詹曉東，梁益軍

（桂林電子科技大學北海校區(qū) 基礎教學部，廣西 北海 536000）

機體自由基產(chǎn)生失衡可造成機體代謝紊亂，引發(fā)疾病[1]。已有研究表明：運動組織氧耗可刺激自由基產(chǎn)生，當其超過體內(nèi)抗氧化防御能力即可造成細胞生物分子學損傷[2]。自由基理論引入運動醫(yī)學領域后，其在運動性疲勞的重要意義逐漸受到關注和重視[3-4]。運動性疲勞機制中，有學者認為疲勞是由于某些能量物質(zhì)的消耗代謝產(chǎn)物在肌組織中堆積造成的[5]。提高運動員的運動能力是運動醫(yī)學界長期關注的重點。鑒于西藥有效性的局限及副作用等，中藥成分和植物成分頗受關注，類胡蘿卜素、皂苷和黃酮類等成分可直接清除超氧化陰離子，并調(diào)節(jié)機體內(nèi)氧化和抗氧化平衡，使機體免受過氧化損傷[6-8]。

黃秋葵具有多種生物學活性，具有防癌和抗氧化等多種保健作用，奠定了其在醫(yī)藥和食品領域的應用基礎[9]。已有研究報道：黃秋葵含有豐富的黏性多糖物質(zhì)，有助于促進機體排毒、降低膽固醇和血糖等[10]；黃秋葵制品在降低糖尿病、肥胖、高血脂癥和心血管疾病等方面具有重要作用[11-12]。然而，現(xiàn)階段針對黃秋葵多糖的功效研究相對較少。此外，黃秋葵可能作為運動中能量來源，延長耐力時間而發(fā)揮抗疲勞作用[13]，但相關機制研究鮮見報道。為深入研究黃秋葵功能及其機理，本研究通過構建耐力訓練小鼠模型對黃秋葵有效成分進行深入研究，驗證黃秋葵多糖的抗疲勞功能。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及分組

動物試驗模型共計50 只4～5 周齡健康雄性清潔級昆明種小鼠，分籠飼養(yǎng)，體質(zhì)量為18～20 g，由中國科學院上海實驗動物中心提供。試驗小鼠自由飲水進食（基礎飼料），置于溫度20～25 ℃、相對濕度45%～50%的干潔、通風、晝夜節(jié)律均衡的飼養(yǎng)室進行適應性喂養(yǎng)，1 周后體質(zhì)量達（25.00±1.44）g/只。動物試驗方法和操作程序符合國家標準和實驗動物管理與使用指南[10]。

黃秋葵樣品由本實驗室儲備。挑選干燥、無霉變的黃秋葵干果莢，粉碎過篩后取準確稱量的干黃秋葵粗粉置于三角瓶，加入設定比例的蒸餾水，在嚴格控溫下超聲提取其多糖。超聲提取結束后，過濾離心（轉(zhuǎn)速6 000 r/min），酒精沉淀過夜，去除上清液，烘干沉淀物制得黃秋葵多糖。蒸餾水由開封市龍亭科技蒸餾試劑廠提供。將50 只耐力訓練小鼠采用隨機數(shù)字表法進行分組，共計5 個組別，每組10 只，分別為：安靜組（A 組）、對照組（B 組）和黃秋葵多糖組低、中、高劑量組（C 組，依次為C1、C2和C3組，對應劑量分別為每天100、200 和400 mg/kg）。C 組受試物多糖水溶液為每日現(xiàn)用現(xiàn)配，按比例將4 mg黃秋葵多糖溶解于1 mL 蒸餾水中。B 組每日灌服蒸餾水 50 mL/kg。試驗小鼠均自由飲水。

1.2 試驗小鼠活動狀態(tài)行為學觀察和體質(zhì)量測定

1.2.1 游泳至力竭時間

除A 組外，各耐力訓練小鼠均在水池中進行游泳訓練。訓練模型為：每天上午和下午各灌胃1 次，連續(xù)灌胃10 d。末次灌胃給藥2 h 后，將小鼠置于特制恒溫游泳箱中（高60 cm、寬40 cm、水深＞35 cm，水溫25～28 ℃）進行游泳訓練，直至力竭。游泳訓練時長為3 周，第1 周為不負重訓練（適應性游泳），每日游泳30 min；第2、3 周為負重訓練（尾部負荷體質(zhì)量5% 的鉛絲），每日分別游泳40 和50 min。記錄小鼠自游泳開始到力竭的時間。

