1，降解率高于40%菌株結(jié)果見圖2。

圖1 各菌株膽固醇降解率分布Fig.1 The cholesterol-lowering rate distribution of all strains

圖2 8株降解率高于40%的菌株Fig.2 The 8 strains with cholesterol-lowering rate more than 40%

如圖1所示，大多數(shù)菌株膽固醇降解率較低，降解率低于40%的菌株有242株，占總菌株96.8%；如圖2所示，降解率高于40%的有8株，占3.2%。分別為菌株“鮮豆腐 8”、“新 A19”、“廣汕 1”、“新 E5”、“藏嘎圈 4”、“酸豆腐B10”、“藏嘎圈5”等。降解率高于50%的菌株只有1株，占0.4%，為菌株“青A16”，其降解率為54.64%。選擇膽固醇降解率高于40%的8株菌進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 降解膽固醇菌株酸乳發(fā)酵能力

2.2.1 降解膽固醇菌株發(fā)酵酸乳感官評(píng)價(jià)

各降解膽固醇菌株發(fā)酵酸乳感官評(píng)價(jià)結(jié)果見表2。

表2 各降解膽固醇菌株發(fā)酵酸乳感官評(píng)價(jià)結(jié)果Table 2 The result of sensory evaluation scores of yoghourt fermented with different strains

從質(zhì)地、氣味和口感方面評(píng)價(jià)8株高效降膽固醇菌株發(fā)酵酸乳，“鮮豆腐 8”、“新 A19”、“藏嘎圈 4”、“酸豆腐B10”、“藏嘎圈5”、“青A16”6株菌發(fā)酵酸乳的總分高于80分；“廣汕1”、“新E5”兩株菌發(fā)酵酸乳總分低于80分，主要是兩株菌發(fā)酵酸乳氣味相對(duì)較差。因此，選擇80分以上的6株菌作為后續(xù)試驗(yàn)供試菌株。

2.2.2 各降解膽固醇菌株發(fā)酵酸乳質(zhì)構(gòu)測(cè)定

各降解膽固醇菌株發(fā)酵酸乳質(zhì)構(gòu)特性測(cè)定結(jié)果見圖 3～圖 5。

圖3 各菌株發(fā)酵酸乳的咀嚼力測(cè)定Fig.3 Chewiness determination of yoghourt fermented with different strains

圖4 各菌株發(fā)酵酸乳的彈性測(cè)定Fig.4 Elasticity determination of yoghourt fermented with different strains

圖5 各菌株發(fā)酵酸乳膠黏性、硬度、最大黏附力、破裂力、內(nèi)聚力測(cè)定Fig.5 Viscosity，hardness，maximum adhesion，crushing force and cohesion determination of yoghourt fermented with different strains

由圖3可知，發(fā)酵酸乳的咀嚼力以“青A16”菌株最大（3.02 N），“藏嘎圈 5”的咀嚼力次之，為 2.13 N，“酸豆腐B10”最小，為1.32 N；由圖4可知，彈性以“青A16”、“酸豆腐B10”和“藏嘎圈4”的最大，分別為20.93、20.83 N 和 20.67 N，“藏嘎圈 5”的最?。?7.05 N）；由圖5 可知，膠黏性以“青 A16”的最大（0.15 N），“酸豆腐B10”和“藏嘎圈4”的最小，分別為0.07N和0.06 N；硬度“青 A16”的最大（0.28 N），“酸豆腐 B10”和“藏嘎圈5”最小，分別為0.93 N和0.80 N；最大黏附力以“青A16”的最大（0.126 N），“藏嘎圈 4”的最?。?.03 N）；破裂力以“青 A16”的最大（0.36 N），“酸豆腐 B10”和“藏嘎圈 4”的最?。?.13 N）；內(nèi)聚力以“酸豆腐 B10”最大（0.54 N），“青 A16”的最?。?.36 N）。因此，除內(nèi)聚力外，咀嚼性、彈性、膠黏性、硬度、最大黏附力、破裂力等指標(biāo)均以菌株“青A16”發(fā)酵酸乳最高。

2.3 降解膽固醇菌株胃腸道耐受性

各菌株體外模擬胃腸道耐受性結(jié)果見圖6。

由圖6可知，在酸溶液中，只有“青A16”和“鮮豆腐8”兩株菌存活率在40%以上；而在膽鹽溶液中，“青A16”和“新A19”兩株菌存活率達(dá)到40%以上，其中最大的是“新A19”，存活率為57.61%；在人工模擬胃液中，“鮮豆腐 8”、“青 A16”和“新 A19”3 株菌的存活率達(dá)到40%以上，其中“新A19”的存活率最高，存活率為73.73%；在人工模擬胰液中，除了“新A19”菌株被抑制

圖6 菌株胃腸道耐受性結(jié)果Fig.6 The result of survive of strains in artificial simulated gastrointestinal tract environment

不同字母表示存在顯著差異，p＜0.05。了28%左右，其他的菌株生長(zhǎng)反而有促進(jìn)的趨勢(shì)。綜合比較，“青A16”具有較好的耐受性，在各個(gè)處理液中存活率均高于40%。

