孫大寬，馬 莉，楊宏艷，馬煥成，鄭晟靖，唐軍榮

（1.西南林業(yè)大學(xué)，西南地區(qū)生物多樣性保育國家林業(yè)和草原局重點實驗室，云南 昆明 650224；2.紅河州森林和草原資源管理站，云南 蒙自 661199）

木棉（Bombax ceiba）是木棉科（Bombacaceae）木棉屬（Bombax）落葉高大喬木，分布于中國云南、四川、貴州和廣西等?。▍^(qū)）的亞熱帶地區(qū)[1]。木棉果實中含有大量的木棉纖維，纖維壁薄，中空率高達97%，具有很好的保暖性和耐熱性[2-3]；木棉纖維作為一種天然纖維素纖維，是良好的填充材料和紡織原料[4]。木棉也是中國南部地區(qū)及南亞國家的常用民間藥物，在止血、解暑和治療胃腸道疾病等方面有廣泛的應(yīng)用[5]。木棉花作為傳統(tǒng)廣東涼茶的主要原料，食用歷史悠久，食藥價值高[6]。此外，木棉樹形優(yōu)美，花朵漂亮，常作為園林綠化的行道樹[7]。更為重要的是，木棉作為干熱河谷地區(qū)的優(yōu)勢種，適應(yīng)性強，是一種兼具經(jīng)濟效益和生態(tài)效益的多用途樹種。

木棉可通過種子、扦插和嫁接等方式進行繁殖，但對于優(yōu)良單株的快速繁殖，植物組織培養(yǎng)是一種快速高效的繁殖方法，且能夠保持母株的優(yōu)良性狀。組培苗生根是植物組織培養(yǎng)技術(shù)的重要環(huán)節(jié)，是決定植物組織培養(yǎng)是否成功的關(guān)鍵因素，也是植物組培快繁體系中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[8]。但組培苗生根是一個復(fù)雜的生理過程，特別是木本植物生根誘導(dǎo)受多種因素影響，如培養(yǎng)基類型[9]、組成成分[10]、激素種類和濃度[11]及基因型等[12]，故生根相對更加困難[13-14]，且組培生根苗的根系質(zhì)量直接影響其移栽成活后苗木的質(zhì)量。組培苗生根是由無根的頂芽在可控的環(huán)境中培養(yǎng)獲得，木質(zhì)化程度極低，且是苗木培育的早期，因此不定根誘導(dǎo)可控性強、可塑性高?；诖?，本研究以木棉組培叢生芽為材料，研究不同激素、縱向劃痕和暗培養(yǎng)等處理對木棉組培苗生根的影響，同時對木棉組培苗生根過程進行動態(tài)觀察，分析其內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化特點，從而優(yōu)化木棉組培苗的生根條件，進一步完善木棉的組培快繁體系，為后續(xù)木棉組培苗移栽煉苗以及不定根的定向調(diào)控提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

以MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.05 mg/L+瓊脂4.2 g/L+蔗糖40 g/L 及pH 5.8 的培養(yǎng)基上培養(yǎng)50 d的木棉組培叢生芽為試驗材料。

1.2 試驗方法

1.2.1 生長素處理的生根試驗

生根的生長素為NAA 和IBA，其中，NAA質(zhì)量濃度為0、0.2、0.4、0.8、1.2 和1.6 mg/L，IBA 質(zhì)量濃度為0、0.4、0.8、1.2、1.6 和2.0 mg/L。采用單獨添加NAA 或IBA 以及在此基礎(chǔ)上選擇部分質(zhì)量濃度的NAA+IBA 組合進行生根試驗，以不添加NAA 和IBA 為對照，共16 個處理（表1）。所有處理均以1/2 MS 為基本培養(yǎng)基，添加蔗糖15 g/L、瓊脂4.2 g/L 和活性炭0.2 g/L，pH 5.8。培養(yǎng)條件為光照12 h/d，光照強度為1 200 lx，培養(yǎng)溫度為（25±2）℃。每個處理設(shè)3 次重復(fù)，每個重復(fù)30 株，共90 株，50 d 后統(tǒng)計數(shù)據(jù)，分析不同處理對木棉組培苗生根率的影響。

