陳 爽，唐笑梅，麻昊陽

（南京醫(yī)科大學兒科學院，江蘇南京 210029）

急 性 腎 損 傷（acute kidney injury，AKI）是 一種常見的臨床綜合征，其發(fā)病率高且呈逐年上升趨勢。2015年一項橫斷面研究表明，我國住院病人AKI檢出率高達2%，預測有290萬AKI病人住院治療，約有70萬患者死于AKI[1]，而且存活的患者也易進展至慢性腎病乃至終末期腎臟病[2]。研究證實，急性腎小管壞死是AKI 發(fā)生最常見的原因[3]。在疾病狀態(tài)下，腎小管上皮細胞對缺血缺氧、毒素等刺激非常敏感，極易受到損傷，發(fā)生變性、凋亡、壞死、脫落[4]。蒲公英甾醇是一種從蒲公英中分離出來的五環(huán)三萜成分，以往的研究顯示其發(fā)揮著較好的抗炎作用[5-7]。中性粒細胞明膠酶相關的脂蛋 白 (Neutrophil gelatinase-associated lipoealin，NGAL)已被確定為早期檢測AKI的有效的生物標志物，有研究表明，AKI患者的NGAL水平在可檢測到的血清肌酐升高前24～48 h即顯著升高[8]。本研究探討蒲公英甾醇是否通過抑制炎癥進而改善順鉑誘導的急性腎損傷，為臨床治療急性腎損傷提供理論依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物SPF級C57/B6小鼠 雄性C57/B6小鼠24只，年齡8周，體質量22～25 g，購于維通利華實驗動物中心（合格證編號：20210416Abzz0600000683；倫理編號：IACUC-2007001）

1.2 試劑 蒲公英甾醇(純度99.9%，成都瑞芬思生物科技有限公司，貨號：1059-14-9)，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6（IL-6）酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(美國Novus Biological公司)。凍干型注射用順鉑（山東齊魯制藥，國藥準字H20023461，規(guī)格：凍干粉：20 mg）。GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)多克隆抗體（武漢塞維爾生物科技）。ECL顯色試劑盒（上海天能公司，貨號：180-5001）。Trizol、cDNA一鏈合成試劑盒（日本Takara公司，貨號：6210A）。qRT-PCR試劑盒（中國諾維贊生物技術有限公司，貨號：Q221-01）。PAGE凝膠制備試劑盒（上海雅酶，貨號：PG112）。

2 實驗方法和步驟

2.1 動物模型的制備 將小鼠置于SPF級動物房飼養(yǎng)1周（小鼠自由飲水攝食，室溫約25°C，濕度約50%）。隨機分為 3 組：空白組（n=8）、順鉑組（CP）（n=8）、蒲公英甾醇+順鉑組（干預）（n=8）。于造模前24 h給與干預組蒲公英甾醇（10 mg/kg），腹腔注射，固定時間點每日一次直至實驗結束。其余兩組腹腔注射等量生理鹽水，1次/d，直至實驗結束。蒲公英甾醇預治療24 h后，給予CP組和蒲公英甾醇+順鉑組一次性腹腔注射順鉑22 mg/kg，誘導急性腎損傷，其余小鼠腹腔注射等量生理鹽水。每日記錄小鼠精神狀況及體質量。于注射順鉑72 h后處死小鼠，經(jīng)心臟采血，并留取雙側腎臟組織樣本。

2.2 石蠟標本制作與過碘酸雪夫染色（PAS）染色 新鮮腎臟組織置于4%多聚甲醛中，固定24～48 h，經(jīng)脫水，包埋后切片（3 μm）。于65 ℃烘箱中烘烤40 min后保存于切片盒。將石蠟切片放至65 ℃烘箱烘烤1 h直至石蠟熔化，經(jīng)脫蠟、乙醇梯度水化后置于1%過碘酸氧化10 min（37 ℃），雙蒸水充分洗滌，擦干水分放入Schiff氏液，浸泡40 min，自來水沖洗30 min，蘇木素染細胞核1 min。1%鹽酸酒精分化，自來水沖洗，返藍后流水沖洗。梯度乙醇脫水、透明、封片，然后進行鏡下觀察。

2.3 腎組織小管損傷評分 選用PAS染色病理切片，在顯微鏡下觀察腎臟組織病理形態(tài)，每張切片隨機選取20個皮質區(qū)視野（×200），觀察4種主要的急性腎損傷相關表現(xiàn)（腎小管上皮細胞變性，腎小管的腫脹、剝脫，管形形成，刷狀緣丟失），其評分標準如下[9]，在任意腎單位中小管損傷所占比例：①正常腎小管：0分；②損傷＜25%：1分；③25%＜損傷＜50%：2分；④50%＜損傷＜75%：3分；⑤損傷＞75%：4分。

2.4 血清肌酐、尿素氮檢測 小鼠麻醉后，經(jīng)心臟采血留取小鼠血液，并用抗凝管收集小鼠血液。離心5 000 r/min（20 min），吸取上清，置于 -80 ℃冰箱保存。吸取70 μL上清并用140 μL生理鹽水稀釋3倍（加樣過程中切勿產(chǎn)生氣泡），采用生化分析儀（羅氏公司，型號：cobas8000）檢測血肌酐（Scr）及尿素氮（BUN）水平。

