曹 錕，王若男 ，方雅莉，石植真，熊興東，劉新光,

（1.廣東醫(yī)科大學, 衰老研究所, 生物化學與分子生物學研究所, 廣東省醫(yī)學分子診斷重點實驗室,廣東東莞 523808；2.廣東醫(yī)科大學科研平臺服務管理中心, 廣東東莞 523808）

近年來，有益菌被用于食品相關的生產(chǎn)加工屢見不鮮，因為其除了能夠提供給人體營養(yǎng)物質(zhì)之外，也對腸道微生物菌群的平衡起到重要作用[1-3]。干酪乳桿菌是一類有益于人體健康的活性微生物食品原料，與嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌一起被稱為“健康三益菌”[4-5]。近年來，干酪乳桿菌經(jīng)常被用作豆奶、酸乳、牛奶、干酪和奶油等乳制品的發(fā)酵工藝中，這可能與該菌在發(fā)酵過程中擁有較高的乳酸脫氫酶（LDH）活性密不可分[6-9]。該菌的最適生長溫度為37 ℃，但是發(fā)酵工程中，往往需要提高溫度抑制雜菌的生長，甚至需要加熱殺菌以保證奶制品的品質(zhì)，這可能會導致發(fā)酵效率降低甚至口感改變，這也是相關食品生產(chǎn)過程中遭遇的難題[10-11]。

LDH廣泛存在于動物、植物、細菌、真菌等幾乎所有生命體的組織細胞中。該酶一般是以輔酶煙酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH傳遞氫，在生物體內(nèi)能夠催化丙酮酸形成乳酸[12-16]。LDH是同源四聚體結構，一個酶分子含有4個相同的亞基，每個亞基的催化功能都是相對獨立的，當催化底物分子為丙酮酸時，該酶首先和輔酶 NADH 發(fā)生結合，進而丙酮酸與該酶結合并接受 NADH 提供的[H]，丙酮酸發(fā)生氧化反應，最終生成乳酸和NAD+的產(chǎn)物[17]。

通常情況下，LDH 可將手性的α-酮酸還原生成手性α-羥基酸，故該酶的底物非常廣泛，除丙酮酸外，還有對羥基苯丙酮酸、草酰乙酸、蘋果酸和苯甲酰甲酸等[18]。因此，研究不同溫度梯度條件對LDH酶活性的影響，對生命體具有普遍性意義。然而，目前研究LDH熱穩(wěn)定性的方法主要體現(xiàn)在常規(guī)的實驗方法上，該方法無法直觀反映出溫度引起氨基酸殘基的波動性、回旋半徑、溶劑可及表面積等微觀原子水平的變化程度。隨著計算生物學的發(fā)展，近年來，越來越多的研究者采用分子動力學模擬的技術手段來研究蛋白質(zhì)分子的運動軌跡，從而分析原子水平的構象變化信息[19]。

本研究選擇干酪乳桿菌的LDH為研究目標，采用分子動力學模擬的方法，研究LDH在不同溫度梯度條件下（37、55、70和85 ℃）的熱穩(wěn)定性以及酶活性中心氨基酸殘基的變化，將分析LDH的均方根誤差、回旋半徑、均方根波動值、溶劑可及表面積以及二級結構含量等原子水平的指標變化，以期為LDH參與的食品發(fā)酵過程中采取適宜加工溫度提供有利的參考。

1 材料與方法

1.1 分子模擬的條件

本研究利用Gromacs2020.4軟件包，LDH的結構（PDB: 2zqy）來源于RCSB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站（https://www.rcsb.org/），首先對LDH結構進行預處理，即去除結晶水和雜質(zhì)離子。分子模擬分為四個獨立的體系，對應的溫度設置分別為37、55、70和85 ℃，即在正式模擬的mdp文件中分別修改“ref_t和gen_temp”值為開爾文310.15、328.15、343.15和358.15。選擇這四個溫度的依據(jù)分別是，37 ℃為干酪乳桿菌的最適生長溫度，可代表正常狀態(tài)下的LDH；55 ℃為大多數(shù)蛋白比較常見的變性起始溫度[20-21]；70 ℃是經(jīng)過預實驗測試的大致變性溫度；85 ℃是能夠?qū)е陆^大多數(shù)蛋白變性的溫度。采用Gromos43a1分子力場、SPC水模型進行模擬[22]，模擬總時長為80 ns。模擬之前，將LDH的結構作為一個立方周期盒中的起始構象，并將蛋白質(zhì)與盒邊界的最小距離設為1.0 nm。模擬系統(tǒng)的周期性邊界條件適用于X/Y/Z三個方向，在溶膠中加入0.15 mol/L NaCl鹽的溶質(zhì)對系統(tǒng)的電荷進行中和。在模擬系統(tǒng)中，用粒子網(wǎng)格法PME計算靜電相互作用，用蛙跳算法計算原子運動。用最速下降能量法進行400步能量的最小化。接下來，共軛梯度法被用于執(zhí)行25000步的能量最小化，隨后對每個系統(tǒng)進行了50 ps的位置約束仿真。正式動力學模擬具有隨機的起始速度。利用PyMOL和VMD軟件作為可視化工具，用Origin 8.5軟件生成數(shù)據(jù)結果。

