安 琦，曹亞彬，牛彥波，原 韜

(黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，哈爾濱 150010)

大麥草是具有豐富營(yíng)養(yǎng)價(jià)值且耐鹽堿的優(yōu)質(zhì)牧草。我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)規(guī)模逐漸擴(kuò)大，牧草需求也不斷增加[1]，在探索和尋求飼料原料新來(lái)源的過(guò)程中，開(kāi)發(fā)利用鹽堿土地，種植高耐受性作物大麥草被認(rèn)為是解決畜牧飼料匱乏的辦法之一。大麥草具有多種飼喂方式，不但能夠直接放牧進(jìn)食，還可以制備便于存儲(chǔ)的青貯飼料或曬制成干草。不論是青貯或是干草，都可以滿足牧草短缺季節(jié)飼料供應(yīng)的需求。與干草相比，青貯具備更好的適口性和更豐富的營(yíng)養(yǎng)，能夠?yàn)檫M(jìn)食動(dòng)物建立更健康的腸道體系，提高畜禽綜合免疫能力。因此，與晾曬干草相比，青貯大麥草是更加科學(xué)合理的貯存方式[2]。經(jīng)過(guò)青貯制備后的大麥草飼料富含豐富的蛋白質(zhì)，青貯過(guò)程中維生素、礦物質(zhì)得到了充分保留，為進(jìn)食動(dòng)物獲取均衡的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源提供了充分保障。經(jīng)過(guò)青貯發(fā)酵后，大麥草口感得到進(jìn)一步提升，具備了與水果相似的香味，可促進(jìn)動(dòng)物進(jìn)食。

目前，在大麥草青貯生產(chǎn)中還存在不少技術(shù)難題，其中比較突出的問(wèn)題是大麥草本身附著乳酸菌少，青貯生產(chǎn)若使用天然乳酸菌，發(fā)酵速度較慢，不利于生產(chǎn)，會(huì)造成較大的經(jīng)濟(jì)損失[3-4]。市面上缺乏適用于大麥草青貯的專(zhuān)用青貯接種劑，外源接種劑普遍難以適應(yīng)大麥草青貯環(huán)境，應(yīng)用后競(jìng)爭(zhēng)能力低、發(fā)酵啟動(dòng)慢、生產(chǎn)中會(huì)造成比較大的物料消耗[5-6]。以大麥草作為初始底物，經(jīng)過(guò)篩選鑒定得到產(chǎn)酸桿菌共11株，針對(duì)這些菌株開(kāi)展產(chǎn)酸檢測(cè)，篩選出優(yōu)良菌株，利用16sr DNA方法檢測(cè)，通過(guò)BLAST比對(duì)，得到1株優(yōu)良的大麥草青貯發(fā)酵菌株，確定為植物乳桿菌。通過(guò)與野生大麥草乳酸菌及市售非專(zhuān)用青貯菌株進(jìn)行對(duì)比，分離純化得到的植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)在生長(zhǎng)速度、產(chǎn)酸能力、發(fā)酵青貯品質(zhì)等方面具有優(yōu)勢(shì)，有望應(yīng)用于大麥草青貯生產(chǎn)中。

1 材料與方法

1.1 材料

大麥草自然青貯樣品由飼料企業(yè)提供；植物乳桿菌1431、1426株分離自玉米秸稈青貯飼料和市售青貯接種劑商品。

1.2 方法

1.2.1 菌株篩選與鑒定

采集自然大麥草青貯作為實(shí)驗(yàn)樣品，按比例稀釋后，利用加鈣的MRS固體培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。采用平板稀釋方法分離乳酸菌菌株，在平板上挑取溶鈣圈較大的菌落，純化菌株，轉(zhuǎn)接斜面培養(yǎng)基保存。復(fù)篩使用MRS液體培養(yǎng)基(添加4%葡萄糖)，接種后28℃靜止培養(yǎng)48 h后采用滴定法檢測(cè)總酸。復(fù)篩選生產(chǎn)菌株，切碎的大麥草與水按1∶3比例混合攪勻后進(jìn)行過(guò)濾，濾液中補(bǔ)加0.5%葡萄糖，接種目的菌株后于28℃靜置培養(yǎng)，定期檢測(cè)菌株的生長(zhǎng)速度快和產(chǎn)酸能力，選取生長(zhǎng)速度快、產(chǎn)酸能力強(qiáng)的菌株進(jìn)行16srDNA鑒定。

1.2.2 大麥草青貯制備

將大麥草切碎至約4 cm后進(jìn)行滅菌處理，接種2.5%乳酸菌菌液后充分混合，用抽真空袋進(jìn)行分裝，每袋裝入約500 g大麥草，于28℃靜置培養(yǎng)，定期檢測(cè)總酸與pH。

1.2.3 青貯生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)

粉碎的大麥草與稻糠按10∶1進(jìn)行混合后接種2.5%乳酸菌菌液，充分混勻，密封打包后室溫放置30 d，定期開(kāi)包檢查青貯效果，每次生產(chǎn)可加工7 t大麥草。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有采集數(shù)據(jù)采用 Excel 軟件進(jìn)行前期處理，用 SPSS 19.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，進(jìn)行多重比較，結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 初篩菌株的分離及產(chǎn)酸能力檢測(cè)

