段娜寧，王偉，魏希杰，魏曉麗，徐成體

(1.青海大學(xué)，西寧810013;2.青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，西寧810016)

高寒地區(qū)由于地理與氣候條件特殊，牧草生長季節(jié)短，生長速度緩慢，產(chǎn)量較低，季節(jié)性不平衡問題較為突出。青貯因其營養(yǎng)好、損失小、耐儲(chǔ)存等優(yōu)點(diǎn)可作為高寒地區(qū)解決這個(gè)問題的一種重要手段。燕麥?zhǔn)且环N優(yōu)良的飼料作物，具有產(chǎn)草量高、營養(yǎng)豐富、適口性好等優(yōu)點(diǎn)，是高寒地區(qū)草地畜牧業(yè)持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展中重要的飼草作物之一［1，2］，在青海的一年生人工草地種植面積較廣，在糧改飼項(xiàng)目實(shí)施后，燕麥青貯逐漸成為研究熱點(diǎn)［3］。

青貯是一個(gè)微生物活動(dòng)與化學(xué)變化同時(shí)進(jìn)行的復(fù)雜過程，在這個(gè)過程中，乳酸菌大量繁殖，當(dāng)原料中的乳酸菌積累到一定的程度，不利于青貯的微生物(霉菌、酵母菌等)生長就會(huì)被抑制，從而提高青貯的品質(zhì)、延長青貯的貯藏時(shí)間［4-6］。青貯發(fā)酵過程一般有有氧發(fā)酵、厭氧發(fā)酵、穩(wěn)定期和取用4個(gè)階段［7］，在經(jīng)過前期較短時(shí)間的初始有氧發(fā)酵階段，氧氣耗盡后，進(jìn)入?yún)捬醢l(fā)酵階段，具有厭氧生長能力的乳酸菌開始大量繁殖，持續(xù)繁殖幾周之后青貯的pH值降至4.2左右，發(fā)酵活性降低，進(jìn)入穩(wěn)定期，此時(shí)青貯中的微生物主要以乳酸菌為主導(dǎo)［8］。所以乳酸菌的發(fā)酵及pH值的范圍在燕麥青貯中起著至關(guān)重要的作用。

目前針對(duì)燕麥青貯技術(shù)的研究，國內(nèi)外已有許多研究成果，但在高寒地區(qū)，因青貯技術(shù)的研究開始較晚，針對(duì)燕麥青貯技術(shù)系統(tǒng)性的研究較少，特別是針對(duì)溫度、壓實(shí)密度、含水量等關(guān)鍵因素的研究仍不明確。故而本研究選擇在不同含水量、溫度、壓實(shí)密度條件下對(duì)燕麥草進(jìn)行青貯，利用微生物培養(yǎng)技術(shù)對(duì)青貯中產(chǎn)生的乳酸菌、霉菌酵母菌進(jìn)行培養(yǎng)與檢測(cè)，以期為高寒地區(qū)獲得高品質(zhì)的燕麥青貯飼料提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

燕麥種植于青海省德令哈市試驗(yàn)地，品種為加拿大栽培燕麥，于抽穗期刈割后切短至2～3 cm，按比例計(jì)算質(zhì)量后裝入青貯瓶。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)以影響燕麥青貯最主要的溫度、壓實(shí)密度、含水量3個(gè)條件作為影響因素，每個(gè)因素5個(gè)水平，應(yīng)用三因子二次回歸通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)，試驗(yàn)水平設(shè)計(jì)見表1，各因子的水平編碼見表2。組合處理共23個(gè)，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

表1 試驗(yàn)水平設(shè)計(jì)表

表2 試驗(yàn)組合設(shè)計(jì)表

1.2.2 青貯飼料的制作通過晾曬或噴水的方式將燕麥草的含水量分別調(diào)至35%、44%、58%、71%、80%。再以壓實(shí)密度分別為600 kg·m-3、520 kg·m-3、450 kg·m-3、、380 kg·m-3、300 kg·m-3裝入青貯瓶中，分別保存于15℃、20℃、27.5℃、35℃、40℃的恒溫培養(yǎng)箱中，在青貯的第50d取樣分析微生物并測(cè)定pH值。