1.2 模擬結果的分析

分別用gmx rmsf工具計算了每個氨基酸殘基的α-C的均方根漲落，用gmx gyrate工具計算了原子演化隨模擬時間的回轉半徑。利用VMD-1.9.1軟件從分子動力學模擬軌跡上觀察四個不同溫度的模擬體系中的蛋白構象變化[23]。然后用gmx distance分別測量了LDH的典型丙酮酸結合位點殘基的平均距離，如精氨酸-106（Arg106）和精氨酸-169（Arg169）、組氨酸-193（His193）和蘇氨酸-247（Thr247）。并用PyMOL和origin 8.5軟件繪制了結構圖。

2 結果與分析

2.1 LDH蛋白的三維結構概況

LDH廣泛存在于動物、植物及微生物等生物體內(nèi)，據(jù)報道，該酶的主要存在形式是含有四個相同亞基的同源四聚體結構，且每個亞基都能單獨發(fā)揮催化活性[24-26]。每個亞基由326個氨基酸殘基構成蛋白質(zhì)一級結構，如圖1A所示，其分子量約為35.5 kDa，它的二級結構主要由8個α-螺旋和9個β-折疊組成，但大多數(shù)β-折疊被包裹在內(nèi)部，形成疏水基團。根據(jù)PDB數(shù)據(jù)庫多種LDH的結構信息得知，其與底物分子的結合活性中心主要位于α-螺旋之間[27]；而β-折疊則對蛋白整體構象的穩(wěn)定起到重要作用。在模擬體系中添加了水分子和NaCl鹽離子，并進行了能量最小化，能量優(yōu)化后的晶胞參數(shù)x/y/z分別為8.82403、8.82403、8.82403 nm（圖1B），展示了該蛋白的立方體模擬體系。

圖1 乳酸脫氫酶LDH結構及其模擬體系構型Fig.1 LDH structure and its simulation system configuration

2.2 均方根誤差的分析

首先針對37、55、70和85 ℃四個不同溫度，分別構建了四個獨立的模擬體系。為了評價蛋白質(zhì)在80 ns總時長模擬過程中是否達到平衡，采用均方根誤差（root mean square deviation, RMSD） 以度量蛋白質(zhì)構象與原始結構之間的平均偏差，RSMD是衡量體系是否穩(wěn)定的重要依據(jù)[28]。如圖2所示，在37 ℃的模擬體系中，LDH最先達到平衡狀態(tài)，且RMSD值是最小的（約為3.4 ?）；55 ℃的條件下的RMSD值在0～55 ns上升到4.1 ?，55～80 ns進入平衡狀態(tài)，說明該條件下的蛋白體系仍然趨于穩(wěn)定；當?shù)鞍滋幱?0 ℃和85 ℃條件下，發(fā)現(xiàn)其RMSD值曲折上升，最大值高達6.0 ?以上，即在80 ns內(nèi)仍無法達到平衡，這說明溫度大于70 ℃的情況下蛋白質(zhì)的構象不穩(wěn)定，逐漸開始變性。根據(jù)文獻報道，GREEN[29]等已證實LDH的熔解溫度為（70.13±0.062）°C，因此，70 ℃的模擬條件大致能代表LDH熔解溫度的臨界值。

圖2 溫度對LDH的均方根誤差的影響Fig.2 Effect of temperature on root mean square deviation of LDH

