段華超，李燕燕，葉 瀾，井卉竹，李世民，董 瓊

（西南林業(yè)大學，西南山地森林資源保育與利用教育部重點實驗室，云南 昆明 650224）

光合作用是植物維持正常生命活動的最基本要求，也是植物對非生物脅迫最敏感的生理過程之一[1]。鈣在植物的生長及生理過程中起著重要的作用[2]。鈣作為“第二信使”，具備直接或間接參與物質傳輸、調控氣孔保衛(wèi)細胞的滲透勢、調節(jié)氣孔對環(huán)境中CO2的吸收、減少水分散失和提高水分利用效率的作用，進而增強光合作用[3-4]。葉綠素作為光合作用的主要色素，在植物光反應過程中起著十分重要的作用，其含量對光合效率有著決定性的作用。適量的鈣可有效促進鐵和鎂元素的吸收，從而促進葉綠素合成；但鈣過量會降低植物對鐵和鎂的吸收，抑制葉綠素合成，最終降低植物的光合效率[5-7]。葉綠素熒光參數(shù)能反映逆境脅迫下植物的光合生理特性，其信號因具有反應靈敏且迅速的特性而被廣泛用作光合作用的光系統(tǒng)探針[8]。一定濃度的鈣能有效保護PSⅡ活性，促進光合電子的傳遞速率，維持較高的凈光合速率和胞間CO2濃度，對植物的生長產生積極作用[9-10]。目前，鈣對植物光合特性的影響研究主要集中在逆境脅迫下鈣的緩解調控作用[2,9-13]，但以鈣為首要影響因子的植物光合特性研究較少。

白槍桿（Fraxinus malacophylla）屬木犀科（Oleaceae）梣屬（Fraxinus）雙子葉植物，落葉小喬木，耐旱，耐瘠薄，抗逆性和發(fā)芽力強[14-16]；主要分布于滇東南山原峽谷常綠闊葉林中，多為闊葉伴生樹種，也是該地區(qū)生態(tài)恢復常用樹種之一，具有很高的藥用和生態(tài)價值[17-18]。近年來，隨著國家生態(tài)文明建設發(fā)展戰(zhàn)略的提出，西南巖溶石漠化地區(qū)生態(tài)恢復取得了顯著成果，白槍桿作為主要鄉(xiāng)土樹種之一，也被廣泛用于石漠化生態(tài)恢復。但在生態(tài)恢復過程中，白槍桿面臨著干旱和富鈣等生境問題[19-20]，而有關其對土壤中鈣元素的響應和調控機制尚未見文獻報道。因此，本研究以白槍桿幼苗為對象，針對西南巖溶石漠化地區(qū)土壤鈣含量富積的環(huán)境條件，探究鈣對白槍桿生長及光合作用的調節(jié)機制，明確適宜白槍桿生長的鈣濃度，為白槍桿的推廣利用提供技術支撐，也為巖溶石漠化地區(qū)植被恢復及生態(tài)文明建設可持續(xù)發(fā)展提供更多理論參考，并進一步豐富鈣對植物光合特性影響的理論研究。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于西南林業(yè)大學格林溫室（云南省昆明市，N25°03′，E102°45′），地處亞熱帶高原季風氣候區(qū)，海拔1 904 m；霜期短，氣候溫和，年平均溫度16.5 ℃，最低月平均氣溫12.9 ℃（12 月），最高月平均氣溫28.4 ℃（6 月），年平均降水量1 035 mm，主要集中在6—10 月，年平均相對濕度67%（數(shù)據(jù)來源于國家氣象科學數(shù)據(jù)中心）。

1.2 試驗材料與試驗設計

供試材料為一年生白槍桿實生袋苗，2020 年1 月播種于云南建水。2020 年6 月由云南建水運往西南林業(yè)大學格林溫室，并植入營養(yǎng)缽中。營養(yǎng)缽上口徑160 mm，下口徑110 mm，高120 mm，底部墊托盤；盆栽土壤理化性質為：pH 5.45，總氮含量0.71 g/kg，總磷含量0.57 g/kg，總鉀含量2.06 g/kg，總鈣含量0.48 g/kg，鎂含量0.12 g/kg，鐵含量60.99 g/kg，容重1.14 g/cm3；基質配比為m紅壤∶m河沙∶m珍珠巖=5∶3∶2，每盆種植1 株幼苗，于溫室內進行常規(guī)管理。適應生長15 d 后，于7 月5 日選取長勢均勻一致的苗木，用于CaCl2澆灌處理。