1.2.3 微生物分析及pH值測(cè)定乳酸菌、霉菌酵母菌的分離計(jì)數(shù)分別使用MRS(de Man，Rogosa and Sharpe，MRS)培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，PDA)培養(yǎng)基，分離計(jì)數(shù)采用梯度稀釋平板涂布法測(cè)定，其中，乳酸菌使用MGC AnaeroPac C-43厭氧培養(yǎng)袋37℃培養(yǎng)2d，霉菌酵母菌在有氧條件30℃培養(yǎng)2d［9-12］。青貯飼料酸度測(cè)定，取400 mL的燒杯加半杯青貯料，加入蒸餾水浸沒青貯料，不斷地用玻璃棒攪拌，經(jīng)15～20 min后，用濾紙過濾，取適量濾液，用酸度計(jì)測(cè)定其pH值。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)利用DPS、Excel軟件進(jìn)行分析。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均值表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 不同處理下乳酸菌、霉菌酵母菌和pH值的變化情況

2.1.2 壓實(shí)密度、溫度、含水量對(duì)燕麥青貯乳酸菌發(fā)酵結(jié)果分析

由溫度、壓實(shí)密度、含水量3個(gè)因素對(duì)燕麥青貯相互作用所得的乳酸菌含量見表3。根據(jù)23個(gè)試驗(yàn)組合試驗(yàn)結(jié)果可以計(jì)算出所擬和的回歸方程的各項(xiàng)系數(shù)，從而分別得到如下的二次回歸模型:

表3 乳酸菌、霉菌酵母菌、pH值結(jié)果

表4為試驗(yàn)結(jié)果的方差分析和各項(xiàng)回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)結(jié)果，由表4可知，回歸方程顯著性檢驗(yàn)F2=6.21＞F0.01(14，16)=3.62，說明得到的回歸方程顯著;單因素的顯著性檢驗(yàn)中，壓實(shí)密度的分析達(dá)到顯著水平。剔出α=0.10的不顯著項(xiàng)后，建立燕麥青貯乳酸菌產(chǎn)量對(duì)實(shí)驗(yàn)因子的回歸方程為:Y=-22.13X2X3

表4 乳酸菌試驗(yàn)結(jié)果方差分析表

2.1.3 壓實(shí)密度、溫度、含水量對(duì)燕麥青貯霉菌酵母菌發(fā)酵結(jié)果分析

由溫度、壓實(shí)密度、含水量3個(gè)因素對(duì)燕麥青貯相互作用所得的霉菌酵母菌含量結(jié)果見表5。

表5 霉菌酵母菌試驗(yàn)結(jié)果方差分析表

表5為試驗(yàn)結(jié)果的方差分析和各項(xiàng)回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)結(jié)果，由表5可知，回歸方程顯著性檢驗(yàn)F2=1.70＜F0.01(14，16)=3.62，說明得到的回歸方程不顯著。

2.1.4 壓實(shí)密度、溫度、含水量對(duì)燕麥青貯pH值的結(jié)果分析

由溫度、壓實(shí)密度、含水量3個(gè)因素對(duì)燕麥青貯相互作用所得的pH值見表6。

表6 pH值試驗(yàn)結(jié)果方差分析表

表6為試驗(yàn)結(jié)果的方差分析和各項(xiàng)回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)結(jié)果，由表6可知，回歸方程顯著性檢驗(yàn)F2=5.04＞F0.01(14，16)=3.62，說明得到的回歸方程顯著;單因素的顯著性檢驗(yàn)中，壓實(shí)密度與溫度的分析均達(dá)到顯著水平。剔出α=0.10的不顯著項(xiàng)后，建立燕麥青貯pH值對(duì)實(shí)驗(yàn)因子的回歸方程為:

2.2 試驗(yàn)因子分析

2.2.1 主因子效應(yīng)分析

由于各因素處理均經(jīng)無量綱線性編碼代換，偏回歸系數(shù)已經(jīng)不受因素取值的大小和單位的影響，即已標(biāo)準(zhǔn)化，其絕對(duì)值的大小直接反映了變量對(duì)響應(yīng)值的影響程度。因此，壓實(shí)密度、溫度、含水量3個(gè)因素在試驗(yàn)取值范圍內(nèi)對(duì)燕麥青貯乳酸菌發(fā)酵的影響作用大小順序依次為:X1(壓實(shí)密度)＞X2(溫度)＞X3(含水量)，且X1(壓實(shí)密度)、X3(含水量)是正效應(yīng)，X2(溫度)是負(fù)效應(yīng)。壓實(shí)密度、溫度、含水量3個(gè)因素在試驗(yàn)取值范圍內(nèi)對(duì)燕麥青貯pH值的影響作用大小順序依次為:X1(壓實(shí)密度)＞X2(溫度)＞X3(含水量)，且X1(壓實(shí)密度)、X2(含水量)是負(fù)效應(yīng)，X3(溫度)是正效應(yīng)。

2.2.2 單因素效應(yīng)分析

將3個(gè)因素中的2個(gè)固定在零水平，對(duì)數(shù)學(xué)模型進(jìn)行降維分析，分別研究3個(gè)因素對(duì)燕麥青貯乳酸菌數(shù)量的影響，結(jié)果見圖1、2、3。

圖1 壓實(shí)密度與乳酸菌數(shù)量的關(guān)系

圖2 溫度與乳酸菌數(shù)量的關(guān)系

圖3 含水量與乳酸菌數(shù)量的關(guān)系

由圖1、2、3可知隨著壓實(shí)密度、溫度、含水量的增加，乳酸菌的數(shù)量都呈先上升后下降的趨勢(shì)，壓實(shí)密度與乳酸菌數(shù)量的關(guān)系的趨勢(shì)線方程為y1=-4.19x2+57.94x-42.31，計(jì)算轉(zhuǎn)化后可得，當(dāng)壓實(shí)密度為517 kg·m-3時(shí)，乳酸菌發(fā)酵相對(duì)最優(yōu);溫度與乳酸菌數(shù)量的關(guān)系的趨勢(shì)線方程為y=-3.52x2+35.17x+55.41，計(jì)算轉(zhuǎn)化后可得，當(dāng)溫度為27.5℃時(shí)，乳酸菌發(fā)酵相對(duì)最優(yōu);溫度與乳酸菌數(shù)量的關(guān)系的趨勢(shì)線方程為y=-5.19x2+51.90x+12.03，計(jì)算轉(zhuǎn)化后可得，當(dāng)含水量為58%時(shí)，乳酸菌發(fā)酵相對(duì)最優(yōu)。

圖5 溫度與pH值的關(guān)系

圖6 含水量與pH值的關(guān)系

由圖4、5、6可知，隨著壓實(shí)密度、溫度、含水量的增加，pH值呈先減小后增大的趨勢(shì)，壓實(shí)密度與pH值關(guān)系的趨勢(shì)線方程為y=23.27x2-24.80x+10.92，計(jì)算轉(zhuǎn)化后可得，當(dāng)壓實(shí)密度為530 kg·m-3時(shí)，pH值最優(yōu);溫度與pH值的關(guān)系的趨勢(shì)線方程為y=0.003x2-0.195x+7.393，計(jì)算轉(zhuǎn)化后可得，當(dāng)溫度為32.5℃時(shí)，pH值最優(yōu);溫度與pH值的關(guān)系的趨勢(shì)線方程為y=12.883x2-13.67x+7.8794，計(jì)算轉(zhuǎn)化后可得，當(dāng)含水量為53%時(shí)，pH值最優(yōu)。

