黃珍愷，丁 煒

南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210000

急性肝損傷（acute liver injury，ALI）是在無慢性肝臟疾病的情況下出現(xiàn)急性肝損傷，臨床主要表現(xiàn)為凝血功能障礙、黃疸和肝性腦病［1］。最新研究主要是根據(jù)黃疸出現(xiàn)和肝性腦病出現(xiàn)之間的間隔來將急性肝損傷分為超急性、急性和亞急性［2-4］。近年來研究發(fā)現(xiàn)庫普夫細(xì)胞（kupffer cells，KCs）在ALI中起著重要作用，KCs可以分泌多種細(xì)胞因子加重肝損傷［5］。例如KCs 可以分泌腫 瘤 壞死 因子α（tumor necrosis factor- α，TNF-α）、白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）加重肝臟炎癥，促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡［6］；分泌單核細(xì)胞趨化蛋白1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）、CC家族趨化因子配體7（C-C motif chemokine ligand 7，CCL7）促進(jìn)單核細(xì)胞浸潤；分泌CXC 家族趨化因子配體1（C-X-C Motif Chemokine Ligand 1，CXCL1）、CXC 家族趨化因子配體2（C-XC Motif Chemokine Ligand 2，CXCL2），促進(jìn)中性粒細(xì)胞浸潤進(jìn)一步擴(kuò)大肝臟炎癥［7-8］，因此抑制KCs活化成為治療急性肝損傷的重要靶點(diǎn)。

姜黃素是姜黃Curcuma longa L. 的主要活性成分，從姜黃的干燥根莖粉中提取。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明［9-10］，姜黃素對(duì)急性肝損傷具有明確的保護(hù)作用，但具體機(jī)制仍不清楚。本研究擬從體外實(shí)驗(yàn)觀察姜黃素對(duì)KCs 的作用，并以此來解釋姜黃素對(duì)急性肝損傷的保護(hù)作用。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞KCs 提取于正常SPF 級(jí)雄性C57BL/6小鼠，肝臟KCs的提取和培養(yǎng)采用原位灌注、離體膠原酶消化和梯度離心法，相關(guān)步驟參照吳明兵等［11］的操作方法。

1.2 藥物及試劑姜黃素（美國abcam 公司，純度＞95%，HPLC，批號(hào)：ab120618）；LPS（美國R&D 公司，批號(hào)：L2630）；WB一抗抗體ERK1/2（美國CST公司，批號(hào)：8544）；p-ERK1/2（美國CST 公司，批號(hào)：4376）；P38（美國CST 公司，批號(hào)：8690）；p-P38 抗體（美國CST 公司，批號(hào)：8632）；JNK（美國CST 公司，批號(hào)：9253）；p-JNK抗體（美國CST公司，批號(hào)：9255）；GAPDH（中國Bioworld公司，批號(hào)：AP0063）；WB 二抗-辣根過氧化酶標(biāo)記羊抗兔IgG（北京世紀(jì)康為公司，批號(hào)：CW010M）；Trizol 試劑盒（美國Invitrogen公司，批號(hào)：15596-019）；DEPC水（上海碧云天生物公司，批號(hào)：R0021）；q-PCR 逆轉(zhuǎn)錄（日本TaKaRa公司，批號(hào)：號(hào)RR420A）；DMEM培養(yǎng)基（美國gibco 公司，批號(hào)：C11995500BT）；胎牛血清（美國gibco 公司，批號(hào)：10091-148）；雙抗（美國gibco 公司，批號(hào)：15140-122）；q-PCR 熒光試劑盒（日本TaKaRa公司，批號(hào)：RR036A）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器applied biosystems Quant-StudioTM 6 Flex Real-time-PCR 儀（美國Life Technologies）；applied biosystems 2720 Thermal cycler 型RNA 逆轉(zhuǎn)錄儀（美國Life Technologies）；PowerPacTMUniversal 型電泳儀（美國BIO-RAD 公司）；Tanon 5200 Multi 型全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）；3111型細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher）；EL-01-220型單模塊金屬浴（美國major science）；V2 S025型渦旋振蕩器（德國IKA），IKA mini G 型微型離心機(jī)（德國IKA）；Heraeus Fresco 21 型冷凍高速離心機(jī)（美國Thermo Fisher）；Bx60 型生物顯微鏡（日本Olympus）；T50型勻漿機(jī)（德國IKA）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)首先通過細(xì)胞毒理實(shí)驗(yàn)篩選合適的藥物實(shí)驗(yàn)濃度：用完全培養(yǎng)基（包含44%DMEM 培養(yǎng)基、5%FBS 和1% 雙抗）重懸KCs，調(diào)整細(xì)胞濃度至5x104/mL。96孔板每孔中加入150 μL細(xì)胞懸液，并置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h。在不同的培養(yǎng)孔中分別加入不同濃度姜黃素（0、2.5、5、10、20、40和80 μM），每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)副孔，預(yù)處理共培養(yǎng)3 h 后，每孔加入400 ng/m LPS，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育12 h。然后將96孔板拿出，將每個(gè)孔加入細(xì)胞增殖/毒性的試劑（Cell Counting Kit-8，CCK-8）10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)30 min。最后用設(shè)定為450 nm波段的酶標(biāo)儀讀取各孔數(shù)據(jù)。見圖1。