試驗采用單因素完全隨機試驗設計，根據(jù)前期預試驗，設置0（CK）、25（低鈣）、50（中鈣）和75 mmol/L（高鈣）4 個鈣濃度梯度，分別記為CK、T1、T2和T3，每隔15 d 分別用不同濃度CaCl2溶液對白槍桿幼苗進行定量（每株50 mL）澆灌，CK 以等量的去離子水灌溉。每個處理18 株，4 次重復，共288 株。澆灌過程中將滲入托盤的溶液倒回營養(yǎng)缽中，防止鈣流失。每隔15 d 測定1 次生長指標；鈣處理90 d 后，測定光合指標和葉綠素熒光參數(shù)，并從每株相同位置采2～3 片葉保存于液氮，在實驗室測定葉綠素含量。

1.3 測定指標與方法

1.3.1 生長指標測定

測定的生長指標包括幼苗的株高、地徑和株幅。鈣處理試驗開始時，于生長期內每隔15 d 利用鋼尺（精確度0.01 cm）和游標卡尺（精確度0.02 mm）準確測量幼苗株高、地徑（東西、南北方向的平均值）和株幅（長、短株幅的平均值）。幼苗株高、地徑和株幅的生長量分別為試驗結束和試驗開始時的數(shù)值之差。

1.3.2 光合指標測定

于2020 年10 月上旬選擇晴朗無云的連續(xù)3 d，采用Li-6400XT 便攜式光合測定儀（LI-COR公司，美國）從8：0 0—18：0 0 測定從頂芽往下數(shù)第4～6 片完整功能葉的光合日變化，間隔2 h測定1 次。每個處理選取4 株長勢基本一致的幼苗，每株測定2 片葉，每片葉重復測定3 次（每次讀取10 個數(shù)值），結果取平均值。同時期于晴天上午9：3 0—11：3 0 測定其光合特性，測定指標包括白槍桿幼苗功能葉的凈光合速率（photosynthetic rate，Pn）、氣孔導度（stomatal conductance，Gs）、胞間CO2濃度（intercellular CO2concentration，Ci）和蒸騰速率（transpiration rate，Tr）。測定時采用自然光源，標準葉室（2 cm×3 cm），空氣流速為500 s/m3，并計算水分利用率（water use efficiency，WUE）：WUE=Pn/Tr。

1.3.3 葉綠素熒光參數(shù)測定

葉綠素熒光參數(shù)的測定與光合參數(shù)測定同步進行，每個處理挑選4 株長勢一致的幼苗，每株選取第4～6 片中無病蟲害、長勢良好、功能完整的2 片葉進行標記。采用PEA-Plus 高速連續(xù)激發(fā)式熒光儀（Hansatech 公司，英國）測定葉綠素熒光參數(shù)，測定前充分光適應，再進行暗處理30 min，測定初始熒光產量（initial fluorescence yield，F(xiàn)o）、最大熒光產量（maximal fluorescence yield，F(xiàn)m）、PSⅡ最大量子產率（Fv/Fm）和PSⅡ潛在活性（Fv/Fo），每片葉測定3 次，連續(xù)測定3 d，取平均值。

1.3.4 葉綠素含量測定

采用分光光度法測定葉綠素含量。將采集的新鮮葉片去除葉脈剪碎混勻，準確稱取0.2 g（精確度0.001 g），放入干燥研缽中，加入液氮快速研磨至粉末狀。先后加入95% 乙醇3 和5 mL，繼續(xù)研磨成勻漿狀后靜置3～5 min，將勻漿全部移入25 mL 棕色容量瓶中，并用95% 乙醇定容，搖勻后靜置12 h[21]。以95%乙醇為空白對照，利用紫外分光光度計于波長665、649 和470 nm下測定葉綠素a（Chla）、葉綠素b（Chlb）和類胡蘿卜素（Car）的吸光度（OD 值），按照公式[22]計算每克葉片的葉綠素a、葉綠素b 和類胡蘿卜素含量。每個樣品重復3 次，取平均值。