圖4 壓實(shí)密度與pH值的關(guān)系

2.3 試驗(yàn)因子間交互效應(yīng)分析

2.3.1 從試驗(yàn)回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)可以看出，溫度(X2)與含水量(X3)的互作效應(yīng)對(duì)乳酸菌的數(shù)量影響較明顯，兩因子互作效應(yīng)分析見表7。

表7 溫度(X2)與含水量(X3)兩因子互作效應(yīng)的乳酸菌含量

從表7可知，乳酸菌的含量都是隨著溫度和含水量的增大呈現(xiàn)先上升達(dá)到某一點(diǎn)后開始下降的趨勢(shì)，當(dāng)含水量處于35%～58%時(shí)，隨著溫度的增大乳酸菌的含量逐漸增大，當(dāng)含水量處于58%～80%水平時(shí)，隨著溫度的增大，乳酸菌含量明顯較少，在溫度與含水量處于27.5℃、58%時(shí)，兩因子交互作用的青貯乳酸菌發(fā)酵最優(yōu)。

2.3.2 從試驗(yàn)回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)可以看出，壓實(shí)密度(X1)與溫度(X2)、溫度(X2)與含水量(X3)的互作效應(yīng)對(duì)pH值的數(shù)值影響較明顯，兩因子互作效應(yīng)分析見表8;

表8 壓實(shí)密度(X1)與溫度(X2)兩因子互作效應(yīng)對(duì)pH值關(guān)系

從表8可知，pH值隨著溫度和壓實(shí)密度的增減小呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢(shì)，當(dāng)溫度為20℃～27.5℃范圍時(shí)，pH值較低，當(dāng)壓實(shí)密度為450 kg·m-3～490 kg·m-3時(shí)，pH值較低。

從表9可知，pH值隨著溫度和壓實(shí)密度的增減小呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢(shì)，當(dāng)溫度為20℃～27.5℃范 圍 時(shí)，pH值 最 優(yōu)，當(dāng) 壓 實(shí) 密 度 為450 kg·m-3～490 kg·m-3時(shí)，pH值最優(yōu)。

表9 溫度(X2)與含水量(X3)兩因子互作效應(yīng)對(duì)pH值關(guān)系

2.4 試驗(yàn)結(jié)果的驗(yàn)證及優(yōu)化

本試驗(yàn)采用頻率分析法分析回歸模型以找到最佳結(jié)果。通過DPS軟件分析可知，乳酸菌數(shù)量大于102.09的方案有23個(gè)，對(duì)數(shù)學(xué)回歸模型分析的結(jié)果列于表10。

表10 青貯優(yōu)化方案中乳酸菌各變量取值的頻率分布

從表10可知，在95%的置信區(qū)間內(nèi)燕麥青貯乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)量大于102.09的優(yōu)化方案為:壓實(shí)密度520 kg·m-3，溫度27.5℃，含水量58%。

3 討論

本研究中，壓實(shí)密度、溫度、含水量3個(gè)因素在試驗(yàn)取值范圍內(nèi)對(duì)燕麥青貯乳酸菌發(fā)酵及pH值的影響作用最大的是壓實(shí)密度，其次是溫度，相對(duì)影響較小的是含水量。且對(duì)燕麥青貯乳酸菌發(fā)酵壓實(shí)密度與含水量是正效應(yīng)，溫度是負(fù)效應(yīng);對(duì)pH值的影響壓實(shí)密度、含水量是負(fù)效應(yīng)，溫度是正效應(yīng)。