2.4 菌株分子生物學(xué)鑒定

菌株分子生物學(xué)鑒定結(jié)果見圖7。

圖7 基于16S rDNA構(gòu)建Enterococcus屬系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.7 The phylogenetic tree of the genera Enterococcus based on 16S rDNA sequences

由圖7可知，菌株“青A16”的16S rDNA序列在EzBioCloud中經(jīng)過比對(duì)，顯示與耐久腸球菌（Enterococcus durans）NBRC 100479（Type）的 16S rDNA 序列相似度高達(dá)99.93%；基于16S rDNA用ML法構(gòu)建Enterococcus屬系統(tǒng)發(fā)育樹，也顯示“青A16”菌株與耐久腸球菌分枝聚在一起。因此，分子生物學(xué)鑒定結(jié)果“青A16”為耐久腸球菌。

3 討論

已有研究表明，我國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵食品是包括降解膽固醇等各種乳酸菌的重要資源庫(kù)。例如，西北特有食品漿水[21]、發(fā)酵酸肉[22]、藏靈菇[23]、四川泡菜[24]、貴州泡椒[25]、臘肉[26]、臘腸[27]等。本試驗(yàn)篩選到膽固醇降解率最高的菌株“青A16”，分離自西藏牧民自制的曲拉。

已報(bào)道降膽固醇乳酸菌主要有乳酸乳球菌乳亞種（Lactococcus lactis subsp.lactis）、乳酪短桿菌（Brevibacterium casei）[21]，棉籽糖乳球菌（L.raffinolactis）、消化乳桿菌（L.alimentarius）[22]、嗜酸乳桿菌（L.acidophilus）[23]、植物乳桿菌（L.plantarum）[24]、海氏腸球菌（Enterococcus hirae）[25]、屎腸球菌（E.faecium）[25]等。本試驗(yàn)獲得的“青 A16”為耐久腸球菌（E.durans），報(bào)道較少。

目前已報(bào)道的降解膽固醇菌株的降解能力差異較大，除李雪萍等[21]篩選到4株菌降解率大于75%，最高達(dá)92.28%以外，其余報(bào)道的菌株降解率均在30%～60%之間[23-27]。菌株降解能力不同，可能和菌株本身有關(guān)，也有可能和使用的膽固醇底物有關(guān)，有學(xué)者使用卵磷脂和膽固醇膠束作為底物[13，22，26-27]，膠束在溶液中分布更均勻，但可能會(huì)影響菌體吸收；還有小部分研究使用雞蛋黃作為膽固醇源[24]，蛋黃成分較復(fù)雜，蛋黃中其他成分如蛋白質(zhì)、卵磷脂等可能會(huì)促進(jìn)膽固醇較易被菌體吸收。另外，即使用相同膽固醇為底物，在篩選培養(yǎng)基中的初始添加量不同，可能測(cè)得的降解率也不同，李雪萍等[21]用2 mg/mL膽固醇測(cè)得降解率最高達(dá)92.8%，丁苗等[22]用200 mg/mL測(cè)得降解率最高達(dá)33.78%，黃穎等[23]、汪曉輝等[27]、用 0.1 mg/mL 分別測(cè)得降解率最高達(dá)50.36%、50.03%，居華等[24]用1 mg/mL測(cè)得降解率最高45.31%。本試驗(yàn)用無(wú)水乙醇先溶解膽固醇化合物配成母液，再以終濃度0.1 mg/mL初始量添加到MRS液體培養(yǎng)基中，篩選獲得的菌株最高降解率54.64%，和黃穎等[23]、汪曉輝等[27]結(jié)果相近。

人體正常胃液的pH值在3左右，在此pH值條件下，大部分微生物都難以存活，同時(shí)人體腸胃道中膽鹽、胃蛋白酶、胰酶等消化酶，也會(huì)影響微生物的生長(zhǎng)。對(duì)于益生乳酸菌，必須進(jìn)入人體的腸道才能發(fā)揮其益生功能，要求菌株必須能夠耐受機(jī)體胃腸道環(huán)境，在人體腸道特殊環(huán)境中存活并增殖，因此，菌株在人體腸道內(nèi)的耐受性尤為重要[28]。本試驗(yàn)篩選的菌株“青A16”對(duì)酸、膽鹽、胃蛋白酶和胰酶有一定的耐性，在各溶液中存活率都在40%以上，理論上能在人體胃腸道存活。另外，本試驗(yàn)測(cè)得菌株降解能力，是體外檢測(cè)方法，益生菌在腸道發(fā)揮作用和體外培養(yǎng)基中有很大不同，后續(xù)還需對(duì)菌株在模型動(dòng)物體內(nèi)降解膽固醇能力和腸道黏附定殖能力進(jìn)行深入研究。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)通過高膽固醇培養(yǎng)基篩選獲得體外膽固醇降解率為54.64%耐久腸球菌菌株“青A16”，并用此發(fā)酵的酸乳感官評(píng)價(jià)得分和質(zhì)構(gòu)測(cè)定指標(biāo)均較高，而且此菌株在酸溶液、膽鹽溶液、人工模擬胰液和人工模擬胃液中存活率均達(dá)到了40%以上，表明“青A16”菌株既能高效降膽固醇又能用于酸乳發(fā)酵還能定植胃腸道，可作為功能酸乳開發(fā)候選發(fā)酵菌株。