1.2.2 機械損傷處理的生根試驗

對生根材料的基部進行縱向劃痕機械損傷處理。用接種刀在基部分別縱向劃出0、1、2 和3 個劃痕，劃破皮層即可。使用的培養(yǎng)基配方為1/2 MS+IBA 1.6 mg/L+NAA 0.4 mg/L+蔗糖15 g/L+瓊脂4.2 g/L+活性炭0.2 g/L，pH 5.8。每個處理接種15 瓶，每瓶6 株，重復(fù)3 次。培養(yǎng)條件及統(tǒng)計方法同1.2.1 節(jié)。

1.2.3 暗培養(yǎng)處理的生根試驗

試驗開始時即對木棉組培叢生芽進行不同時間的暗培養(yǎng)，設(shè)置遮光時長分別為0、3、6、9和12 d，之后轉(zhuǎn)入正常培養(yǎng)條件。使用的培養(yǎng)基配方為1/2 MS+IBA 1.6 mg/L+NAA 0.4 mg/L+蔗糖15 g/L+瓊脂4.2 g/L+活性炭0.2 g/L，pH 5.8。每個處理接種15 瓶，每瓶6 株，重復(fù)3 次。培養(yǎng)條件及統(tǒng)計方法同1.2.1 節(jié)。

1.2.4 組培苗生根過程的解剖結(jié)構(gòu)觀察

以在pH 5.8、1/2 MS+IBA 1.6 mg/L+NAA 0.4 mg/L+蔗糖15 g/L+瓊脂4.2 g/L+活性炭0.2 g/L的生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)的材料為觀察對象，分別在生根接種后第0、3、6、9 和12 天取樣，各階段隨機取5 株苗。取生根苗的基部置于FAA 中固定，然后經(jīng)酒精梯度脫水、切片（厚度8～12 μm）和番紅—固綠染色后制成永久切片，并使用德國徠卡DM750 生物顯微鏡進行觀察和拍照。

1.2.5 煉苗

將不同根系數(shù)量的木棉組培生根苗在室內(nèi)自然光下閉瓶煉苗7 d，之后將生根苗從組培瓶中取出，用清水洗凈培養(yǎng)基后移栽至m紅壤∶m腐殖土=3∶1 的基質(zhì)中，每個處理設(shè)3 次重復(fù)，每次重復(fù)30 株。在溫度20～30 ℃、濕度≥90%（采用塑料棚保濕）的環(huán)境中按組培苗煉苗的方法[15]進行管護，180 d 后統(tǒng)計成活率。此外，隨機從每個處理中選取10 株苗木，用清水洗凈泥土，吸干表面水分后利用電子天平立即稱其鮮質(zhì)量。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Microsoft Excel 2016 對數(shù)據(jù)進行整理，并運用SPSS 21.0 對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，統(tǒng)計結(jié)果采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生長素處理對木棉組培苗生根的影響

由表1 可知：不同生長素處理間木棉組培苗生根率存在顯著差異，且均會出現(xiàn)3 種類型的生根苗（圖1）。其中，單獨添加NAA 或IBA 時，可在一定程度上促進木棉組培苗生根，但其生根率最高僅為39.15%，且生根苗以1 條不定根為主。而NAA 與IBA 組合均可顯著提高組培苗的生根率，對生根苗的根系數(shù)量也具有一定促進效果。此外，在NAA 與IBA 組合處理中，當(dāng)NAA質(zhì)量濃度為0.4 mg/L、IBA 質(zhì)量濃度從0.8 mg/L上升到2.0 mg/L 時，其生根率呈上升趨勢，以2 條和3 條不定根為主的生根苗數(shù)量也總體呈上升趨勢。與單一生長素處理相比，NAA 與IBA 組合處理的生根率可提高15.74%～56.65%。綜合來看，IBA 2.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L 組合的生根率最高，IBA 1.6 mg/L+NAA 0.4 mg/L 組合的2 條及以上不定根的生根苗占比最高。從不定根的數(shù)量考慮，后續(xù)試驗選用IBA 1.6 mg/L+NAA 0.4 mg/L 的組合進行試驗。