式中：Ca、Cb和Cc分別為葉綠素a、葉綠素b 和類胡蘿卜素的質量濃度（mg/L），OD665、OD649和OD470分別為波長665、649 和470 nm 下的吸光度。

再根據(jù)以下公式計算植物組織中葉綠素含量：

式中：C為色素質量濃度（mg/L），V為提取液體積（mL），N為稀釋倍數(shù)，m為樣品質量（g），1 000表示1 000 mL。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2016 處理和統(tǒng)計數(shù)據(jù)；使用SPSS 25.0 進行單因素方差分析，各處理平均值采用LSD 法進行多重比較和差異顯著性檢驗；使用Origin 2018 制圖。

2 結果與分析

2.1 不同濃度鈣對白槍桿幼苗形態(tài)指標的影響

由表1 可知：在不同濃度鈣處理下，白槍桿幼苗生長指標前15 d 內無顯著差異（P＞0.05）；與CK 相比，鈣處理30 d 后株幅開始出現(xiàn)顯著差異（P＜0.05），處理45 d 后苗高開始出現(xiàn)顯著差異（P＜0.05）；試驗期間，不同濃度鈣處理的地徑均未出現(xiàn)差異（P＞0.05）。不同濃度鈣處理下，苗高和株幅生長量差異較大，其生長量大小順序均為T2＞T1＞T3＞CK，T2處理分別比CK 高15.07%和23.32%（P＜0.05）；地徑生長量大小順 序 為T2＞T1＞CK＞T3；但白槍桿幼苗各形態(tài)指標生長量均隨鈣濃度的增加呈先增加后下降的趨勢。

表1 不同濃度鈣處理下白槍桿幼苗生長指標測定結果Tab.1 Determination results of growth index of Fraxinus malacophylla seedlings under different calcium concentration treatments

2.2 不同濃度鈣對白槍桿幼苗光合特性的影響

2.2.1 不同濃度鈣對光合日變化的影響

由圖1 可知：不同鈣濃度處理下，白槍桿幼苗葉片在晴天凈光合速率（Pn）和氣孔導度（Gs）日變化趨勢大致相同，T2的變化幅度最大，T3的變化幅度最小，且均呈明顯的雙峰曲線：從8：00開始上升，10：00—12：00達到第1 個高峰，然后快速下降，12：00—14：00降至“光合午休”狀態(tài)；14：00—16：00開始緩慢上升并達到第2 個高峰，后緩慢下降，到16：00—18：00降到最低點。白槍桿幼苗葉片Pn日變化與Gs、蒸騰速率（Tr）呈正相關，與胞間CO2濃度（Ci）呈負相關。此外，不同濃度鈣處理的Tr均小于CK。

圖1 不同鈣濃度對白槍桿幼苗葉片光合特性日變化的影響Fig.1 Effects of different calcium concentrations on the diurnal changes of photosynthetic characteristics of Fraxinus malacophylla seedling

2.2.2 不同濃度鈣對光合參數(shù)的影響

由表2 可知：不同濃度鈣處理下白槍桿幼苗功能葉Pn和Gs大小順序均為T2＞T1＞CK＞T3，中濃度鈣（T2）處理的Pn比其他處理顯著提高10.68%～43.47%（P＜0.05），低濃度鈣（T1）和中濃度鈣（T2）處理的Gs顯著高于對照和高濃度鈣處理（P＜0.05）。由表2 還可知：T2處理的Ci值顯著低于其他處理（P＜0.05）；不同濃度鈣處理均可顯著降低白槍桿幼苗的Tr（P＜0.05），降幅分別為 27.63%、25.57%和34.43%；不同濃度鈣處理下，水分利用率（WUE）隨著鈣濃度的增加呈先升高后下降的趨勢，T2處理的WUE 顯著高于其他處理（P＜0.05）。

表2 不同濃度鈣對白槍桿幼苗光合參數(shù)的影響Tab.2 Effects of different calcium concentrations on the photosynthetic parameters of F.malacophylla seedling

