姜 娜，楊 姝，楊京民，李 元，祖艷群

（1.云南農(nóng)業(yè)大學 動物科學技術(shù)學院，云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學 資源與環(huán)境學院，云南 昆明 650201；3.云南農(nóng)業(yè)大學 理學院，云南 昆明 650201）

土壤重金屬污染是十分嚴峻的問題。砷（As）和鎘（Cd）是公認的劇毒元素，分別在2019 年美國有毒物質(zhì)和疾病登記署有害物質(zhì)優(yōu)先清單中排名第1 和第7[1]。重金屬Cd 和As 都是植物非必需元素，通過土壤向植物遷移，導致農(nóng)作物減產(chǎn)，并可能通過食物鏈在人體內(nèi)蓄積[2]，影響人體健康和安全。Cd 和As 復合污染土壤上農(nóng)作物種植問題受到越來越多的關(guān)注，已經(jīng)成為人類和動物健康的安全隱患。

針對 Cd 和 As 單一重金屬脅迫下品種篩選的研究較多，且多集中于水稻等糧食作物和蔬菜作物[3-4]。在牧草上，楊姝等[5]通過對云南某鉛鋅礦區(qū)7 個紫花苜蓿品種積累特征研究發(fā)現(xiàn)：游客（Eureka）為 Cd 高積累品種，四季旺（Siriver）為Cd 低積累品種，并綜合應用于礦區(qū)與農(nóng)田不同程度的污染土壤治理。利用牧草對重金屬積累能力的不同，篩選并種植重金屬積累有差異的品種，是治理土壤重金屬污染和保障食品安全的有效策略[6]。多年生黑麥草（Lolium perenneL.）是禾本科黑麥草屬草本植物，易于栽培，可以刈割多茬，飼喂家畜的成本較低，具有較高的經(jīng)濟生產(chǎn)價值。其根系強大，根際密集，分蘗能力強，可以迅速覆蓋地面[7-8]，且抗逆能力強，耐貧瘠，生態(tài)閾值廣，能在惡劣的環(huán)境中生長，甚至在寸草不生的尾礦地都能生長[9]。有研究表明：多年生黑麥草對Cu、Pb 和Zn 都具有一定的富集能力[10]；GHOLINEJAD 等[11]研究也表明：多年生黑麥草具有較強的富集Pb 能力，可播種于重金屬污染的土地上。而關(guān)于 Cd 和As 復合污染土壤上多年生黑麥草品種的篩選研究尚未報道。本研究分析31 個多年生黑麥草品種在 Cd 和As 復合污染土壤中的吸收、富集和轉(zhuǎn)運特征以及積累能力，以期篩選出用于 Cd 和As 污染土壤修復的多年生黑麥草品種，為深入研究植物修復機理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和生長條件

供試材料為31 個多年生黑麥草品種（表1）。挑選大小一致且籽粒飽滿的種子，用10% H2O2表面消毒 10 min，再用蒸餾水沖洗多次后晾干備用。

表1 不同多年生黑麥草品種名稱、產(chǎn)地及來源Tab.1 The name,native and sources of different cultivars of perennial ryegrass

1.2 試驗設(shè)計

試驗于2020 年9—10 月在云南農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院試驗基地溫室大棚進行。各多年生黑麥草品種以盆栽土培的方式進行種植?；ㄅ韪?9.3 cm，口內(nèi)徑25.4 cm，外口徑29.5 cm，每盆裝土3 kg。每個品種種植3 盆（3 次重復），播種量為50 粒/盆，共計93 盆。常規(guī)栽培管理，出苗后30 d 收獲植物。試驗過程中每天及時補充土壤水分，同時為了防止?jié)菜斐赏寥乐亟饘貱d 和As 流失，在每個花盆下面放置塑料托盤，每次澆水后將滲出的水溶液再倒回花盆。