圖1 姜黃素對(duì)KCs活力示意圖

2.2 姜黃素干預(yù)實(shí)驗(yàn)根據(jù)姜黃素預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取了本次姜黃素實(shí)驗(yàn)藥物濃度：2.5、5、10 μM。用完全培養(yǎng)基（包含44% DMEM 培養(yǎng)基、5% FBS 和1% 雙抗）重懸KCs，調(diào)整細(xì)胞濃度至5x104/mL。6孔板中分別加入4 mL，并在各孔中加入不同濃度的姜黃素（0、2.5、5、10 μM），每個(gè)濃度設(shè)3 個(gè)副孔，預(yù)處理共培養(yǎng)3 h后，每孔加入400 ng/mLLPS，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育12 h。然后收集細(xì)胞蛋白和mRNA進(jìn)行檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

2.3 炎癥因子和趨化因子mRNA 水平采用實(shí)時(shí)定量PCR 方法檢測(cè)KCs 細(xì)胞中炎癥因子和趨化因子mRNA變化，吸棄KCs培養(yǎng)上清，用4℃預(yù)冷的PBS清洗兩遍，加入1 mL TRozl進(jìn)行裂解核蛋白。根據(jù)TRIzol試劑操作說明提取細(xì)胞中的總RNA，然后根據(jù)PrimeScript RT Master Mix 試劑盒操作說明將其轉(zhuǎn)化為cDNA，最后根據(jù)SYBR Premix ExTaq試劑盒操作說明在Step-One Plus 上進(jìn)行了實(shí)時(shí)定量PCR。每個(gè)樣本3 個(gè)復(fù)孔，得到閾循環(huán)值（Ct）平均值，計(jì)算△△CT值，各個(gè)樣本的mRNA表達(dá)水平均以2-△△CT表示。最終結(jié)果由軟件自動(dòng)求出。引物序列號(hào)見表1。

表1 引物序列號(hào)

2.4 通路蛋白檢測(cè)采用Western 印跡法檢測(cè)KCs中細(xì)胞通路蛋白，吸棄KCs培養(yǎng)上清，用4℃遇冷的PBS清洗兩遍，利用凱基全蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞全蛋白。用雙氰胺酸（bicinchoninic acid，BCA）法定量蛋白質(zhì)后，用10% 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離總蛋白，轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。將PVDF 膜在3% 牛血清白蛋白（bicinchoninic acid，BSA）中在室溫封閉1 h，然后與各種一抗抗體孵育：ERK1/2（1∶2000）、p-ERK1/2（1∶2000）、P38（1∶2000）、p-P38抗體（1∶1000）、JNK（1∶1000）、p-JNK抗體（1∶2000）4℃過夜，TBST洗滌6次，3 min×3次，10 min×3次。然后與羊抗兔IgG二抗（1∶10000）孵育1.5 h，TBST洗膜3次，每次10 min。加入化學(xué)發(fā)光試劑，并在全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像分析系統(tǒng)上發(fā)光成像，留取圖片，行蛋白半定量分析。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±s 表示，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 KCs 鑒定體外分離原代細(xì)胞后，予以含10%FBS 和1% 雙抗的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。體外培養(yǎng)30 min 后可見KCs 細(xì)胞貼壁。培養(yǎng)48 h 后，可見細(xì)胞呈現(xiàn)出星型、多角形和梭形，伸出偽足，見圖2A。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其純度，可見KCs 細(xì)胞（CD45+F4/80+細(xì)胞）比例達(dá)95%，見圖2B，可用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

圖2 體外分離培養(yǎng)小鼠肝臟KCs和流式鑒定

3.2 炎癥因子水平與空白對(duì)照組相比，LPS 刺激KCs 后炎癥因子TNF-α、IL-1β 和IL-6 的mRNA表達(dá)均明顯升高（P＜0.01）。而予以姜黃素預(yù)處理之后，KCs表達(dá)的炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA 則顯著降低（P＜0.01），且呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性，高劑量組TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表達(dá)較低劑量組和中劑量組明顯降低（P＜0.01）。見圖3。