3.1 不同壓實(shí)密度對(duì)高寒地區(qū)燕麥青貯微生物發(fā)酵及pH值的影響

壓實(shí)密度是青貯的重要參數(shù)之一，密度太低會(huì)使青貯環(huán)境中的空氣過多，氧氣流動(dòng)速度較高，不利于青貯的微生物會(huì)大量繁殖，從而影響了乳酸菌的發(fā)酵，使青貯發(fā)霉變質(zhì)，營養(yǎng)物質(zhì)大量流失［13，14］。理論上，壓實(shí)密度越高越有益于青貯，但李海［15］、Muck RE［16］對(duì)內(nèi)蒙古草原天然牧草青貯研究后發(fā)現(xiàn)，將青貯密度控制在350 kg·m-3～400 kg·m-3范圍內(nèi)青貯，青貯料的感官品質(zhì)、營養(yǎng)品質(zhì)、發(fā)酵品質(zhì)、貯成率及飼喂價(jià)值均顯著高于其它處理。所以，燕麥青貯最佳壓實(shí)密度可能因?yàn)椴煌瑮l件而存在差異，本研究中，隨著壓實(shí)密度的增加，乳酸菌的數(shù)量呈先上升后下降的趨勢(shì)，pH值呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢(shì)，當(dāng)壓實(shí)密度為530 kg·m-3時(shí)乳酸菌發(fā)酵最優(yōu)，大于李海［15］的研究結(jié)果，這可能是因?yàn)榈赜颉囟?、早晚溫差、海拔等原因不同，乳酸菌最適壓實(shí)密度有較大差異，當(dāng)壓實(shí)密度在500 kg·m-3～550 kg·m-3范圍時(shí)，pH值均為4.29，均為優(yōu)。

3.2 不同溫度對(duì)高寒地區(qū)燕麥青貯微生物發(fā)酵及pH值的影響

溫度變化能夠改變附生乳酸菌菌群，因此溫度過高或者過低都不利用燕麥青貯發(fā)酵的進(jìn)行［17］。本研究中，隨著溫度的上升，乳酸菌的含量呈先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)溫度為27.5℃時(shí)，乳酸菌含量最大，此時(shí)pH值也較低為4.28，這與Prochnow［18，19］等研究表明的燕麥青貯最適青貯溫度為25℃～30℃的結(jié)果大致一致。表明在高寒地區(qū)，最適宜燕麥青貯乳酸菌發(fā)酵的溫度為27.5℃左右。

3.3 不同含水量對(duì)高寒地區(qū)燕麥青貯微生物發(fā)酵及pH的影響

在厭氧發(fā)酵開始之前，除了青貯原料的特性、空氣、存儲(chǔ)時(shí)間、添加劑等因素外，水分也是影響青貯發(fā)酵的關(guān)鍵因素［20］，最終pH值和微生物等特性與材料的初始含水量直接相關(guān)［21］，含水量過高或過低都不利于青貯發(fā)酵［22］。本研究中，隨著含水量的上升，乳酸菌的含量同樣呈先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)含水量為58%時(shí)，乳酸菌含量達(dá)到最大值，據(jù)李蕾蕾［23］等在青南牧區(qū)開展的研究表明，在高海拔地區(qū)，有利于乳酸菌活動(dòng)繁殖的含水量在50%～60%之間，低于其它研究中的65%～70%，這與本研究的結(jié)果較為一致，表明在高海拔地區(qū)，報(bào)道較多的65%～70%之間的含水量并不適合青貯的乳酸菌發(fā)酵;在含水量為50%～60%之間時(shí)，pH值為4.27～4.29之間，均為優(yōu)。綜合表明在高海拔地區(qū)，含水量在55%～60%時(shí)最適宜燕麥青貯微生物發(fā)酵與pH值的降低。

4 結(jié)論

綜上，以溫度、含水量、壓實(shí)密度為試驗(yàn)因素，采用三因子二次回歸通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)的方法，通過乳酸菌、霉菌酵母菌的數(shù)量變化以及pH值可知:壓實(shí)密度為500 kg·m-3～550 kg·m-3、溫度為25℃～30℃、含水量為55%～60%時(shí)，最適宜高寒地區(qū)燕麥青貯微生物的發(fā)酵。