土壤取自云南省個舊市某Cd 和As 復合污染地區(qū)農(nóng)用地。土壤基本理化性質(zhì)為：pH 7.64～8.19，有機質(zhì)含量40.26 g/kg，全氮含量2.54 g/kg，全磷含量1.36 g/kg，全鉀含量2.26 g/kg，堿解氮含量142.23 mg/kg，速效磷含量179.50 mg/g，速效鉀含量178.91 mg/kg，Cd 含量4.64 mg/kg，As含量227.85 mg/kg。

1.3 指標測定

1.3.1 株高、根長和生物量測定

分別用直尺測量31 個品種的株高和根長，并稱其質(zhì)量，即為鮮質(zhì)量。用去離子水清洗后，在 105 ℃殺青30 min，于 75 ℃烘箱中烘干至恒質(zhì)量并稱量，即為生物量（干質(zhì)量）。

1.3.2 植物Cd 和As 含量測定

分別將31 個品種多年生黑麥草的根部和地上部干樣研磨至粉末狀，保存?zhèn)溆谩?/p>

Cd 含量測定：稱取 0.2 g 樣品置于聚四氟乙烯高壓罐中，加入體積比為3∶1 的HNO3—H2O2溶液8 mL，于145 ℃條件下消化 4 h，冷卻后定容，過濾，用火焰原子吸收光譜（Thermo ICE 3000 系列，美國）測定[12]。

As 含量測定：稱取 0.2 g 樣品置于聚四氟乙烯高壓罐中，加入HNO35 mL 靜置過夜，于145 ℃條件下消化 4 h，冷卻后定容，過濾；向待測液中加入HCl 3 mL 和硫脲+抗壞血酸混合溶液5 mL，反應30 min，用原子熒光光譜儀（海光AFS-9710，中國）測定[12]。

1.4 積累特征差異及富集能力評價

用變異系數(shù)表示各觀測性狀的變異程度：

變異系數(shù)（CV）=標準差/平均值。

生物富集系數(shù)（BCF）和轉(zhuǎn)運系數(shù)（TF）計算公式為[13-14]：

式中：Cshoot為地上部重金屬含量，mg/kg；Croot為多年生黑麥草根部重金屬含量，mg/kg；Csoil為土壤重金屬含量，mg/kg。

采用隸屬函數(shù)法[15]對31 個多年生黑麥草的生物量及地上部和地下部Cd 和As 富集系數(shù)進行綜合評價。

式中：X（μ）為隸屬函數(shù)值；X為重金屬脅迫處理下某指標的相對值；Xmax為該指標的最大值；Xmin為該指標的最小值。若某一指標與富集能力呈正相關(guān)，用公式（1）計算；若呈負相關(guān)，用公式（2）計算。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 20 軟件進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)結(jié)果用“平均值±標準誤”表示（n=3），差異顯著性采用Duncan 檢驗法（P＜0.05）；采用組內(nèi)平均聯(lián)接法對不同多年生黑麥草品種Cd 和As 積累量進行聚類分析；采用Excel 2010 制作圖表并進行隸屬函數(shù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 多年生黑麥草株高、根長及生物量的差異

不同多年生黑麥草品種間的株高、根長和生物量存在差異（圖1），品種間株高、根長、地上部生物量和根部生物量的最大相差倍數(shù)分別達1.96 倍、1.95 倍、4.8 倍和6.5 倍。其中，株高指標中排名前3 位的為LC、YQ 和DN，排名后3 位的為SD、JP 和ZL。在根長指標中排名前3 位的為MD、HW 和TY，排名后3 位的為ML、LJ 和TL。以地上部和根部生物量為指標，地上部生物量較高的為LD、JG和YQ；根部生物量較高的為 MSL、TYD 和MD?？傮w來看，在Cd 和As 復合污染土壤中，LD、YQ 和HW 生長狀況較好，SD、JP 和LT 生長狀況較差。

圖1 31 個多年生黑麥草品種的株高、根長和單株生物量Fig.1 Plant height,root length and per plant biomass of 31 cultivars of perennial ryegrass