表1 不同生長素處理對組培苗生根的影響Tab.1 Effects of different auxin treatments on the rooting of tissue culture seedling

圖1 不同不定根數(shù)量的木棉生根苗Fig.1 Rooted seedling of Bombax ceiba with different numbers of adventitious roots

2.2 不同數(shù)量縱向劃痕處理對木棉組培苗生根的影響

由表2 可知：對生根材料的基部進行縱向劃痕處理，可顯著促進木棉組培苗生根，但縱向劃痕數(shù)量增加對組培苗的生根率無顯著影響。在不同處理中，1 條不定根生根苗所占比例最高的為1 個縱向劃痕處理，為46.56%；2 條不定根生根苗所占比例最高的為3 個縱向劃痕處理，為47.56%；3 條不定根生根苗所占比例最高的為2 個縱向劃痕處理，為22.84%?？梢?，縱向劃痕數(shù)量增加可在一定程度上增加生根苗的不定根數(shù)量。綜合來看，以2～3 個縱向劃痕處理的生根效果較好，其生根率可達94%以上，且2 條和3 條不定根數(shù)量的生根苗所占比例較高。

表2 不同縱向劃痕數(shù)量對組培苗生根的影響Tab.2 Effect of different longitudinal scratch numbers on the rooting of tissue culture seedling

2.3 不同暗培養(yǎng)時間對木棉組培苗生根的影響

由表3 可知：暗培養(yǎng)處理可以促進木棉組培苗生根。從生根率來看，隨著暗培養(yǎng)時間的增加其組培苗生根率呈先上升后下降的趨勢，其中以暗培養(yǎng)時長為3 和6 d 時的生根率最高，分別為94.30%和97.36%。生根苗的根系數(shù)量均以1 條不定根為主，其次是2 條不定根。但暗培養(yǎng)6 d的生根苗中，2 條不定根所占比例顯著高于暗培養(yǎng)3 d。此外，與不進行暗培養(yǎng)的處理相比，暗培養(yǎng)處理后1 條不定根的生根苗數(shù)量所占比例顯著增加，2 條和3 條不定根的生根苗數(shù)量所占比例則相應(yīng)減少。綜合來看，暗培養(yǎng)處理可提高木棉組培苗生根率，但會影響其不定根數(shù)量。

表3 不同暗培養(yǎng)處理時間對組培苗生根的影響Tab.3 Effect of different dark culture time on rooting of tissue cultured seedling

2.4 組培苗生根過程的解剖結(jié)構(gòu)變化

由圖2 可知：從生根誘導(dǎo)莖段的次生解剖結(jié)構(gòu)中未發(fā)現(xiàn)潛伏根原基的存在，這說明用于生根的材料在最開始沒有根原基發(fā)生；生根誘導(dǎo)3 d時，靠近韌皮層的部分皮層細(xì)胞密集，緊密附著于韌皮層，木質(zhì)部的密度增加，和附著于韌皮層的緊密皮層細(xì)胞團一起向外凸起；生根誘導(dǎo)6 d時，韌皮層和木質(zhì)部分離，中間形成一團薄壁細(xì)胞向皮層組織擠壓往外延伸，初始根原基形成，初始根原基外的皮層細(xì)胞緊密聚集，形成條帶狀細(xì)胞帶；生根9 d 時，初始根原基分裂膨脹，成為根原始體，外側(cè)皮層細(xì)胞被擠壓，細(xì)胞群緊密排列聚集，并向外凸起；生根12 d 時，根原始體突破皮層和表皮層，形成不定根，此時，不定根與韌皮層連接的一段細(xì)胞相互融合，不定根從外向內(nèi)分化形成根的導(dǎo)管系統(tǒng)與莖段木質(zhì)部連接，完成組培苗生根誘導(dǎo)過程。由上可知，木棉的組培生根苗為皮層生根型。

