林 丹 樓江燕

四川大學(xué)華西第二醫(yī)院，四川大學(xué)出生缺陷與相關(guān)婦兒疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(成都， 610041)

子宮內(nèi)膜異位癥女性中21%～47%合并不孕癥，71%～87%并發(fā)慢性盆腔疼痛[1]。子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病機(jī)制極具爭議，當(dāng)前認(rèn)為包括經(jīng)血逆流種植理論、體腔化生理論、良性轉(zhuǎn)移、淋巴和靜脈傳播理論、機(jī)體免疫異常、遺傳學(xué)原因等[1-3]。DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶3B(DNMT3B)在子宮內(nèi)膜異位癥中異常表達(dá)促使某些基因異常甲基化，使相關(guān)基因和蛋白表達(dá)異常，從而導(dǎo)致子宮內(nèi)膜異位病變的產(chǎn)生和進(jìn)展[4]。基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)主要通過調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的更新過程參與多種病理生理過程，還能調(diào)節(jié)細(xì)胞間黏附和血管生成，在子宮內(nèi)膜異位癥中的作用不容小覷[3]。上皮來源中性粒細(xì)胞活化肽(ENA-78)是重要的血管形成因子，在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生發(fā)展過程中意義不凡[5]。本文主要探究DNMT3B、MMP-2和ENA-78在子宮內(nèi)膜異位癥的表達(dá)及相關(guān)性，為相關(guān)研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2017年3月—2020年10月本院就醫(yī)的子宮內(nèi)膜異位癥患者51例(異位癥組)。納入標(biāo)準(zhǔn)：臨床確診子宮內(nèi)膜異位癥；既往未因子宮內(nèi)膜異位癥接受過藥物治療；依從性良好，可以配合完成檢查項(xiàng)目。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其它良性或嚴(yán)重疾??；合并惡性腫瘤；近3個(gè)月內(nèi)接受過任何治療。選擇同期在本院行絕育手術(shù)的月經(jīng)周期正常健康女性37例作為對照組，排除近期患有其它疾病及近3個(gè)月內(nèi)接受任何藥物治療者。本研究獲本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，受試者均簽署知情同意書。

1.2 取材及樣本處理

異位癥組行腹腔鏡手術(shù)時(shí)采集異位內(nèi)膜組織和在位內(nèi)膜組織樣本，對照組在行絕育手術(shù)時(shí)采集子宮內(nèi)膜組織樣本。所有樣本采集后立即用10%中性福爾馬林固定，經(jīng)脫水處理后石蠟包埋制成組織蠟塊，連續(xù)切片。每份組織樣本各取一張切片進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色，顯微鏡下觀察，以觀察到典型子宮內(nèi)膜組織作為樣本合格標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 檢測方法

樣本DNMT3B、MMP-2、ENA-78表達(dá)采用基于鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法(SP)的免疫組化染色檢測。檢測用鼠抗人DNMT3B單克隆抗體、鼠抗人ENA-78單克隆抗體均為英國Abbexa公司產(chǎn)品，鼠抗人MMP-2單克隆抗體、SP免疫組化染色試劑盒、山羊血清、DAB顯色試劑盒均為賽默飛世爾科技(中國)有限公司產(chǎn)品。工作濃度DNMT3B一抗為1:200，MMP-2一抗為1:100，ENA-78一抗工作濃度為1:150。陰性對照使用PBS替代一抗，陽性對照使用已知陽性樣本。

1.4 結(jié)果判斷

DNMT3B、MMP-2、ENA-78免疫組化陽性著色主要定位在細(xì)胞漿，呈棕黃色。每張樣本切片隨機(jī)選擇高倍鏡(×400)下至少5個(gè)視野觀察組織染色情況，結(jié)果判定參考文獻(xiàn)[6]，即統(tǒng)計(jì)陽性著色細(xì)胞檢出率和細(xì)胞著色強(qiáng)度并分別計(jì)分，陽性著色細(xì)胞檢出率計(jì)分：<5%計(jì)0分，5%～25%計(jì)1分，26%～50%計(jì)2分，51%～75%計(jì)3分，>75%計(jì)4分；細(xì)胞著色強(qiáng)度計(jì)分：無著色計(jì)0分，淡黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，深棕色計(jì)3分；陽性程度判斷標(biāo)準(zhǔn)：(陽性著色細(xì)胞檢出率計(jì)分+細(xì)胞著色強(qiáng)度計(jì)分)/2，<0.5分為陰性(-)，0.5～<1.5分為弱陽性(+)，1.5～2.5分為中陽性(++)，>2.5分為強(qiáng)陽性(+++)。由2位病理醫(yī)生分別獨(dú)自完成免疫組化結(jié)果判讀，判讀結(jié)果不同時(shí)共同商討確定最終結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 組織中DNMT3B、MMP-2、ENA-78表達(dá)