2.2 多年生黑麥草地上部和根部的Cd 和As 含量

由圖2 可知：地上部Cd 含量最高的品種為YY（4.91 mg/kg），最低的為WNS（2.15 mg/kg）；根部Cd 含量最高的為ZL（27.16 mg/kg），最低的為LD（7.63 mg/kg）。根部Cd 含量顯著高于地上部，ZL 地上部與根部Cd 含量差異達8.97 倍（P＜0.05）。說明多年生黑麥草對重金屬Cd 的吸收能力較強，對Cd 的富集主要集中在根部。采用GB 13078—2017[16]進行飼用安全性評價，所有多年生黑麥草品種地上部Cd 含量均超過飼用標準限值（Cd≤1 mg/kg）。

由圖2 還可知：地上部As 含量最高的為DPB（14.17 mg/kg），最低的為YY（1.90 mg/kg）；根部As 含量最高的為ML（77.24 mg/kg），最低的為AST（18.60 mg/kg）。根部As 含量較高，LC 地上部與根部As 含量差異達29.04 倍（P＜0.05）。說明多年生黑麥草的根部對重金屬As 的吸收能力較強。采用GB 13078—2017[16]進行飼用安全性評價，31 個品種中WNS、YQ、TL、SD、JP、CDZ、NY、LC、MK、YY 和MSL 的地上部As 含量均達到飼用標準（As≤4 mg/kg）。

圖2 31 個多年生黑麥草品種的Cd 和As 含量Fig.2 Content of Cd and As in shoot and root of 31 cultivars of perennial ryegrass

2.3 多年生黑麥草Cd 和As 積累特征

由表2 可知：多年生黑麥草植株Cd 和As 的總積累量均值分別為168.917 和357.059 mg/kg，且不同品種間積累差異較大，其變異系數(shù)分別可達0.305 和0.504。不同多年生黑麥草品種各指標的變異系數(shù)范圍為0.113～0.508，其中根冠比以及Cd 和As 總積累量的變異系數(shù)較高；變異系數(shù)最小的是含水率，僅為0.113，表明該物種在Cd 和As 復合脅迫下含水率較為穩(wěn)定。

表2 多年生黑麥草Cd、As 積累量及形態(tài)生理指標分析Tab.2 Analysis of Cd and As accumulation and morphophysiological indexes in perennial ryegrass

由表3 可知：不同多年生黑麥草品種間Cd 和As 含量比值差異較大，地上部和根部比值范圍分別在0.304～2.589 和0.123～1.268，差異分別達到8.52 倍和10.31 倍。地上部Cd 富集系數(shù)為0.464～1.058，富集系數(shù)＞1 的品種分別為YQ、YY 和HW，根部Cd 富集系數(shù)為1.644～5.855；地上部As 富集系數(shù)為0.012～0.090，根部As 富集系數(shù)為0.119～0.493，說明多年生黑麥草對Cd的富集能力較強，對As 的富集能力較弱。31 個多年生黑麥草品種對Cd 的轉(zhuǎn)運系數(shù)為0.112～0.516，對As 的轉(zhuǎn)運系數(shù)為0.034～0.438，轉(zhuǎn)運系數(shù)均＜1，表明多年生黑麥草對Cd 和As 的積累主要集中于根部，對Cd 的轉(zhuǎn)運能力更強。

表3 不同多年生黑麥草品種Cd 和As 的富集與轉(zhuǎn)運Tab.3 Bioconcentration and translocation factor of Cd and As in different cultivars of perennial ryegrass

2.4 不同多年生黑麥草品種Cd 和As 積累能力排名及綜合評價

2.4.1 多年生黑麥草Cd 和As 積累量的聚類分析

由圖3 可知：對不同多年生黑麥草品種Cd 和As 積累量進行聚類分析，可將31 個多年生黑麥草品種聚為三大類 。第I 類有7 種，分別為ML、HW、LD、MSL、DPB、TYD 和MLU，為高鎘、砷積累類群；第II 類有11 種，分別為SS、TY、LC、YM、JG、MS、MK、MD、QH、GS 和YQ，為中鎘、砷積累類群；第III 類有13 種，分別為TL、JP、ZL、LT、AST、NY、YY、DN、PKW、WNS、SD、LJ 和CDZ，為低鎘、砷積累類群。