1.2.2 行為學觀察

在B、C 組小鼠進行3 周游泳訓練期間對小鼠的行為進行觀察，包括運動表現(xiàn)及精神狀態(tài)。

1.2.3 體質(zhì)量測定

在適應性游泳訓練和試驗訓練的21 d 內(nèi)，每3 d 測量和記錄1 次各組小鼠的體質(zhì)量。

1.3 耐力訓練小鼠血液和組織樣本采集

輕度麻醉后，以眼眶采血方式獲取血清標本，用于檢測肌酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）、血乳酸（BL）、尿素氮（BUN）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）指標。血液標本采集后，行斷髓法迅速處死耐力訓練小鼠，迅速取肝臟和股四頭肌組織；部分組織用生理鹽水漂洗，用濾紙吸干生理鹽水后進行低溫勻漿，獲取組織勻漿液，3 500 r/min 下離心15 min，取上清液，1～4 ℃低溫保存，測定超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）活性以及丙二醛（MDA）含量；部分股四頭肌和肝臟組織置于-10 ℃下冷藏，測定肌糖原和肝糖原含量。

1.4 指標測定

CK、LDH、BUN、GPT 和GOT 的測定采用全自動化分析儀（7600，日立，日本日立株式會社）[14]；BL 采用血乳酸分析儀（YSI1500 Sport，美國金泉YSI）測定[15]；肌糖原和肝糖原含量采用苯酚—硫酸法測定[16]；組織抗氧化指標采用南京建成生物制劑公司試劑盒（南京建成科技有限公司公司，中國）并按照說明書測定[17]。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

試驗數(shù)據(jù)以“平均值±標準差”表示，采用SPSS 22.0 軟件處理，組間比較采用獨立t檢驗。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 黃秋葵多糖對小鼠體質(zhì)量和行為的影響

由表1 可知：各組小鼠初始（0 d）體質(zhì)量組間差異均不顯著（P＞0.05）。各耐力訓練組小鼠體質(zhì)量變化趨勢與A 組相似；A 組從第14 天開始體質(zhì)量增長明顯，與初始（0 d）體質(zhì)量相比差異顯著（P＜0.05）；各耐力訓練組小鼠從第14 天開始體質(zhì)量增長趨勢有所增強，但與初始（0 d）體質(zhì)量相比差異不顯著（P＞0.05）。與單純游泳訓練的B 組相比，黃秋葵多糖處理組（C 組）小鼠體質(zhì)量增長趨勢有所增強，但仍小于A 組，提示黃秋葵多糖對疲勞運動小鼠長時間訓練造成的體質(zhì)量增長有一定緩解作用，可避免小鼠因長時間訓練造成的體質(zhì)量波動。同時，黃秋葵多糖高、中、低劑量組間小鼠體質(zhì)量差異不顯著（P＞0.05）。

表1 黃秋葵多糖對耐力訓練小鼠體質(zhì)量的影響Tab.1 Effect of okra polysaharide on the body weight of endurance training mice g

運動訓練初期（0～7 d），各組小鼠活潑好動，食欲良好，反應敏捷且皮毛光滑；運動中后期（第2～3 周），B 組小鼠隨訓練時間的延長出現(xiàn)食欲降低、反應遲鈍和皮毛蓬亂等明顯的疲勞癥狀，而C 組小鼠整體表現(xiàn)為輕微疲勞癥狀，且恢復較B 組快。

2.2 黃秋葵多糖對小鼠運動至力竭時間的影響

由表2 可知：與B 組相比，C2和C3組小鼠運動至力竭時間顯著延長（P＜0.05）；而B 組與C1組差異不顯著（P＞0.05）。同時，C3組力竭時間長于C2組（P＜0.05）。提示黃秋葵多糖高、中劑量對小鼠運動至力竭時間有延長效果，尤以高劑量作用最顯著。

表2 黃秋葵多糖對耐力訓練小鼠運動至力竭時間的影響Tab.2 Effect of okra polysaharide on the time from exercise to exhaustion in endurance training mice