2.3 不同濃度鈣對白槍桿幼苗葉片熒光參數(shù)的影響

由圖2 可知：不同濃度鈣處理后，白槍桿幼苗葉片初始熒光產量（Fo）呈先升高后降低的趨勢；對照處理的Fo值最小，為410.33±20.26，中濃度鈣處理（T2）的Fo最大，達467.67±13.79，比對照高13.97%（P＜0.05），表明中鈣處理光合系統(tǒng)開放程度顯著高于對照。隨著鈣濃度升高，最大熒光產量（Fm）呈先升后降的趨勢；鈣濃度達到50 mmol/L 時，F(xiàn)m最大，顯著高于對照，有效提高了PSⅡ電子傳遞速率；鈣濃度達到75 mmol/L時，F(xiàn)m顯著小于對照，說明PSⅡ電子傳遞開始受阻，產生脅迫作用。由圖2 還可知：PSⅡ最大量子產率（Fv/Fm）和潛在活性（Fv/Fo）隨鈣濃度的增加均呈先增加后降低的變化趨勢，均在T2處理下達到最大值，分別為0.83±0.01 和4.95±0.03，顯著高于對照（P＜0.05）；Fv/Fm和Fv/Fo在高濃度鈣（T3）處理下均顯著低于對照（P＜0.05），表明PSⅡ反應中心在高鈣濃度下活性受抑制。

圖2 不同濃度鈣對白槍桿幼苗葉片葉綠素熒光參數(shù)的影響Fig.2 Effects of different calcium concentrations on the chlorophyll fluorescence parameters of F.malacophylla seedling

2.4 不同濃度鈣對白槍桿幼苗葉綠素含量的影響

由表3 可知：不同濃度鈣對白槍桿幼苗葉片葉綠素含量有顯著影響，表現(xiàn)為隨鈣濃度的增加，白槍桿幼苗葉片葉綠素a（Chla）、葉綠素b（Chlb）、葉綠素總量[Chl（a+b）]和類胡蘿卜素（Car）含量均呈先增加后減少的趨勢。中濃度鈣（T2）處理下，白槍桿幼苗葉片Chla、Chlb、Chl（a+b）和Car 含量均顯著高于對照（P＜0.05），但Chla/Chlb與對照差異不顯著（P＞0.05）；低濃度鈣（T1）處理下，葉綠素各指標含量與對照均無顯著差異（P＞0.05）；高濃度鈣（T3）處理下，Chla/Chlb 與對照差異顯著（P＜0.05），其余指標差異性均不顯著（P＞0.05）。

表3 不同鈣濃度對白槍桿幼苗葉綠素含量的影響Tab.3 Effects of different calcium concentrations on the chlorophyll content of F.malacophylla seedling

3 討論

3.1 鈣對葉綠素和光合特性的影響

鈣與植物葉片的葉綠素含量密切相關。鈣離子濃度變化可以影響植物對鎂的吸收及分配，從而影響葉綠素合成[23-24]。有研究表明：適量外源鈣添加可以促進植株生長發(fā)育和葉綠素合成，提高植株光合效率[25]；鈣濃度過高會抑制植物對其他元素的吸收和利用，也抑制植物光合系統(tǒng)生理活性，從而使植株受到鈣脅迫導致其生長發(fā)育緩慢[26]。葉綠素a/葉綠素b 主要反映PSⅡ聚光復合體在所有含葉綠素的結構中所占的比重，該值上升則PSⅡ聚光復合體含量減少，光合速率下降[27]。本研究中，低、中濃度鈣處理下，白槍桿幼苗的生長量和葉綠素含量均呈上升趨勢；而高濃度鈣處理下，其生長量和葉綠素含量下降，葉綠素a/葉綠素b 上升，與孫悅[10]的研究結果相似。這說明適宜的鈣濃度有利于白槍桿幼苗生長及葉綠素合成；鈣濃度過高會產生脅迫作用，抑制其生長，降低葉片葉綠素含量和PSⅡ聚光復合體含量，從而降低光合效率。