異位癥組年齡(33.1±7.1)歲(23～46歲)，對照組年齡(33.4±4.8)歲(25～42歲)，兩組年齡構(gòu)成無差異(t=0.230，P=0.818)。DNMT3B、MMP-2、ENA-78在不同子宮內(nèi)膜組織中表達(dá)的免疫組化見圖1(2014頁)。異位內(nèi)膜中DNMT3B、MMP-2、ENA-78的表達(dá)陽性率均高于在位內(nèi)膜和對照組子宮內(nèi)膜(P<0.05)，而在位內(nèi)膜和對照組子宮內(nèi)膜無差異(P>0.05)。見表1。

表1 不同子宮內(nèi)膜組織中DNMT3B、MMP-2、ENA-78表達(dá)比較(例)

2.2 異位內(nèi)膜中DNMT3B、MMP-2、ENA-78表達(dá)相關(guān)性

Spearman相關(guān)性分析顯示，在異位內(nèi)膜中DNMT3B、MMP-2表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.426，P=0.002)，MMP-2、ENA-78表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.289，P=0.040)，DNMT3B、ENA-78表達(dá)無相關(guān)性(r=0.097，P=0.499)。

2.3 DNMT3B、MMP-2、ENA-78診斷子宮內(nèi)膜異位

以DNMT3B、MMP-2、ENA-78分別在異位癥組異位內(nèi)膜和對照組子宮內(nèi)膜中的表達(dá)情況進(jìn)行ROC曲線分析，結(jié)果見表2。DNMT3B、MMP-2、ENA-78聯(lián)合檢測的AUC(0.924) 高于DNMT3B、ENA-78檢測(Z=2.077、2.717，P<0.05)，但與MMP-2檢測相差不大(Z=1.731，P=0.08)。DNMT3B、MMP-2、ENA-78聯(lián)合檢測的準(zhǔn)確度高于各單指標(biāo)檢測(Z=3.048、2.885、3.364，P<0.01)。

表2 各檢測指標(biāo)診斷子宮內(nèi)膜異位癥效能

3 討論

子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，病情多變，復(fù)發(fā)可能性高，為臨床診療帶來了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。目前普遍認(rèn)為，子宮內(nèi)膜異位癥是一種表觀遺傳學(xué)病癥，其產(chǎn)生、發(fā)展與DNA甲基化息息相關(guān)[4]。DNMT3B作為DNA甲基化的關(guān)鍵酶，近幾年成為子宮內(nèi)膜異位癥疾病發(fā)生機(jī)理研究指標(biāo)。Wu等[7]研究表明，DNMT3B mRNA在子宮內(nèi)膜異位癥內(nèi)膜表達(dá)高于在位內(nèi)膜和對照正常內(nèi)膜。胡啟彩等[8]與李德奎等[9]研究報(bào)道，與非子宮內(nèi)膜異位癥對比，子宮內(nèi)膜異位癥患者DNMT3B表達(dá)水平升高。本次研究發(fā)現(xiàn)，DNMT3B在異位癥組異位內(nèi)膜中的表達(dá)陽性率高于在位內(nèi)膜和對照組子宮內(nèi)膜，提示DNMT3B在內(nèi)膜中過表達(dá)可能提高了DNA甲基化水平，造成某些基因和蛋白的異常表達(dá)，從而促進(jìn)內(nèi)膜異位生長，促進(jìn)病灶的形成和進(jìn)展。但與本次研究結(jié)果不符的是，王禮賢等[10]研究認(rèn)為，DNMT3B mRNA在子宮內(nèi)膜異位癥患者的在位內(nèi)膜、異位內(nèi)膜中的表達(dá)水平均低于對照組子宮內(nèi)膜。推測原因可能在于受試人群、樣本及樣本量等差別。