圖2 生根過程中木棉組培苗莖段橫切面解剖結(jié)構(gòu)變化Fig.2 Change of cross section of stem segment anatomical structure during rooting of tissue cultured seedling of B.ceiba

2.5 移栽煉苗

由表4 可知：移栽180 d 后，3 種根系類型的生根苗煉苗成活率均在90%以上，且各種類型的成活率差異不顯著（P＞0.05），但生物量存在顯著差異（P＜0.05）。具體表現(xiàn)為3 條不定根生根苗的鮮質(zhì)量顯著大于1 條和2 條不定根生根苗的鮮質(zhì)量，但1 條和2 條不定根生根苗的鮮質(zhì)量差異不顯著。此外，3 種類型的生根苗在移栽煉苗后，雖然不定根均會繼續(xù)生長，但其根系形態(tài)最終并沒有趨于一致（圖3）?？梢?，生根苗的不定根數(shù)量對其移栽煉苗后的生長會產(chǎn)生直接影響。

表4 不同類型組培苗移栽生長情況Tab.4 Transplanting growth of different types tissue culture seedlings

圖3 不同不定根數(shù)量的木棉移栽苗Fig.3 Transplanted seedling of B.ceiba with different number of adventitious roots

3 討論

植物根系的發(fā)生與伸長主要受生長素調(diào)控，它能夠刺激植物體根原基的發(fā)生發(fā)育，且會出現(xiàn)生長素峰值[16-17]。在組培苗生根過程中，常通過添加一定濃度的生長素改變內(nèi)源生長素水平達到生根目的[18]。程廣有等[19]通過添加1.0 mg/L IBA促進木棉組培苗生根，生根率高達96%。本研究中，通過添加一定質(zhì)量濃度的NAA 或IBA 雖可在一定程度上提高木棉組培苗的生根率，但其生根率較低，僅為39.15%。導(dǎo)致這一現(xiàn)象出現(xiàn)的原因可能是試驗材料基因型差異所致。對于某些苗木而言，僅添加單一的生長素雖可促進生根，但其生根率往往達不到生產(chǎn)需求[20]。因此，在生根培養(yǎng)過程中，許多植物常采用2 種激素配合使用的方式提高組培苗的生根率[21-22]。如在杜梨組培苗生根階段，僅添加IAA 或IBA 其生根率均低于36%，但二者配合使用生根率可達88.9%[23]。同樣地，IBA 和NAA 組合使用也可顯著提高木棉組培苗的生根率，提升幅度達15.74%～56.65%，同時2 條及以上不定根的生根苗占比也增加。這表明IBA 與NAA 組合優(yōu)于單一生長素對木棉組培苗的作用效果。

在植物扦插生根或組培苗生根過程中，常會對其穗條或組培苗基部進行切口處理以提高其生根能力。這主要是由于植物受傷后，傷口釋放的信號物質(zhì)會促進傷口生長素合成，使其在不定根起源細(xì)胞周圍積累，從而促進不定根再生[24-25]；同時，傷口也利于外源施用的生長素從傷口處進入莖內(nèi)，與植株體內(nèi)的內(nèi)源生長素共同作用促進不定根的發(fā)生[26]。在木棉組培苗生根過程中，對其組培苗基部進行縱向劃痕處理有助于生根，并可在一定程度上影響生根苗不定根的數(shù)量。研究表明：木棉組培苗生根時，以2～3 個縱向劃橫處理的生根效果最佳，生根率可達94% 以上，且2 條和3 條不定根的生根苗占比較高。