2.3 氨基酸殘基的均方根波動分析

均方根波動值（root mean square fluctuation,RMSF）的計算，能夠準確表示出每個原子相對于其平均位置的漲落，它表征了結構相對于時間的平均變化，可以從中分析獲得蛋白柔性區(qū)域尤其是關鍵氨基酸殘基的穩(wěn)定性等信息，對應于晶體學中的b溫度因子[30]。

通過觀察殘基的RMSF值的變化，可以獲取不同溫度下蛋白質(zhì)的變性程度，如圖3所示，37 ℃為干酪乳桿菌的最適生長溫度，該溫度下LDH具備正常工作的酶活力，對應的RMSF值最低（正常值），說明此時的蛋白構象最穩(wěn)定；與37 ℃的正常值相比，55 ℃的RMSD值幾乎沒有出現(xiàn)劇烈波動，這表明該溫度對蛋白結構沒有造成本質(zhì)的影響；然而，70 ℃對蛋白N端和C端的多數(shù)殘基造成了波動性增大的影響，這說明隨著溫度上升，LDH蛋白碳骨架的波動性逐漸增大；85 ℃條件下，幾乎所有殘基的RMSF值都大于正常值，這說明此時LDH蛋白已經(jīng)變性。因此，溫度會導致LDH蛋白酶的殘基波動性升高，進而造成蛋白整體構象的不穩(wěn)定性，這不利于LDH與底物分子的結合，這些結果都證明溫度越高對該蛋白酶的影響越大。

圖3 溫度對LDH中每個氨基酸殘基的α-C均方根波動的影響Fig.3 Effect of temperature on root mean square fluctuation of α-C of each amino acid residue in LDH

2.4 蛋白骨架α-C的回旋半徑差異分析

每個氨基酸殘基都有一個α-C，而α-C的回旋半徑能夠代表該蛋白在鹽溶液中的結構致密性。因此，統(tǒng)計了LDH的回旋半徑隨80 ns模擬時間而變化的情況，其值越大表示蛋白構象越松散，其值越小則構象越致密和穩(wěn)定[31]。如圖4所示，37 ℃和55 ℃的兩個體系中，LDH的α-C的回旋半徑值是最低的，分別為1.85 nm和1.86 nm；而在LDH的熔解溫度臨界值70 ℃條件下，α-C的回旋半徑值升高至1.90 nm，該數(shù)據(jù)表明此時LDH蛋白正處于膨脹體系、結構開始改變；85 ℃條件下的蛋白結構已經(jīng)遭到劇烈的破壞，對應的α-C回旋半徑值為1.92 nm。這一結果與RMSF的分析結果保持一致。結果說明，隨著溫度升高，LDH空間構象由致密變成松散狀態(tài)，大于70 ℃會導致蛋白出現(xiàn)不同程度的變性。

圖4 溫度對LDH的α-C回旋半徑的影響Fig.4 Effect of temperature on α-C radius of gyration of LDH

2.5 蛋白構象的溶劑可及表面積分析

溶劑可及表面積（solvent accessible surface area,SASA）是描述蛋白質(zhì)與水溶液接觸的表面積的物理量，由于溫度能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)構象造成較大的影響，因此精確計算了四個不同溫度條件下，LDH蛋白質(zhì)整體構象殘基的SASA隨著時間的變化，并統(tǒng)計了在60～80 ns平衡時間段內(nèi)SASA的平均值，如圖5AB所示，37 ℃和55 ℃的蛋白整體構象SASA值分別穩(wěn)定在132.4 nm2和132.2 nm2，而70 ℃和85 ℃的SASA值則分別升高至135.6 nm2及136.7 nm2，這可能是由于埋在蛋白內(nèi)部的疏水基團被暴露在蛋白表面所致。同時，采用gmx make_ndx將丙酮酸結合位點殘基Arg106、Arg169、His193和Thr247歸為一個組，進而統(tǒng)計了該組對應的數(shù)據(jù)，如圖5C展示了丙酮酸的四個結合位點殘基的SASA值，圖5D則詳細展示了四個溫度條件下的SASA平均值分別為11.62、12.01、12.72及12.50 nm2。這些結果說明與正常狀態(tài)下的LDH結構相比，高溫促使丙酮酸結合位點殘基的溶劑可及表面積變大，因此高溫不利于丙酮酸的結合。

圖5 溫度對蛋白溶劑可及表面積的影響Fig.5 Effect of temperature on solvent accessible surface area of protein samples