2.5 腎臟組織NGAL mRNA表達水平的檢測 取腎臟組織，提取總RNA，逆轉錄為cDNA，QPCR檢測NGAL表達水平。引物序列如下：

2.6 腎臟組織NGAL蛋白表達水平的檢測 取腎臟組織加入組織蛋白提取液，勻漿后按照二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒方法測定蛋白濃度，加入SDSPAGE蛋白上樣緩沖液(SDS-PAGE Sample Loading Buffer，5X)，沸水水浴10 min，配制10%的分離膠和12%的濃縮膠，加樣，65 V，電泳45 min之后改為130 V恒壓電泳的方法電泳；當溴酚藍指示電泳到達底部或者根據(jù)預染蛋白質分子量的大小，判斷是否停止電泳。隨后轉膜，一抗、二抗孵育，用凝膠成像系統(tǒng)成像，進行灰度分析。

2.7 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，實驗結果數(shù)據(jù)以（±s）表示，使用one-way ANOVA分析，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 實驗結果

3.1 3組小鼠血尿素氮和血肌酐水平比較 順鉑組相較于空白組BUN(18.30±0.32 mmol/L，57.75±0.65 mmol/L)及SCr(19.79±0.49，80.03±0.95 μmol/L)水平均上升，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；蒲公英甾醇處理后的干預組小鼠相較于順鉑組血清BUN(36.55±0.38 mmol/L，57.75±0.65 mmol/L) 及 Scr(39.65±0.62 μmol/L，80.03±0.95 μmol/L)水平均降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05），見圖1A、1B。

圖1 3組小鼠血尿素氮和血肌酐水平比較

3.2 3組小鼠腎小管損傷情況比較 PAS染色發(fā)現(xiàn)，由順鉑引起的腎小管上皮細胞腫脹、剝脫及壞死，腎小管擴張及管形形成，基底膜刷狀緣消失等病理改變在蒲公英甾醇干預組均得到顯著改善（見圖2A），與腎功能改善的結果一致。應用腎小管損傷評分對過碘酸雪夫染色（PAS）染色進行半定量分析，空白組小管評分為0，順鉑組小鼠的小管評分顯著高于蒲公英甾醇干預組（26.00±0.96，13.13±1.63）,差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05），見圖2B。

圖2 3組小鼠腎小管損傷情況比較

3.3 3組小鼠炎癥反應水平比較 ELISA結果顯示，與空白組相比，順鉑組小鼠血清TNF-α和IL-6的水平均升高，經(jīng)蒲公英甾醇干預后TNF-α和IL-6的水平均降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05），見圖3。

圖3 3組小鼠炎癥反應水平比較

3.4 3組小鼠NGAL水平比較 順鉑組小鼠NGAL水平高于空白組，經(jīng)蒲公英甾醇干預后可降低順鉑誘導的AKI模型小鼠中NGAL的mRNA和蛋白質水平，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖4。

圖4 3組小鼠NGALmRNA和蛋白質水平

4 討論

急性腎損傷(AKI)是由多種病因引起的腎功能快速下降而出現(xiàn)的復雜臨床綜合征，其發(fā)病率逐年上升，病死率居高不下，是腎臟病中的急危重癥。近年研究證明，AKI是引起慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)的重要原因，AKI 增加了CKD的風險[10]。而多項研究表明炎癥在AKI向CKD轉變的進程中發(fā)揮重要作用，AKI引發(fā)的炎性反應可激活炎癥信號通路[11]，進一步導致腎臟損傷移至纖維化的發(fā)生。因此，當AKI發(fā)生后，有效的控制炎癥對治療AKI及抑制AKI向CKD的進展有重要意義。

既往在對小鼠酒精性和免疫性肝損傷的研究中發(fā)現(xiàn)，蒲公英甾醇能夠顯著降低炎性介質白細胞介素-1β、IL-4、IL-6、腫瘤壞死因子-a、γ干擾素等水平，從而對酒精性肝損傷和伴刀豆球蛋白誘導的免疫性肝臟損傷起保護作用[12]。而在乳腺炎的相關研究中發(fā)現(xiàn)蒲公英甾醇可降低大鼠iNOS和COX-2 mRNA表達，抑制NF-κB、MAPKs信號通路和促炎細胞因子的產(chǎn)生，對乳腺炎發(fā)揮抗炎作用[13]。蒲公英甾醇可能通過TGF-/Smad通路對小鼠耳廓痤瘡模型發(fā)揮治療作用，調節(jié)炎性因子的表達、改善小鼠胸腺組織形態(tài)[14]。本實驗結果表明，在順鉑誘導的AKI模型中，順鉑會導致腎小管細胞損傷，壞死，誘發(fā)急性炎癥反應。而使用蒲公英甾醇干預可有效降低順鉑誘導的AKI模型小鼠腎臟組織TNF-α、IL-6的水平，緩解炎性反應，使得腎小管上皮細胞變性，腎小管的腫脹、剝脫，管形形成，刷狀緣丟失等損傷顯著減輕，改善腎臟結構與功能。NGAL是一種敏感的腎小管損傷標志物。我們通過QPCR和Western-blot檢測發(fā)現(xiàn)蒲公英甾醇可降低順鉑誘導的AKI模型小鼠NGAL的mRNA和蛋白質水平。表明蒲公英甾醇在損傷發(fā)生時可通過抑制炎癥因子的表達，發(fā)揮抗炎作用，進而減輕腎臟損傷。

綜上所述，本研究探討了腎臟疾病中蒲公英甾醇對AKI的影響，在順鉑誘導的急性腎損傷模型里，發(fā)現(xiàn)蒲公英甾醇可通過減輕炎癥反應進而減輕腎臟損傷，為急性腎損傷的治療提供新思路。