子宮內(nèi)膜異位癥雖是良性病，但卻具有包括局部浸潤性生長、遠(yuǎn)處種植遷移、新生血管生成等在內(nèi)的惡性特質(zhì)[1-3]。MMPs是一種重要的細(xì)胞外基質(zhì)轉(zhuǎn)換酶，與子宮內(nèi)膜異位癥的惡性特質(zhì)有關(guān)[11-12]。在異位病變子宮內(nèi)膜和(或)在位子宮內(nèi)膜中活躍的MMPs可導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)自毀，進(jìn)而促進(jìn)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞向更深組織層侵襲，這是子宮內(nèi)膜異位病變局部形成和擴(kuò)散的必要過程[12]。MMP-2作為MMPs家族中的主要成員，成為子宮內(nèi)膜異位癥疾病發(fā)生機(jī)理研究的熱門指標(biāo)。Sui等[3]研究發(fā)現(xiàn)，MMP-2在子宮內(nèi)膜異位癥患者血清、腹膜液和子宮內(nèi)膜中表達(dá)水平均高于非子宮內(nèi)膜異位癥對照組；Cazacu等[11]報(bào)道，MMP-2在子宮內(nèi)膜異位病變中的表達(dá)水平高于在位內(nèi)膜；Nanda等[13]也認(rèn)為，與非子宮內(nèi)膜異位癥對照組相比，子宮內(nèi)膜異位癥的MMP-2表達(dá)顯著增加。本次研究，MMP-2在異位癥組異位內(nèi)膜中的表達(dá)陽性率高于在位內(nèi)膜和對照組子宮內(nèi)膜，提示MMP-2在內(nèi)膜中過表達(dá)，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜細(xì)胞外基質(zhì)過分降解，助長異位內(nèi)膜的侵襲、粘附和種植能力，致使生成新血管，從而促成內(nèi)膜異位生長，造成病情進(jìn)一步發(fā)展。

子宮內(nèi)膜異位癥屬慢性炎癥，特征是全身和局部某些促炎細(xì)胞因子和生子因子增加、免疫失調(diào)[1-2]。ENA-78作為重要的炎癥相關(guān)趨化性細(xì)胞因子和血管生成因子，成為子宮內(nèi)膜異位癥研究重點(diǎn)。金莉等[14]研究報(bào)道，ENA-78在子宮內(nèi)膜異位癥患者中高表達(dá)；顧華芬等[15]研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜異位癥患者血清ENA-78水平高于子宮內(nèi)膜在位的良性腫瘤患者和健康女性；劉洋等[5]研究發(fā)現(xiàn)，與正常健康人群對比，子宮內(nèi)膜異位癥患者血清ENA-78含量增加。本次研究，異位癥組異位內(nèi)膜中ENA-78表達(dá)陽性率高于在位內(nèi)膜和對照組子宮內(nèi)膜，提示ENA-78在異位內(nèi)膜中過表達(dá)，可導(dǎo)致組織局部缺氧缺血，造成類似炎癥的纖維化，加重盆腔粘連；還可促進(jìn)新血管的產(chǎn)生，從而參與子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生。

本研究分析顯示，異位內(nèi)膜中DNMT3B與MMP-2的表達(dá)正相關(guān)，推測異位內(nèi)膜中DNMT3B的表達(dá)可能通過改變DNA甲基化狀態(tài)來改變異位內(nèi)膜中MMP-2表達(dá)；異位內(nèi)膜中MMP-2的表達(dá)也可能通過某種途徑來影響異位內(nèi)膜中DNMT3B表達(dá)，二者協(xié)同作用促進(jìn)子宮內(nèi)膜異位癥的產(chǎn)生和進(jìn)展；異位內(nèi)膜中MMP-2與ENA-78的表達(dá)正相關(guān)，推測異位內(nèi)膜中MMP-2和ENA-78的表達(dá)可能通過某種途徑相互影響，共同促成異位內(nèi)膜血管的形成，在子宮內(nèi)膜異位癥的產(chǎn)生和進(jìn)展中起協(xié)同作用。本次研究分析，DNMT3B、MMP-2、ENA-78聯(lián)合檢測診斷子宮內(nèi)膜異位癥的價(jià)值較高，診斷準(zhǔn)確度高于單項(xiàng)指標(biāo)檢測。

綜上所述，DNMT3B、MMP-2、ENA-78在異位內(nèi)膜中的陽性率顯著增加，可能3者協(xié)同參與了疾病的發(fā)生發(fā)展；3項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合檢測診斷子宮內(nèi)膜異位癥具有較好的準(zhǔn)確性，有望作為疾病診斷、監(jiān)測及預(yù)后的可靠指標(biāo)；在子宮內(nèi)膜異位癥中的相互作用機(jī)制及其診治價(jià)值仍有待進(jìn)一步研究。