圖3 31 個多年生黑麥草品種Cd 和As 積累能力聚類圖Fig.3 Cluster analysis plot of the cumulative abilities of Cd and As for 31 cultivars of perennial ryegrass

2.4.2 不同多年生黑麥草品種對Cd 和As 污染土壤的修復潛力及綜合評價

利用隸屬函數(shù)對31 個多年生黑麥草品種的Cd 和As 富集系數(shù)及生物量進行富集能力的排名（表4），得分排名前3 的品種為HW、DPB 和ML，具有對Cd 和As 復合污染土壤的修復潛力；得分較低的品種為JP、CDZ 和TL，從土壤富集Cd 和As 的能力最弱。

表4 不同多年生黑麥草品種Cd 和As 富集能力綜合評價Tab.4 Comprehensive evaluation of Cd and As enrichment capacity between 31 cultivars of perennial ryegrass

3 討論

目前，多年生黑麥草在Cd 脅迫下的研究較多，而Cd 和As 復合脅迫下多年生黑麥草品種間差異研究鮮有報道，相比于龍葵（Solanum ni-grumL.）和蜈蚣草（Pteris vittataL.）等超富集野生植物，多年生黑麥草易栽培、生物量穩(wěn)定、實際應用價值高，因此，篩選出合適的品種應用于Cd 和As 復合污染土壤治理對農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有十分重要的實際意義和價值。本研究中，31 個多年生黑麥草品種在Cd 和As 含量分別為4.64和227.85 mg/kg 復合污染土壤中均能正常生長，表現(xiàn)出較強的耐性和抗逆性。31 個多年生黑麥草品種的生長狀況不盡相同，Cd 和As 積累量以及根冠比變異系數(shù)較大。KOVá?IK 等[17]研究證實植物對重金屬的攝入與植物的種類和品種有關(guān)。植物基因的多樣性會導致重金屬積累存在明顯的種間或種內(nèi)差異[18]。植物對重金屬的攝入不僅因種類不同，還因部位不同而導致積累量也不同。本研究表明：31 個多年生黑麥草品種中，Cd 和As 的含量均表現(xiàn)為根部＞地上部，根部是重金屬的主要富集部位，且對重金屬 Cd 有更強的積累能力。這與金卓君等[19]對2 種黑麥草Cd 富集的研究結(jié)果相反，這可能是由于不同品種的積累特性導致；而本試驗結(jié)果與HUI 等[20]的研究結(jié)果一致。分析多年生黑麥草根部重金屬含量更高的原因可能為：第一，植物根系存在多種離子的載體蛋白，每種離子與其相應的載體蛋白（轉(zhuǎn)運子）結(jié)合，借助代謝能量離子被轉(zhuǎn)運到細胞內(nèi)，由于中間限制向上運輸，在一定程度上將Cd 滯留在根系，緩解Cd 對地上部的傷害，這也是多年生黑麥草自身的一種調(diào)節(jié)機制[21]；第二，由于阻隔作用，多年生黑麥草的根皮層阻止重金屬向植物地

上部傳播，根細胞的細胞壁較薄，重金屬在根尖位置的積累量最大[11,22]。植物根系與地上部生理生態(tài)關(guān)系密切，從根系到地上部比地上部到根系的系統(tǒng)誘導效應普遍[23]。

