莫湘桂，趙 琴，譚 墾

（中國科學院 西雙版納熱帶植物園，云南 昆明 650223）

由于濫用抗生素和微生物基因突變，抗生素耐藥性細菌的增加已對全球人類健康造成嚴重威脅[1]。新型抗感染劑的探索和開發(fā)是近年來研究的熱點，天然抗菌肽（antimicrobial peptide，AMP）被認為是設計新型抗生素的優(yōu)秀模板。與傳統(tǒng)抗菌劑相比，AMP 具有廣譜、快速的抗菌性，通常不誘導細菌耐藥性，副作用少，且與傳統(tǒng)抗生素結合能表現(xiàn)出協(xié)同活性[2]。目前，多種AMP 已被批準用于臨床應用和食品儲存[3]，未來還可用作新型抗感染劑[4]。

節(jié)肢動物沒有復雜的后天免疫系統(tǒng)，主要依靠體內合成的AMP 抵御病原微生物入侵[5]。胡蜂是一類膜翅目昆蟲，其毒囊是一種高度專一的防御和攻擊器官。近年來，胡蜂蜂毒作為豐富的藥理活性肽來源而備受關注[6]。研究表明：胡蜂蜂毒主要由酶、多肽、胺類以及其他蛋白組成，其中多肽主要包括胡蜂蜂毒肽（mastoparan，MP）、胡蜂化學趨向性肽（vespid chemotactic peptide，VCP）和肥大細胞脫顆粒肽（mast cell degranulating peptide，MCD）等[7-8]。MP 在胡蜂蜂毒中的含量最豐富，是胡蜂蜂毒中非常重要的兩性陽離子多肽，具有誘導肥大細胞脫顆粒活性，可促使組胺釋放，從而引發(fā)炎癥[9]。MP 類多肽有抗菌活性，當MP 單獨使用或是將其與其他抗生素聯(lián)合使用有較好的抗菌效果，可作為對抗多重抗生素耐藥菌的有效療法[10]。

凹紋胡蜂（Vespa velutina）隸屬于胡蜂科（Vespidae）胡蜂屬（Vespa），在云南省境內分布廣泛、養(yǎng)殖規(guī)模較大，是科學研究的良好材料。但已有研究大多集中于其生物學特性和入侵防治研究，對其體內多肽的研究很少[11]。本研究通過提取凹紋胡蜂毒囊中的RNA，反轉錄PCR 構建cDNA文庫；利用特殊引物篩選出目標基因，克隆目標基因后測序，并根據(jù)序列合成新多肽，再檢測新多肽的抗菌活性和抗氧化性，以期為相關藥物的開發(fā)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

1.2 RNA 提取

使 用TransZol Up Plus RNA Kit（TransGen，中國北京）在超凈臺提取RNA；用BioPhotometer 測定所得RNA 含量，并將RNA 置于-80 ℃冰箱保存。

1.3 毒腺cDNA 文庫構建

使用 SMARTTMcDNA Construction Kit（Clontech，加拿大）合成cDNA，第1 次PCR 合成的cDNA 用作第2 次PCR 的模板。根據(jù)NCBI 中胡蜂天然抗菌肽前體肽的信號肽設計特殊引物S1：5′-ATGAAGTATATAGTTTG-3′，用于篩選編碼A MP 前體的cDNA；使用FastPure Extraction Mini Kit（Vazyme，中國南京）回收PCR 產(chǎn)物，并配以pMD19-T 載體（TaKaRa，中國大連）；最后，將PCR 產(chǎn)物克隆轉載到大腸桿菌DH5α 細胞中，并送北京博邁德基因技術有限公司測序。使用DNAMAN 10 對測序數(shù)據(jù)進行分析，將目標堿基序列翻譯成肽序列；然后在NCBI 數(shù)據(jù)庫中比對，找出新的多肽序列；由武漢百意欣生物技術有限公司根據(jù)基因片段合成多肽。

1.4 多肽生物活性檢測

1.4.1 抑菌活性檢測

試驗用革蘭氏陽性菌包括金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 25923、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）ATCC 1965、糞腸球菌（Enterococcus faecalis）ATCC 29212；試驗用革蘭氏陰性菌包括大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC 25922 和肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）ATCC 10 031。