2.3 黃秋葵多糖對小鼠血清指標的影響

由表3 可知：與A 組相比，B 組各項血清指標均顯著升高（P＜0.05）；與B 組相比，C2和C3組的CK 和LDH 含量均顯著降低（P＜0.05），而C1組與之相比差異均不顯著（P＞0.05）。此外，與B 組相比，C3組的BL、BUN、GPT 和GOT含量均顯著降低（P＜0.05），而C1和C2組與之相比差異均不顯著（P＞0.05）。

表3 黃秋葵多糖對耐力訓練小鼠血清指標的影響Tab.3 Effects of okra polysaharide on the indexes of serum in endurance training mice

2.4 黃秋葵多糖對小鼠肌糖原和肝糖原的影響

由表4 可知：與A 組相比，B 組肌糖原和肝糖原含量無顯著變化（P＞0.05）。與B 組相比，C1組肌糖原和肝糖原含量均無顯著變化（P＞0.05），但C2和C3組肌糖原和肝糖原含量均顯著升高（P＜0.05）。

表4 黃秋葵多糖對耐力訓練小鼠肌糖原和肝糖原含量的影響Tab.4 Effects of okra polysaharide on the contents of muscle glycogen and liver glycogen in endurance training mice mg/g

2.5 黃秋葵多糖對小鼠組織抗氧化指標的影響

由表5 可知：與A 組相比，B 組肝臟SOD 活性顯著增強（P＜0.05）；與B 組相比，C3組SOD活性顯著降低（P＜0.05）；各組間骨骼肌SOD 活性差異不顯著（P＞0.05）。與A 組相比，B 組肝臟和骨骼肌CAT 活性均顯著降低（P＜0.05）；與B 組相比，C3組肝臟和骨骼肌CAT 活性均顯著增強（P＜0.05），而C1和C2組與B 組差異不顯著（P＞0.05）。與A 組相比，B 組肝臟和骨骼肌MDA 含量顯著升高（P＜0.05）；與B 組相比，C2組和C3組肝臟和骨骼肌MDA 含量均顯著降低（P＜0.05），而C1組與B 組相比差異不顯著（P＞0.05）。

表5 黃秋葵多糖對耐力訓練小鼠肝臟和骨骼肌組織SOD 和CAT 活性以及MDA 含量的影響Tab.5 Effects of okra polysaharide on the activities of SOD and CAT,and the content of MDA in liver and skeletal muscle of endurance training mice

3 討論

糖類具有多種生物學功能，廣泛參與生物體生命活動中細胞的各種活動[18]。目前針對多糖的研究涉及生物學、醫(yī)藥學和運動醫(yī)學等眾多領域，且國內(nèi)已對大量中草藥多糖成分展開廣泛的藥理作用研究，涉及抗腫瘤、降血脂、抗氧化和抗病毒等諸多方面[19-20]。隨著運動醫(yī)學的發(fā)展，多糖的抗氧化和抗疲勞作用受到普遍重視[21]。長時間劇烈運動，機體組織自由基的產(chǎn)生可誘發(fā)脂質(zhì)過氧化，直接影響機體的運動和心臟功能；且其伴隨機體免疫功能降低，導致機體患病風險增加[22]。已有研究顯示：植物多糖（如枸杞多糖和螺旋藻多糖）具有顯著的抗疲勞活性[23-24]。

篩選高效抗氧化物質(zhì)從而發(fā)揮其抗疲勞作用、提高機體運動能力，是當前運動醫(yī)學領域迫待解決的問題。黃秋葵多糖具有廣泛的生物學功能，且中國南、北方均有黃秋葵分布和廣泛栽培。因此，本研究探討黃秋葵多糖對耐力訓練小鼠自由基代謝和糖代謝影響，以期尋找安全有效的抗疲勞物質(zhì)并為黃秋葵多糖運動保健品的開發(fā)提供依據(jù)。