BCF 和TF 是植物修復的決定性參數(shù)，為金屬在根部的吸收、儲存和轉(zhuǎn)運到地上部提供了依據(jù)[10]。NETTY 等[24]認為：BCF 值為1～10 是超積累植物，BCF 值為0.1～1 是中度積累植物，BCF 值為0.01～0.1 是低積累植物，BCF 值＜0.01為非積累植物。本研究中31 個多年生黑麥草品種對Cd 和As 的轉(zhuǎn)運系數(shù)均小于1，對Cd 的富集能力高于As，且根部對Cd 的富集系數(shù)均大于1，可以證實多年生黑麥草為Cd 的超積累植物[25-26]。LOU 等[27]研究表明：多年生黑麥草對Cd 和Pb 復合脅迫具有一定的耐性和高積累能力，但對Cd 的吸收優(yōu)先于Pb。本研究表明：多年生黑麥草對Cd 的富集高于As，與其結(jié)論相似。Cd 和As 由于化學性質(zhì)不同，受土壤pH 值、Eh 值和微量元素等影響較大。與單一污染相比，復合污染下植物吸收Cd 和As 的機理更為復雜。有研究報道：某種黑麥草屬植物地上部Cu 含量受土壤中Zn 和Si 的抑制，但Zn 和Si 促進了其根部Cu 含量增加；Zn 的活性隨著土壤中Cu 和Si 投加量的提高而增大；Cd 的活性受到Cu 和Zn 的抑制[28]。SUN 等[29]研究表明：Cd 和As 復合脅迫顯著抑制了龍葵根和地上部對Cd 和As 的吸收。在本試驗中，是否存在重金屬As 在復合污染中促進多年生黑麥草根部Cd 含量的增加？Cd 和As 復合脅迫對植物根系結(jié)合部位的拮抗作用是否影響重金屬吸收過程？這些問題仍待進一步探究。

本研究中，HW、DPB 和ML 在31 個品種富集能力綜合評價排名前3，其Cd 和As 含量雖不是31 個品種中最高的，但生物量達到了平均水平之上；而富集能力排名最低的是JP，其生物量較低，明顯限制了植株對Cd 和As 的富集能力。因此，生物量是影響富集能力的重要因素之一。綜合本研究結(jié)果，多年生黑麥草品種積累能力聚類與隸屬函數(shù)值排名結(jié)果相吻合，排名前3 的品種均聚類于高積累類群。其中，低積累的品種未來可進行相關(guān)育種研究，找出調(diào)控低積累的關(guān)鍵基因，培育出新型的Cd 和As 低積累但生物量大的飼用品種應用于輕度污染土壤。

本研究以Cd 和As 復合脅迫為出發(fā)點，較以往多為單一金屬脅迫有更進一步的研究，試驗材料為多年生黑麥草，較其他物種更易栽培獲得，但目前對多品種的研究較少。本研究旨在篩選出有積累差異特性的多年生黑麥草品種應用于重金屬污染土壤。李松克等[30]研究多年生黑麥草不同種植年限對土壤重金屬的影響，發(fā)現(xiàn)隨著種植年限增加，土壤中重金屬含量逐漸減少。從其多年生長習性考慮，隨著生長年限的延長，牧草刈割次數(shù)增多，重金屬被帶走，多年生黑麥草體內(nèi)積累的重金屬量也會隨之降低。本試驗結(jié)果基于盆栽試驗，具有一定的局限性。今后可結(jié)合其多年生長習性考慮，進一步驗證田間條件下多年生黑麥草品種間的積累特性差異；另外，隨著多年生長后，多年生黑麥草能否達到飼用標準、成為優(yōu)質(zhì)的牧草使用，也亟需研究。

4 結(jié)論

多年生黑麥草屬于Cd 超積累植物，根部是多年生黑麥草主要的Cd 富集器官，富集系數(shù)均大于1。31 個多年生黑麥草品種對重金屬Cd 的富集能力和轉(zhuǎn)運系數(shù)高于As。其中，金牌（Turfgold）、充電樁（Charger II）和泰綠（Royal Green）對Cd和As 富集能力較弱，具有低積累牧草種植利用的潛力；海灣（Bay）、大瀑布（Nicaragua）和墨綠（Holly Green）富集能力較強，對Cd 和As 污染土壤具有一定的修復潛力，可綜合運用于礦區(qū)周邊Cd 和As 復合污染土壤的治理。