孫璐

(青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院 青海省高原放牧家畜動(dòng)物營養(yǎng)與飼料科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧810016)

玉樹藏族自治州位于青海省西南部青藏高原腹地的三江源頭，生活在這里的人們處于寒冷、缺氧、強(qiáng)紫外線等高海拔環(huán)境中，一年中大部分時(shí)間無法補(bǔ)充蔬菜和水果，但是他們能夠在極端環(huán)境中健康生活，很大程度上取決于牦牛乳，其產(chǎn)品構(gòu)成他們?nèi)粘ｏ嬍车闹饕M成部分［1］。牦牛乳中含有多種對哺乳動(dòng)物后代健康很重要的復(fù)雜成分，主要包括蛋白質(zhì)、乳糖和脂肪，以及一些相對分子量較低，具有特殊生物學(xué)功能的低聚糖、磷脂和鞘脂等化合物［2］。牦牛乳的產(chǎn)量較荷斯坦牛極低，但其蛋白質(zhì)、干物質(zhì)、脂肪及乳糖等營養(yǎng)成分含量高于其他乳，富含共軛亞油酸(CLA)、免疫球蛋白等功能性成分，是一種天然、獨(dú)特的濃縮乳，被認(rèn)為是制造嬰兒、老年人及特殊需求人群食品的優(yōu)質(zhì)原料乳［3］。牦牛乳營養(yǎng)含量高，含有豐富的微生物群系。牦牛乳中的微生物從各種來源獲得，發(fā)揮著多種作用，如促進(jìn)乳品發(fā)酵(乳球菌、乳桿菌、鏈球菌、丙酸桿菌和真菌種群)、導(dǎo)致腐敗(假單胞菌、梭狀芽孢桿菌、芽孢桿菌)、有益于健康(乳酸桿菌和雙歧桿菌)或引起疾病(李斯特菌、沙門氏菌、大腸桿菌、彎曲桿菌和產(chǎn)生霉菌毒素的真菌)等［4］。關(guān)于微生物早期的研究大多基于培養(yǎng)的方法獲得微生物的組成，對于無法培養(yǎng)的微生物則不能通過該方法解析。高通量測序技術(shù)的發(fā)展，克服了微生物培養(yǎng)檢測的局限性，被廣泛用來鑒定和發(fā)現(xiàn)微生物［5］。本文為了解牦牛液態(tài)乳的質(zhì)量和安全，對青海省玉樹地區(qū)的生鮮牦牛乳源微生物進(jìn)行高通量測序，為牦牛乳的開發(fā)利用及優(yōu)勢菌群的發(fā)掘等提供參考。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

2019年7～8月，選取玉樹地區(qū)自然放牧，體況、年齡、胎次(4～5胎次)基本一致的泌乳中期母牦牛，母牛和犢牛分開過夜，每天人工擠奶1～2次但不完全擠完。3個(gè)樣點(diǎn)采樣方法相同。

采樣地點(diǎn)為青海省玉樹州稱多縣歇武鎮(zhèn)、曲麻萊長江村、玉樹州果青牧場3個(gè)樣點(diǎn)。每個(gè)樣點(diǎn)采集6個(gè)樣(yak1、yak2、yak3)。采樣點(diǎn)基本信息見表1。每份乳約50 mL，取5 mL于無菌無酶凍存管(康寧/Corning公司)中，液氮速凍，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后儲(chǔ)存在-80℃冰箱備測。

表1 采樣點(diǎn)基本信息

1.2 儀器與設(shè)備

DCC體細(xì)胞檢測儀(利拉伐天津有限公司);超低溫冰箱(-80℃，美國Thermo公司);Fresco21型高速冷凍離心機(jī)(美國Thermo公司);Tprofessiona PCR儀(德國Biometral公司);Gel DOC XR凝膠成像系統(tǒng);PowerPacUniversal水平電泳儀;SUBCELL GT電泳槽(20 cm×25 cm，美國Bio-Rad公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 基因組總DNA提取及PCR擴(kuò)增、測序參照YU［16，17］等 的 方 法 提取3組牦 牛 乳 樣 本 中 的DNA，以16S V4區(qū)引物(515F和806R)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。通過TruSeq DNA PCR-Free Sample Preparation Kit構(gòu)建文庫，文庫合格后，使用NovaSeq6000進(jìn)行上機(jī)測序。PCR的擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物的混樣、純化，文庫的構(gòu)建和上機(jī)測序流程均由天津諾禾致源生物信息科技有限公司完成?；谔旖蛑Z禾致源云平臺(tái)(https://magic.novogene.com)、SPSS Statistics軟件(version 19.0)、I-Sanger云平臺(tái)(https://www.isanger.com/)、R軟件(version 3.5.1)以及ITOL(https://itol.embl.de/)等軟件平臺(tái)進(jìn)行生物信息學(xué)及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