圖3 姜黃素抑制LPS誘導(dǎo)的KCs分泌炎癥因子水平

3.3 趨化因子水平與空白對(duì)照組相比，LPS 刺激KCs 后趨化因子CXCL1、CXCL2 和MCP-1 的mRNA表達(dá)均明顯升高（P＜0.01）。而予以姜黃素預(yù)處理之后，KCs表達(dá)的炎癥因子CXCL1、CXCL2和MCP-1的mRNA則顯著降低，且呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性，高劑量組CXCL1、CXCL2 和MCP-1 的mRNA 表達(dá)較低劑量組和中劑量組明顯降低（P＜0.01）。見圖4。

圖4 姜黃素抑制LPS誘導(dǎo)的KCs分泌趨化因子水平

3.4 ERK1/2、P38和JNK通路LPS刺激和姜黃素預(yù)處理后ERK1/2、P38和JNK蛋白的總蛋白表達(dá)沒有變化，但ERK1/2、P38 和JNK 蛋白磷酸化水平明顯升高。通過IPP軟件對(duì)WB條帶進(jìn)行的灰度值測(cè)算，可見姜黃素抑制LPS 引起的的ERK1/2、P38 和JNK蛋白磷酸化水平具有劑量依賴性。見圖5。

圖5 姜黃素抑制LPS誘導(dǎo)的信號(hào)通路表達(dá)

4 討論

急性肝損傷是世界性的醫(yī)療難題，多種病理因素均可以導(dǎo)致急性肝損傷的發(fā)生，如藥源性的撲熱息痛、病毒性的乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）和甲型肝炎病毒（Hepatitis A virus）及酒精等因素［4，12］。在美國，每年接近30 萬人因服用撲熱息痛而導(dǎo)致急性肝損傷［1］。既往研究發(fā)現(xiàn)，藥物及酒精引起的急性肝損傷發(fā)生機(jī)制與肝臟細(xì)胞內(nèi)過度氧化應(yīng)激有關(guān)，而HBV 引起的急性肝損傷和細(xì)胞毒性T 細(xì)胞過度活化相關(guān)［13］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，固有免疫也參與急性肝損傷，特別是Kupffer 細(xì)胞在急性肝損傷中起著重要的作用，抑制Kupffer細(xì)胞功能可以緩解肝損傷［5，13］。

近年來對(duì)KCs 在急性肝損傷中的作用研究頗多，大量研究表明，其主要是通過分泌炎癥相關(guān)細(xì)胞因子和趨化因子從而加重肝損傷［5，9］。CAMILLE等［14］研究發(fā)現(xiàn)，KCs 在肝損傷早期可以被損傷相關(guān)的分子模式（damage associated molecular patterns，DAMPs）分子激活后分泌大量促炎細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-1β 和IL-6。這些促炎因子進(jìn)一步加重肝臟炎癥，促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡。KUBES等［15］研究發(fā)現(xiàn)，KCs 分泌CXCL1 和CXCL2 趨化中性粒細(xì)胞浸潤，中性粒細(xì)胞浸潤后通過死亡受體直接導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡［16］。另外，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Kupffer 細(xì)胞分泌CCL7 和MCP-1 趨化單核細(xì)胞浸潤，導(dǎo)致Ly6Chi單核細(xì)胞浸潤［15］。這些單核細(xì)胞浸潤后通過分泌促炎和促纖維化細(xì)胞因子擴(kuò)大肝臟炎癥，并引起肝臟纖維化［17］。

姜黃素是從姜黃干燥根莖粉中提取的主要活性成分。多項(xiàng)體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)姜黃素對(duì)急性肝損傷具有治療作用［18-19］。本實(shí)驗(yàn)通過姜黃素與KCs 體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，姜黃素可以抑制LPS 和KCs促炎細(xì)胞因子和趨化因子的分泌，提示姜黃素可能通過抑制KCs 分泌促炎細(xì)胞因子和趨化因子來減輕肝臟炎癥。KCs 活化分泌細(xì)胞因子與ERK1/2通路磷酸化相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)姜黃素可以降低LPS 和KCs 共培養(yǎng)后ERK1/2 通路磷酸化水平，提示姜黃素可能是通過抑制ERK1/2通路來抑制KCs活化分泌細(xì)胞因子。ERK1/2、P38和JNK蛋白通路是公認(rèn)的巨噬細(xì)胞活化、分泌細(xì)胞因子和趨化因子的重要細(xì)胞通路［20-21］，本研究結(jié)果表明姜黃素抑制LPS 引起的的ERK1/2、P38 和JNK 蛋白磷酸化水平具有劑量依賴性。

綜上所述，通過體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)姜黃素可以抑制KCs 活化，減少促炎細(xì)胞因子和趨化因子的分泌，解釋了姜黃素治療ALF 的機(jī)理。為姜黃素的臨床應(yīng)用提供科學(xué)合理的理論依據(jù)，也提示了姜黃素可能是治療急性肝損傷的有效藥物之一。