2.6 不同溫度影響的蛋白質(zhì)二級結構變化分析

蛋白質(zhì)的二級結構會受到溫度、電荷、氫鍵以及配體分子結合的影響，為了明確四種不同溫度梯度對LDH二級結構變化的影響，采用do_dssp插件分析了蛋白模擬的軌跡。如圖6A，37 ℃條件下平均有139個殘基參與形成α-螺旋，56個殘基形成無規(guī)卷曲，28個殘基形成β-轉角；與37 ℃相比，55 ℃條件下平均有135個殘基參與形成α-螺旋，55個殘基形成無規(guī)卷曲，25個殘基形成β-轉角（圖6B），二級結構含量的變化均較小，因此55 ℃對LDH活性的影響較小。

圖6 LDH在模擬過程中的二級結構變化Fig.6 The secondary structure changes of LDH in different simulation systems

與37 ℃體系形成鮮明對比的是70 ℃和85 ℃，二級結構在高溫條件下受到較大的改變。主要體現(xiàn)在α-螺旋、無規(guī)卷曲、β-轉角含量的改變，即在70 ℃僅有123個殘基形成LDH的α-螺旋，28個殘基形成β-轉角，而無規(guī)卷曲的數(shù)量則升高到61個（圖6C）；在85 ℃體系中，僅有112個殘基形成α-螺旋，32個殘基形成β-轉角，68個殘基形成了無規(guī)卷曲（圖6D）。

根據(jù)這些結果，可以得知85 ℃體系的α-螺旋含量是四個溫度中最低的，無規(guī)卷曲含量是最高的。這說明高溫促使LDH蛋白內(nèi)部的二級結構出現(xiàn)根本性的轉變，從而改變了空間構象，破壞了蛋白質(zhì)結構穩(wěn)定性，最終使酶喪失活性。

2.7 對比37 ℃和85 ℃條件下LDH蛋白構象差異以及丙酮酸的結合能力

上述的數(shù)據(jù)已證明溫度能夠影響LDH的空間結構變化，溫度過高甚至會導致蛋白變性，這會導致LDH在食品發(fā)酵過程中酶活性降低，而丙酮酸作為該酶的底物分子之一，其與LDH的結合亦會受到抑制。計算37 ℃和85 ℃條件下的丙酮酸結合位點殘基Arg106、Arg169、His193和Thr247的空間位置信息，并利用PymoL軟件進行作圖分析，如圖7所示，結果顯示丙酮酸分子在37 ℃時與LDH結合緊密，而85 ℃時的結合位點殘基之間的空間距離較大，這不利于丙酮酸分子的結合，進而抑制了LDH催化的丙酮酸生成乳酸的過程。

圖7 溫度對LDH與丙酮酸分子結合能力的影響Fig.7 Effect of temperature on pyruvate binding capacity of LDH

3 討論與結論

本研究以干酪乳桿菌的LDH蛋白為切入點，采用分子動力學模擬的手段探討了37、55、70和85 ℃溫度梯度對LDH的穩(wěn)定性及酶活性的影響。LDH在低于70 ℃時，結構比較穩(wěn)定。但是當溫度升高至70 ℃或85 ℃，蛋白質(zhì)結構開始變得松散、不穩(wěn)定，二級結構含量也被改變。主要表現(xiàn)在，RMSD和回旋半徑值顯著增加，RMSF值顯示不穩(wěn)定殘基數(shù)變多，埋藏在蛋白內(nèi)部的β-折疊疏水基團暴露，與37 ℃條件相比，70 ℃和85 ℃分別導致蛋白整體溶劑可及表面積增加了3.2 nm2和4.3 nm2。更重要的是，37 ℃條件下LDH的丙酮酸活性位點為Arg106、Arg169、His193和Thr247，但是70 ℃以上的溫度導致蛋白變性之后，Arg106與Arg169、His193與Thr247的空間距離均不同程度增大，這意味著LDH活性中心微環(huán)境遭到破壞，無法結合丙酮酸；而且LDH的α-螺旋含量在高溫條件下驟然下降、無規(guī)卷曲含量升高，說明高溫是導致蛋白空間構象改變的重要原因，這提示在食品發(fā)酵各個環(huán)節(jié)需要嚴格控制溫度低于70 ℃。總之，本研究揭示了溫度影響LDH酶活性及構象變化的關鍵信息，為乳酸制品在發(fā)酵過程中選擇合適溫度提供了理論支撐。