1.3.2 環(huán)境因子的獲取利用天寶juno sa無線GPS記錄器定位獲得3個(gè)采樣地點(diǎn)的坐標(biāo)、海拔等信息，在國家氣象科學(xué)數(shù)據(jù)中心(http://data.cma.cn/site/index.ht mL)獲取采樣點(diǎn)年平均氣溫。

1.4 數(shù)據(jù)計(jì)算

1.4.1 測序數(shù)據(jù)處理測序所得原始序列截去接頭和引物序列后，使用FLASH(version 1.2.7)進(jìn)行拼接獲得原始Tags數(shù)據(jù)，原始Tags數(shù)據(jù)經(jīng)Qiime(version 1.9.1，http://qiime.org/scripts/split_libraries_fastq.ht mL)質(zhì)量控制后獲得高質(zhì)量的Tags數(shù)據(jù)(Clean Tags)，通過(https://github.com/torognes/vsearch/)與物種注釋數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對檢測嵌合體序列，并最終去除其中的嵌合體序列，得到最終的有效數(shù)據(jù)(Effective Tags)。

1.4.2 微生物多樣性分析Shannon，Observed-OTUs，Chao及Simpson指數(shù)使用Qiime軟件(Version 1.9.1)計(jì)算，Alpha多樣性的指數(shù)組間差異分析使用R軟件(Version 2.15.3)完成。利用QIIME軟件(version 1.17)計(jì)算Beta多樣性距離矩陣。相似性分析(Analysis of similarities，ANOSIM)基于bray_curtis距離分析，基于unweighted UniFrac距離對不同海拔牦牛乳微生物進(jìn)行主坐標(biāo)分析(PCoA)。對牦牛乳微生物組成進(jìn)行差異判別分析(LEfSe)，再根據(jù)分類學(xué)組成對樣本按照不同的分類水平進(jìn)行線性判別分析(LDA，閾值為4)，找出對樣本劃分產(chǎn)生顯著性差異影響的菌群。

2 結(jié)果

2.1 玉樹地區(qū)牦牛乳微生物測序結(jié)果及多樣性指數(shù)

質(zhì)控后按照97%相似性進(jìn)行可操作分類單元(operational taxonomic units，OTU)聚類，共得到12329個(gè)OTUs。繪制等級聚類曲線(Rank Abundance)和稀釋曲線(Rarefaction curve)。稀釋曲線是從樣本中隨機(jī)抽取一定測序量的數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)所代表物種數(shù)目(OTUs數(shù)目)，以抽取的測速數(shù)據(jù)量與對應(yīng)的物種數(shù)來構(gòu)建曲線，稀釋曲線直接反映測序數(shù)據(jù)量的合理性，間接反映樣本中物種的豐富度，圖1曲線逐漸趨向平坦，表明本試驗(yàn)的測序數(shù)據(jù)量合理。

圖1 Alpha多樣性指數(shù)稀釋曲線圖

等級聚類曲線是將樣本中OTUs按相對豐度由大到小排序得到對應(yīng)的排序編號，再以O(shè)TUs的排序編號為橫坐標(biāo)，OTUs中的相對豐度為縱坐標(biāo)，將這些點(diǎn)用折線連接，可直接反映樣本中物種的豐富度和均勻度。如圖2所示，在水平方向上，曲線橫軸跨度逐漸變大，說明物種豐富度也隨之變大;在垂直方向上，曲線逐漸平滑，說明物種分布均勻。

圖2 等級聚類曲線

通過Shannon和Simpson指數(shù)評價(jià)微生物的多樣性，Observed species和Chao1評價(jià)微生物菌群豐度。由表2可知，青海玉樹地區(qū)不同樣點(diǎn)牦牛乳樣品中微生物的豐度存在顯著差異，但3組樣品的微生物多樣性相似。