檢測方法：采用液體法進行測定。在96 孔板中，分別加入上述5 種試驗菌液各50 μL，每種菌液各7 孔；然后分別加入50 μL 質量濃度為 6.25、12.50、25.00、50.00、100.00 和200.00 μg/mL多肽溶液（溶劑：甲醇），以加入甲醇的菌液作為空白對照。加入多肽或甲醇的菌液在37 ℃ 培養(yǎng)16～18 h，使用光度計（722N，上海儀電）測定其在600 nm 處的吸光度，確定在各質量濃度下多肽能否抑制細菌生長，計算抑菌率：抑菌率=（A空白對照-A多肽樣品）/A空白對照×100%。抑菌率＞50%時，說明多肽有抑菌效果；抑菌率＞90%時，說明多肽有較好抑菌效果。試驗進行3 次技術重復和3 次試驗重復。

1.4.2 抗氧化性檢測

（1）清除DPPH 自由基能力檢測

在96 孔板中加入濃度為1×10-4mol/L 的DPPH甲醇溶液190 μL 和不同質量濃度（5、10、20、50、100 和200 μg/mL）的VV-VP-2 溶液10 μL，混合均勻，以只加DPPH 的孔為空白對照，加2 μg/mL維生素C 溶液為陽性對照，加甲醇溶液為陰性對照。37 ℃孵化30 min，使用光度計測定517 nm處各樣品的吸光度，并計算清除率：清除率=（A空白對照-A樣品）/A空白對照×100%。試驗進行3 次技術重復和3 次試驗重復。

（2）清除ABTS 自由基能力檢測

從目前的農(nóng)機監(jiān)理服務狀況來看，只要滿足業(yè)務要求就可以辦理，這種操作有效地減少了農(nóng)機手重復辦理的機會，對于那些長途跋涉前來辦理手續(xù)的農(nóng)機手，如果自身手續(xù)不全，可以先將代理證發(fā)給他們，然后讓他們再補齊證件所需材料，這樣，不會耽誤農(nóng)民在辦理證件期間使用農(nóng)機設備，在很大程度上消減了操作流程。

以甲醇為溶劑配置ABTS 儲備液（7.4 mmol/L）和K2S2O8儲備液（2.6 mmol/L），將5 mL ABTS儲備液和88 μL K2S2O8儲備液混勻，靜置12～16 h，用甲醇稀釋40 倍制成ABTS 工作液備用。在96 孔板中加入ABTS 工作液200 μL 和不同質量濃度（5、10、20、50、100 和200 μg/mL）的VV-VP-2 溶液10 μL，靜置6 min，使用光度計測定734 nm 處各樣品的吸光度；以只加ABTS 工作液的孔為空白對照，加2 μg/mL 維生素C 溶液為陽性對照，加甲醇溶液為陰性對照。計算清除率：清除率=（A空白對照-A樣品）/A空白對照×100%。

（3）清除·OH 自由基能力檢測

向96 孔板中加入不同質量濃度的VV-VP-2溶液（5、10、20、50、100 和200 μg/mL）10 μL、蒸餾水70 μL、9.1 mmol/L 水楊酸—甲醇溶液10 μL、9 mmol/L FeSO4溶液10 μL 和30%H2O2溶液10 μL，混勻后用光度計測定510 nm 處的吸光度（A1）；用蒸餾水代替FeSO4溶液，用光度計測定510 nm 處的吸光度（A2）；用蒸餾水代替多肽樣品，用光度計測定510 nm 處的吸光度（A3）。以加2 μg/mL 維生素C 溶液為陽性對照，甲醇溶液為陰性對照。計算清除率：清除率=[1-（A1-A2）/A3]×100%。試驗進行3 次技術重復和3 次試驗重復。

1.5 數(shù)據(jù)分析

測序結果使用Dnaman 處理；活性檢測數(shù)據(jù)使用Excel 2010 進行整理，使用SPSS 20.0 進行單因素方差分析（One-way ANOVA），數(shù)據(jù)用“平均值±標準差”表示；用Origin 9.0 繪圖。

2 結果與分析

2.1 cDNA 文庫

在NCBI 上對所得多肽序列進行比對，發(fā)現(xiàn)得到的多肽為Vespid chemotactic peptide（VCP）家族，從中發(fā)現(xiàn)1 種新多肽，命名為VV-VP-2，其氨基酸序列為FFPIIAKLLGGFLGKK。

2.2 抑菌活性

由表1 可知：100 和200 μg/mL 的多肽VVVP-2 對金黃色葡萄球菌有抑制作用，抑菌率分別為（51.7±4.0）% 和（56.6±2.0）% ；50、100 和200 μg/mL 的多肽VV-VP-2 對肺炎克雷伯菌有抑制作用，抑菌率分別為（59.8±0.9）%、（63.8±3.6）%和（68.5±0.0）%。