鈣元素對植物的光合作用具有重要作用，添加適量的外源鈣可以提高植物的凈光合速率（Pn），促進氣孔打開，提高蒸騰速率（Tr）和水分利用率（WUE），進而促進植物幼苗光合作用[28-30]。本研究表明：低、中濃度鈣（25 和50 mmol/L）處理下，白槍桿幼苗的Pn、氣孔導度（Gs）和WUE均顯著提高，胞間CO2濃度（Ci）降低，與任城帥等[13]的研究結果一致；但Tr比CK 顯著下降，與蘇志孟[31]的研究不一致，其原因可能是低、中濃度鈣處理下WUE 顯著提高，葉片中自由水含量降低，參與蒸騰的水分較少，從而導致其Tr小于對照。孫悅[10]和韓飛燕[30]分別以油松（Pinus tabuliformis）和麻櫟（Quercus acutissima）為研究對象，發(fā)現(xiàn)鈣濃度過高時，2 種植物的光合效率降低，植物生長受限；本研究中，高濃度鈣（75 mmol/L）處理下白槍桿幼苗Pn、Gs和Tr均顯著低于低、中濃度鈣處理，各器官生長量降低，說明添加過量的外源鈣會降低白槍桿幼苗的光合作用，抑制其生長。

3.2 鈣對葉綠素熒光參數(shù)的影響

葉綠素熒光參數(shù)能有效表征植物的生長狀態(tài)，是研究植物光合原初反應的無損探針，可監(jiān)測光合作用的多個進程，并能體現(xiàn)植物的生理狀況，是生境中物理及化學條件脅迫對植物生長影響的重要指標[32-33]。熒光參數(shù)中，初始熒光產量（Fo）反映的是光系統(tǒng)（PSⅡ）處于完全開放時的熒光產量，最大熒光產量（Fm）反映的是PSⅡ完全封閉時的熒光產量，F(xiàn)v/Fm和Fv/Fo分別表示PSⅡ的最大量子產率和潛在活性，可以有效反映植物的光合發(fā)生情況[34-35]。王輝等[36]通過對玉簪（Hosta plantaginea）添加不同濃度外源鈣溶液發(fā)現(xiàn)：添加適宜濃度的外源鈣能有效提高玉簪熒光產量、最大光學效率和潛在活性；鈣濃度過高則會抑制熒光產量，降低光能利用率。本研究中，不同濃度外源鈣處理下白槍桿幼苗的Fo、Fm、Fv/Fm和Fv/Fo值均有較大變化。鈣濃度達到75 mmol/L 時，F(xiàn)v/Fm和Fv/Fo值均顯著下降，說明鈣濃度超過75 mmol/L 會產生脅迫作用，顯著降低白槍桿幼苗PSⅡ最大量子產率和PSⅡ潛在活性，且Fo在鈣脅迫作用發(fā)生后相比CK 增大，也充分反映了PSⅡ反應中心受抑制，與王輝等[36]的研究結果相似；而Fm明顯降低，與謝詩[37]和王婧[38]的研究結果不一致，分析其原因可能是研究材料不同所致，白槍桿作為木本植物，對鈣濃度變化更敏感，鈣脅迫發(fā)生后，PSⅡ反應中心電子傳遞速率下降，導致Fm明顯降低，但具體原因有待進一步研究。鈣濃度為50 mmol/L 時，白槍桿幼苗的Fo、Fm、Fv/Fm和Fv/Fo值均顯著高于對照，說明添加50 mmol/L 的外源鈣能有效提高白槍桿PSⅡ反應中心熒光產量、最大光學效率和潛在活性，增強植株的光合作用。此外，中濃度鈣處理的葉綠素含量最高，F(xiàn)o值也最大，F(xiàn)o隨著葉綠素含量增加而增大的關系也說明添加中濃度外源鈣能顯著提高白槍桿幼苗光合效率[39-40]。

4 結論

白槍桿幼苗生長的較適外源鈣濃度為50 mmol/L。添加適宜的外源鈣能促進白槍桿幼苗葉片葉綠素合成，提高凈光合速率、氣孔導度和水分利用率，提高白槍桿幼苗的Fo、Fm、Fv/Fm和Fv/Fo等熒光參數(shù)，從而進一步促進植株光合作用和植物生長；鈣濃度過高則會抑制光合作用和生長。