本研究探究黃秋葵多糖對小鼠體質(zhì)量和行為學的影響。長期高負荷運動訓練，可直接影響機體體質(zhì)量增長。本研究表明：服用一定劑量的黃秋葵多糖可維持小鼠體質(zhì)量，并促進小鼠疲勞癥狀的恢復，提示黃秋葵多糖對運動小鼠長時間訓練造成的體質(zhì)量緩慢增長具有一定改善作用，并可直接改善小鼠疲勞癥狀。作為反映運動能力的常見指標，游泳至力竭時間可直接反映機體抗疲勞能力的變化[25]。本研究發(fā)現(xiàn)：使用中、高劑量黃秋葵多糖可顯著延長小鼠力竭時間，推測黃秋葵多糖可顯著增強小鼠肌糖原和肝糖原儲備，進而有效清除長時間運動過程中產(chǎn)生的自由基，以此抑制脂質(zhì)過氧化，提高機體運動能力。對肌糖原和肝糖原含量的測定進一步驗證了上述推測，提示黃秋葵多糖有助于確保機體運動過程中的骨骼肌能量補充，進而提升機體耐力。

游泳訓練小鼠的血清指標（CK、LDH、BL、BUN、GPT 和GOT）測定結果顯示：對照組小鼠較安靜組各指標顯著上升，提示3 周的游泳訓練造成小鼠機體CK 和LDH 釋放，使小鼠產(chǎn)生疲勞和組織損傷；服用一定劑量的黃秋葵多糖組較對照組小鼠各指標顯著下降，提示黃秋葵多糖在運動過程中有改善機體代謝、延緩蛋白質(zhì)過度利用和改善組織損傷等作用。此外，黃秋葵多糖對耐力訓練小鼠肝臟和骨骼肌組織SOD 和CAT 活性以及MDA 含量的影響顯示：長時間運動造成小鼠機體自由基大量增多，說明可造成機體抗氧化損傷以及產(chǎn)生疲勞[26]，表現(xiàn)為對照組小鼠較安靜組SOD 活性和MDA 含量升高、CAT 活性降低；而高、中劑量黃秋葵多糖的使用導致小鼠肝臟和骨骼肌CAT 活性增強、SOD 活性和MDA含量下降，提示黃秋葵多糖有助于提高機體抗氧化能力，減少肌肉組織損傷，有助于組織迅速恢復，進而維持機體組織細胞的正常功能，使機體耐力更持久、運動能力更強。

既往鮮有對黃秋葵多糖的研究。王君耀等[27]研究發(fā)現(xiàn)：黃秋葵水提液可提升小鼠耐力、耐缺氧、耐寒及耐熱能力并降低乳酸水平；周丹英等[28]報道黃秋葵膠囊對小鼠有顯著的抗疲勞作用，其研究側重于黃秋葵膠囊改善葡萄糖、蛋白質(zhì)代謝分解、調(diào)節(jié)小鼠血清尿素氮及血乳酸水平。本研究的創(chuàng)新性在于構建耐力訓練小鼠模型，以高、中、低劑量黃秋葵多糖干預試驗動物，從體質(zhì)量增長、行為學差異、運動至力竭時間、血清指標、肌糖原和肝糖原含量以及抗氧化酶活性指標等方面全面地探究黃秋葵多糖抗疲勞、抗氧化和提升機體運動能力的功能。目前，針對運動性疲勞產(chǎn)生機制的研究已從單純的代謝產(chǎn)物堆積或能量消耗轉(zhuǎn)向多因素介導的綜合作用。隨著研究的深入，認為自由基可能是運動疲勞產(chǎn)生的潛在原因，并可能與體內(nèi)糖代謝存在一定關聯(lián)，造成細胞結構和功能的破壞和損傷，進而誘導機體運動疲勞。本研究基于前人研究成果并考慮黃秋葵的潛在功能，從更全面的角度探究黃秋葵多糖對耐力訓練小鼠自由基代謝和糖代謝的影響，為發(fā)揮黃秋葵多糖的抗運動疲勞功能奠定一定的理論基礎和試驗依據(jù)。

4 結論

中、高劑量（每天200 和400 mg/kg）的黃秋葵多糖有助于延長耐力訓練小鼠游泳至力竭時間，增加肌糖原和肝糖原儲備增加機體能量，并減少自由基生成，改善小鼠抗氧化能力，促進組織迅速恢復，最終提升機體耐力，發(fā)揮良好的抗疲勞功效。