表1 新多肽在不同質量濃度下對5 種細菌的抑制率Tab.1 The inhibition rate of five types of bacteria by new peptide at different mass concentrations %

2.3 抗氧化活性

由圖1 可知：50、100 和200 μg/mL 的蜂毒多肽VV-VP-2 對DPPH、ABTS 和·OH 自由基均有極顯著的清除能力，說明＞50 μg/mL 的新多肽具有一定的抗氧化能力。其中，新多肽對DPPH自由基的清除率最高，說明新多肽對DPPH 自由基有較好的抗氧化性。

圖1 不同質量濃度新多肽對DPPH、ABTS 和·OH 自由基的清除率Fig.1 The DPPH,ABTS and ·OH scavenging rate of new peptide at different mass concentrations

3 討論

3.1 抑菌活性

多數(shù)節(jié)肢動物的毒液都可以分離出濃度和活性都較高的抗菌肽，對很多細菌和真菌都有抑制生長甚至是殺滅的作用[12]。這些多肽除了具有抗菌活性外，還具有一些其他生物學活性，如抗病毒活性、抗腫瘤活性和免疫調節(jié)活性等[13]。BAEK 等[6]從黑胸蜾蠃（Orancistrocerus drewseni）和點蜾蠃（Eumenes pomiformi）的毒液中發(fā)現(xiàn)：VCP 家族多肽OdVP1、OdVP2、EpVP1、EpVP2a和EpVP2b 具有抗菌活性，對多種菌株的最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）為5～200 μmol/L；在黃胡蜂（Vespula lewisii)毒液中發(fā)現(xiàn)的Mastoparan 對多種菌株的MIC 為5～50 μmol/L[14]；從黑盾胡蜂（Vespa bicolor）毒液中分離出的多肽VESP-VB1 和MP-VB1 對多種標準菌株和抗藥性菌株的MIC 均在1～120 μg/mL[7]。本研究發(fā)現(xiàn)的凹紋胡蜂蜂毒新多肽VV-VP-2 僅在50～200 μg/mL 時對金黃色葡萄球菌及肺炎克雷伯菌有一定抑制效果，對其他菌的抑菌效果較差，這可能與多肽溶液的質量濃度過低有關。與其他胡蜂的蜂毒多肽相比，本研究識別出的VVVP-2 抑菌效果一般，可通過對多肽序列進行修飾或與其他抗生素聯(lián)合使用以提高抑菌效果。

3.2 抗氧化性

抗氧化劑包括天然抗氧化劑和化學合成抗氧化劑?；瘜W合成的抗氧化劑（如丁基羥基茴香醚和二丁基羥基甲苯等）在抗氧化的同時會帶來一些毒副作用。天然抗氧化肽具有毒副作用低和效率高等特點，成為國內外科研人員研究的熱點。由基因編碼的抗氧化肽目前主要在蛙科動物中發(fā)現(xiàn)。CAO 等[15]從青蛙（Odorrana andersonii）皮膚中分離出的Cathelicidin-OA1 在濃度為32 μmol/L時可清除90%的ABTS 自由基，具有較強的抗氧化性；同種青蛙皮膚中分離出的OA-GL21 在濃度為500 μmol/L 時可清除約70%的ABTS[16]，抗氧化性較弱。從本研究識別出的新多肽對3 種自由基的清除率來看，多肽VV-VP-2 的質量濃度大于50 μg/mL 時具有一定的抗氧化能力，但其質量濃度為200 μg/mL 時（約為120 μmol/L）對3 種自由基的清除率均未超過30%，與前述抗氧化肽相比抗氧化能力不強。因此，多肽VV-VP-2 用于開發(fā)為抗氧化藥物時，還需對其進行修飾進而增加其抗氧化能力。

本研究識別出的凹紋胡蜂蜂毒多肽VV-VP-2 對部分試驗菌株有明顯抑制作用，并且有一定抗氧化能力。VV-VP-2 可用于開發(fā)新型抗菌藥物和新型抗氧化劑。但本研究僅找出了具有生物活性的新多肽，后續(xù)還需進一步開展動物試驗、臨床試驗以及通過修飾和合成等方法運用多肽進行制藥。目前，多肽已經(jīng)在醫(yī)藥和生物技術領域得到了廣泛的關注和應用，天然活性多肽藥物的開發(fā)將會成為未來新藥開發(fā)的重要部分。

4 結論

本試驗通過構建凹紋胡蜂蜂毒多肽cDNA 文庫，識別出新多肽VV-VP-2。該多肽具有一定的抗菌活性和抗氧化活性，為抗菌和抗氧化藥物的開發(fā)提供了模板。