在自然大麥草青貯樣品中分離出目的菌株11株。對(duì)初篩菌株于4%葡萄糖MRS液體培養(yǎng)基中28℃靜止培養(yǎng)48 h后，檢測(cè)其總酸含量，結(jié)果如表1。初篩菌株1729、1723、1730的產(chǎn)酸能力較高，與其他菌株存在顯著性差異(P<0.05)。

表1 初篩菌株產(chǎn)酸能力測(cè)定Tab.1 Determination of acid production capacity of primary screening strains

2.2 復(fù)篩菌株生長(zhǎng)速度檢測(cè)

乳酸菌在青貯中的起始濃度和生長(zhǎng)速度對(duì)青貯至關(guān)重要。為了篩選出具有生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)的乳酸菌，對(duì)復(fù)篩菌株1723、1729、1730的生長(zhǎng)速度進(jìn)行簡(jiǎn)單的測(cè)定，相同的培養(yǎng)條件下，菌株1723的菌體數(shù)量顯著高于菌株1729和1730(P<0.05)，生長(zhǎng)速度顯著快于其他菌株。

表2 復(fù)篩菌株菌體生長(zhǎng)速度Tab.2 Growth rate of re-screened strains

2.3 菌株對(duì)大麥草的青貯能力

將篩選出的大麥草青貯菌株1723、分離自玉米秸稈青貯飼料的菌株1431、分離自市售青貯接種劑商品1426共3株植物乳桿菌的產(chǎn)酸情況進(jìn)行比較，每隔12 h監(jiān)測(cè)其產(chǎn)酸情況。結(jié)果如表3所示，在青貯前期8 h、16 h，大麥草青貯菌株1723產(chǎn)酸速度顯著快于其他兩株非專(zhuān)用菌株。24 h后，菌株1723和菌株1431的產(chǎn)酸值具有顯著性差異，與菌株1426無(wú)顯著差異性。由此可見(jiàn)，在青貯前期菌株1723具有顯著性的產(chǎn)酸優(yōu)勢(shì)(P<0.05)。

表3 不同菌株對(duì)大麥草的青貯能力Tab.3 Silage capacity of different strains to barley grass

2.4 菌株鑒定結(jié)果

對(duì)菌株1723進(jìn)行鑒定，如圖1所示，經(jīng)16srDNA擴(kuò)增后，在1 700 bp左右出現(xiàn)目的擴(kuò)增產(chǎn)物。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序后，與Genbank進(jìn)行序列BLAST比對(duì)，結(jié)果如圖2所示，目的菌株1723與植物乳桿菌的相似度為99%。

圖1 目的菌株的比對(duì)結(jié)果Fig.1 Comparison results of target strains

圖2 目的菌株的比對(duì)結(jié)果Fig.2 Comparison results of target strains

2.5 青貯的發(fā)酵品質(zhì)

使用植物乳桿菌1723、1426、1431對(duì)大麥草進(jìn)行青貯30 d后對(duì)其發(fā)酵品質(zhì)進(jìn)行評(píng)估。如表4所示，感官指標(biāo)顯示，青貯物料均未腐敗，呈現(xiàn)綠黃色，伴有清香甜味。大麥草專(zhuān)用菌株1723的青貯pH和氨肽氮/總氮顯著低于其他兩組(P<0.05)，而其有機(jī)酸含量和中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維指標(biāo)差異不顯著(P>0.05)。

表4 青貯的發(fā)酵品質(zhì)Tab.4 Quality of ferment Silage

3 討論

隨著畜牧產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，飼料原料來(lái)源覆蓋日益廣泛。大麥草具有豐富的營(yíng)養(yǎng)，是新興的飼料原料[7]。大麥草可以制備為青貯飼料，應(yīng)用于冬春季飼喂。青貯飼料與干飼料相比，適口性好，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高[8-9]。在制備青貯飼料的過(guò)程中，由于大麥草攜帶乳酸菌數(shù)量低，依靠自身乳酸菌進(jìn)行天然發(fā)酵速度較慢，發(fā)酵效果不理想[10-11]。若采用市售通用青貯接種劑，外源乳酸菌對(duì)大麥草適應(yīng)性較低，缺乏環(huán)境競(jìng)爭(zhēng)力，生產(chǎn)中易造成較大損失。因此，由大麥牧草出發(fā)分離純化適用于大麥牧草的青貯用乳酸菌株具有較高的應(yīng)用價(jià)值，經(jīng)過(guò)分離篩選，核酸水平鑒定，分離出源自大麥牧草的植物乳桿菌菌株。經(jīng)過(guò)產(chǎn)酸能力檢測(cè)、生長(zhǎng)速度測(cè)定與回接青貯實(shí)驗(yàn)，與野生乳酸菌株和非大麥草青貯商品菌株進(jìn)行對(duì)比，生長(zhǎng)速度產(chǎn)酸能力均優(yōu)于野生及非專(zhuān)用商品菌株。該菌株作為大麥牧草來(lái)源的青貯飼料發(fā)酵專(zhuān)屬菌株，具有更好的物料適應(yīng)性，更高的發(fā)酵環(huán)境競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，可提高生產(chǎn)速度，降低生產(chǎn)過(guò)程中的物料損失，提高了大麥牧草產(chǎn)品品質(zhì)和生產(chǎn)利潤(rùn)，有望在大麥牧草青貯生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。