表2 Alpha多樣性指數(shù)差異

2.2 玉樹地區(qū)牦牛乳微生物組成

2.2.1 物種維恩圖(Venn Diagram)分析對玉樹地區(qū)不同樣點(diǎn)的牦牛乳微生物制作物種Venn圖，由圖3可知，3組樣品共有3104個(gè)OTUs。其中玉樹州果青牧場(yak3)的牦牛乳樣品中特有2697個(gè)OTUs，是3組中數(shù)量最多的;稱多縣歇武鎮(zhèn)歇武村(yak1)牦牛乳樣品中特有的OTUs個(gè)數(shù)為915;曲麻萊長江村(yak2)的牦牛乳樣品特有OTUs 564個(gè)，是3組中最少的。

圖3 韋恩圖

2.2.2 玉樹地區(qū)牦牛乳微生物門分類水平的組成對3組樣品中的微生物進(jìn)行門水平前10種物種相對豐度分析，結(jié)果如圖4。相對豐度排名前10的微生物分別是:變形菌門(Proteobacteria)，厚壁菌門(Firmicutes)，擬桿菌門(Bacteroidetes)，放線菌 門(Actinobacteria)，藍(lán)藻門(Cyanobacteria)，浮霉菌門(Planctomycetes)，酸酐菌門(Acidobacteria)，疣微菌門(Verrucomicrobia)，綠彎菌門(Chloroflexi)，軟壁菌門(Tenericutes)。其中，變形菌門在yak1和yak2組中的含量最高，分別占比50.40%和44.52%;yak3組中變形菌門和厚壁菌門含量較多，占比接近，分別為35.09%和36.70%;軟壁菌門在yak1組中的含量最少(0.40%)，疣微菌門在yak2組中的占比最小(0.18%)，浮 霉 菌 門 在yak3中 的 含 量 最 少(0.15%)。

圖4 門水平玉樹地區(qū)微生物的相對豐度

2.2.3 玉樹地區(qū)牦牛乳微生物屬分類水平的組成玉樹地區(qū)不同樣點(diǎn)牦牛乳微生物屬水平物種豐度結(jié)果表明(圖5)，微生物組成占比前10的分別是unidentified_Burkholderiaceae、金黃桿菌屬(chryseobacterium)、耶爾森菌屬(Yersinia)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、unidentified_Cyanobacteria、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、乳酸鏈球菌屬(Lactococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、unidentified_Enterobacteriaceae。Yak1組中占比最高的為不動(dòng)桿菌屬(7.20%);yak2組和yak3組占比最高的分別是金黃桿菌屬和乳桿菌屬。乳酸鏈球菌屬在yak1組和yak2組中的含量最少，unidentified_Burkholderiaceae在yak3組中占比最低。

圖5 屬水平下玉樹地區(qū)牦牛乳微生物的相對豐度

2.2.4 玉樹地區(qū)牦牛乳微生物種水平的組成玉樹地區(qū)牦牛乳樣品前10個(gè)種水平微生物組成比較表明，唐菖蒲伯克霍爾德菌(Burkholderia gladioli)和Chryseobacterium_vrystaatense在yak2組的比例最高，分別為12.40%和17.17%;魯氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacter lwoffii)占比較高，在yak1組中含量最高;Lactobacillus_iners在yak1，yak2組的含量較低，唐菖蒲伯克霍爾德菌在yak3組中所占比例最低。

表3 種水平下玉樹地區(qū)牦牛乳微生物的相對豐度

2.2.5 玉樹地區(qū)牦牛乳物種主坐標(biāo)分析基于unweightedUniFrac距離的PCoA主坐標(biāo)分析結(jié)果顯示，第一主成分對樣品差異的貢獻(xiàn)值為14.38%，第二主成分對樣品差異的貢獻(xiàn)值為10.36%。yak1、yak2及yak3組各組間距離較近，可能是由于3組樣本采樣地點(diǎn)距離、海拔較近，經(jīng)緯度較為接近，且yak2和yak3組的微生物結(jié)構(gòu)相似度較高。

圖6 基于unweightedUniFrac距離的PCoA主坐標(biāo)分析

2.3 玉樹地區(qū)牦牛乳微生物組成組間差異分析

LDA值分布柱狀圖(圖7A)(LDA score＞4)體現(xiàn)了玉樹地區(qū)不同樣點(diǎn)牦牛乳間微生物具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的物種，由圖可知yak3組中差異物種影響較大的是厚壁菌門、乳桿菌目(Lactobacillales)、芽孢桿菌綱(Bacilli);yak2組中差異物種影響較大的是黃桿菌目(Flavobacteriales)、金黃桿菌屬(Chryseobacterium)、unidentified_Flavobacteriales;yak3組中差異物種影響較大的是耶爾森菌屬、紅細(xì)菌目(Rhodobacterales)、紅細(xì)菌科(Rhodobacteraceae)。