在植物組培生根過程中，暗培養(yǎng)可通過影響植物體內(nèi)的激素代謝水平促進多數(shù)植物離體生根[24,27-28]。如在澳洲青蘋組培苗生根試驗中，暗培養(yǎng)能顯著促進其生根，且生根苗根系較整齊一致[29]。本研究中，暗培養(yǎng)可顯著影響木棉組培苗的生根率，當(dāng)暗培養(yǎng)時間為6 d 時，組培苗的生根率較好，為97.36%；但值得注意的是，暗培養(yǎng)雖可以提高木棉組培苗的生根率，但會影響生根苗的不定根數(shù)量，這與鄒喻等[30]對粉蕉的研究有所不同。此外，并不是暗培養(yǎng)時間越長越好，時間過長會造成組培苗黃化，因此在組培苗生根時，需要按材料選擇暗培養(yǎng)時間[29]。

根據(jù)不定根的發(fā)生位置，組培苗生根可分為皮層生根型、愈傷組織生根型和綜合生根型。多數(shù)植物的生根類型可隨誘導(dǎo)條件的不同而發(fā)生變化。本研究發(fā)現(xiàn)：木棉組培苗不定根由韌皮層和木質(zhì)部中間形成的一團薄壁細(xì)胞不斷向外伸長生長而形成，屬皮層生根類型，其不定根發(fā)生形式與核桃和油茶組培苗[31-32]相似。此外，組培苗生根的關(guān)鍵是根原基的形成，其不定根原基按形成時間可分為潛伏根原始體和誘導(dǎo)根原始體[33]。從木棉生根誘導(dǎo)莖段的次生解剖結(jié)構(gòu)中未發(fā)現(xiàn)潛伏根原始體，可見，木棉組培苗的不定根是由在生根培養(yǎng)基上培養(yǎng) 6 d 后形成的誘導(dǎo)根原始體發(fā)育而來。在組培苗生根過程中，這種類型產(chǎn)生的不定根相對于愈傷組織發(fā)育而來的不定根質(zhì)量更好，有利于后期移栽煉苗成活。此外，不定根數(shù)量的增加有助于移栽苗生長。

對3 種類型的木棉生根苗進行移栽煉苗，發(fā)現(xiàn)3 種類型生根苗的移栽成活率間無顯著差異，含有3 條不定根的生根苗生物量積累較多?？梢姡欢ǜ鶖?shù)量會直接影響后續(xù)移栽苗的根系發(fā)育和苗木生物量。因此，在生根過程中，既要考慮組培苗的生根率，也要考慮其不定根的數(shù)量。傳統(tǒng)的苗木根系可通過定向控水控肥、噴施外源激素和切根等多種方式來實現(xiàn)根系形態(tài)的重塑[34-36]。而在本研究中，基于植物組織培養(yǎng)技術(shù)，利用組培苗在生根階段材料幼嫩、可塑性強且易于控制和觀察等優(yōu)勢，通過使用添加生長素、劃痕處理和暗培養(yǎng)等手段定向調(diào)控生根苗的根系形態(tài)。在干熱河谷地區(qū)造林，由于干旱少雨，苗木的質(zhì)量直接影響其造林成活率，也影響林木初期的生長速度，優(yōu)質(zhì)苗木的根系生長能力強，能夠迅速適應(yīng)新的生長環(huán)境，抵御各種生物和非生物脅迫[37-38]。因此，今后需進一步研究組培生根苗的根系形態(tài)與苗木質(zhì)量之間的關(guān)系。

4 結(jié)論

通過合理的激素配比、基部縱向劃痕以及暗培養(yǎng)處理均可促進木棉組培苗生根，同時也會影響不定根的數(shù)量。其中，NAA 與IBA 組合使用顯著優(yōu)于單一激素處理，縱向劃痕處理以2～3 個最佳，暗培養(yǎng)以處理6 d 最佳；3 條不定根的生根苗移栽煉苗后生物量增加最快。研究結(jié)果優(yōu)化了木棉組培苗的生根條件，進一步完善了木棉的組培快繁體系，可為后續(xù)的木棉組培苗移栽煉苗批量化生產(chǎn)以及不定根的定向調(diào)控提供理論基礎(chǔ)。