玉樹不同地區(qū)牦牛乳進(jìn)化分支圖(圖7B)由內(nèi)而外輻射的圓圈代表了由門至屬(或種)的分類級別，圖中無顯著差異的統(tǒng)一著色為黃色，差異顯著的物種跟隨分組進(jìn)行著色。由圖可知，yak1組中差異顯著的物種為unidentified_Cyanobacterin、紅細(xì)菌科(Rhodobacteraceae)、紅細(xì)菌目(Rhodobacterales)、鞘脂單胞菌科(Sphingomonadaceae)、鞘脂單胞菌目(Sphingomonadales)，yak2組中差異顯著的物種為unidentified_Flavobacteria、黃桿菌目(Flavobacteriales)，yak3組中差異物種為乳桿菌目(Lactobacillales)、鏈球菌科(Streptococcaceae)、乳桿菌科(lactobacillaceae)、芽孢桿菌綱(Bacilli)。

圖7 LEfSe組間差異分析 A：LDA值分布柱狀圖；B：進(jìn)化分支圖

3 討論

牦牛乳中含有多種微生物，包括有益菌及各種致病菌。致病菌是食源性疾病的主要來源，對犢牛及消費(fèi)者的健康造成威脅。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，門水平玉樹地區(qū)牦牛生鮮乳中主要的微生物為變形菌門和厚壁菌門;屬水平中主要的優(yōu)勢菌為不動(dòng)桿菌屬、金黃桿菌屬和乳桿菌屬，這與現(xiàn)有的研究結(jié)果一致［6，7］。

牛乳中的微生物多樣性對于預(yù)測的乳品質(zhì)量具有重要意義。牛乳中的微生物受來源動(dòng)物、環(huán)境、溫度、海拔等多種因素的影響［8，9］。變形菌門和耶爾森氏菌是常見的糞便菌群，其中變形菌門(如大腸桿菌、克雷伯氏菌、腸桿菌、變形桿菌和沙雷氏菌)在健康機(jī)體的腸道中很少見，多見于早期腸道炎癥的機(jī)體內(nèi)［10，11］。耶爾森氏菌是一種在糞便中存在的與腸炎有關(guān)的致病菌，耶爾森氏菌屬中的3個(gè)物種對人類具有致病性，即鼠疫耶爾森氏菌、假結(jié)核耶爾森氏菌和小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌［12］。金黃桿菌屬屬于黃桿菌科，包含革蘭氏陰性、黃色色素、桿狀和不形成孢子的細(xì)菌種類，它們可以是自由生活或寄生［13］。其以促進(jìn)巴氏殺菌牛乳變質(zhì)和再污染的能力而聞名，從而降低牛乳質(zhì)量，也是引起奶牛乳腺炎的機(jī)會(huì)性病原體［14，15］。這些菌均為致病菌，一般來說，不應(yīng)該存在于牛乳中?？赡苁窃跀D奶過程中與空氣、糞便接觸進(jìn)入牛乳。牧區(qū)應(yīng)盡可能規(guī)范牦牛飼養(yǎng)、擠奶過程，做好擠奶前牦牛乳房的檢查和消毒工作，盡量減少相關(guān)微生物群對產(chǎn)品質(zhì)量的影響。不動(dòng)桿菌屬為原乳中常見的嗜冷菌屬，在天氣寒冷和生產(chǎn)率降低的泌乳后期逐漸占據(jù)優(yōu)勢，但是其大量繁殖會(huì)影響乳成分，導(dǎo)致腐敗變質(zhì)［16-18］。在本論文中不動(dòng)桿菌在年平均氣溫-2.6℃，-3.3℃的稱多縣歇武鎮(zhèn)歇武村和曲麻萊長江村較低，而在年平均氣溫為3℃的玉樹州果青牧場最高。

4 結(jié)論

綜合來看，玉樹地區(qū)不同樣點(diǎn)的牦牛乳Alpha多樣性指數(shù)observed_species差異顯著(P＜0.05)，指數(shù)Chao1、Shannon和Simpson差異不顯著(P＞0.05)，微生物多樣性和豐度相似，微生物均以厚壁菌門和變形菌門為主。