張 健，李 赫，于 翔*，龔 元

(1.遼寧省淡水水產(chǎn)科學(xué)研究院，遼寧 遼陽(yáng) 111000； 2.荊州市民康生物科技有限公司，湖北 荊州 434300)

日本醫(yī)蛭(HirudonipponicaWhitman)俗名日本醫(yī)水蛭、水蛭、稻田醫(yī)蛭，隸屬環(huán)節(jié)動(dòng)物門(mén)(Annelida)蛭綱(Hiru-dinea)無(wú)吻蛭目(Arhynchobdellida Blanchard)醫(yī)蛭科(Hirudinidae Whitman)醫(yī)蛭屬(HirudoLinnaeus)。日本醫(yī)蛭在我國(guó)分布很廣，北起東北各省和內(nèi)蒙古，西至四川和甘肅，南達(dá)臺(tái)灣和廣東；在日本、俄羅斯的遠(yuǎn)東地區(qū)以及蒙古也有分布[1]。日本醫(yī)蛭是《中華人民共和國(guó)藥典》收錄的水蛭藥材基原中唯一吸食動(dòng)物血液的品種，是治療心血管疾病的主要原料[2]。醫(yī)蛭抗凝活性成分水蛭素是迄今為止所發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)的凝血酶天然特異抑制劑，具有防治動(dòng)脈粥狀硬化、高血壓、高血脂和腦中風(fēng)等疾病[3-8]的功效。

近年來(lái)，由于環(huán)境污染和濫捕等人為活動(dòng)因素的影響，導(dǎo)致醫(yī)蛭野生資源破壞嚴(yán)重，野生種群數(shù)量銳減[9-10]。為保護(hù)這一重要資源，醫(yī)蛭的人工繁養(yǎng)殖勢(shì)在必行。目前，提高日本醫(yī)蛭人工繁養(yǎng)殖產(chǎn)量的方法主要是調(diào)節(jié)養(yǎng)殖溫度和密度。本研究在已有繁養(yǎng)殖技術(shù)的基礎(chǔ)上[11-16]，依據(jù)醫(yī)蛭越冬后翌年交配產(chǎn)繭的繁殖習(xí)性[1]，通過(guò)人工控溫的方法縮短越冬時(shí)間，從而增加日本醫(yī)蛭越冬次數(shù)，最終達(dá)到增加交配次數(shù)和提高產(chǎn)量的目的，這在國(guó)內(nèi)尚未有相關(guān)報(bào)道。

1 材料

日本醫(yī)蛭來(lái)源于遼寧省遼中縣，經(jīng)人工飼養(yǎng)后，挑選無(wú)傷病、活力旺盛、無(wú)生殖環(huán)帶的日本醫(yī)蛭進(jìn)行試驗(yàn)。

養(yǎng)殖用土采自遼陽(yáng)市郊稻田，經(jīng)新潔爾滅消毒、沖洗、曝曬后，放入網(wǎng)箱(350 mm×145 mm×115 mm)，網(wǎng)箱土層厚度為40 mm，最后將網(wǎng)箱放入食品級(jí)塑料箱(380 mm×175 mm×145 mm)內(nèi)，用曝氣3 d的自來(lái)水浸透土層后備用。

2 方法

2.1 日本醫(yī)蛭人工越冬管理

人工越冬繁殖試驗(yàn)共分2次進(jìn)行，越冬期為30 d(第1次是2020年5月20日至2020年6月19日，第2次是2020年11月5日至2020年12月5日)。在未經(jīng)歷過(guò)越冬的日本醫(yī)蛭中隨機(jī)挑選60條平均分至2箱(1號(hào)箱和2號(hào)箱)，進(jìn)行第1次越冬試驗(yàn)；在完成第1次越冬和產(chǎn)繭的親蛭中再隨機(jī)挑選30條進(jìn)行第2次越冬繁殖(3號(hào)箱)。兩次試驗(yàn)開(kāi)始前，先用微濕紗布除去親蛭體表附著的贓物和水分，稱量個(gè)體體質(zhì)量(精確到0.01 g)。待日本醫(yī)蛭暫養(yǎng)1周狀態(tài)穩(wěn)定后，放入恒溫恒濕箱開(kāi)始逐漸降溫，待溫度降至6 ℃時(shí)，開(kāi)始正式越冬。在越冬過(guò)程中，根據(jù)土壤干濕情況平均每3 d噴灑曝氣水1次，并挑揀鉆出土層狀態(tài)不好的日本醫(yī)蛭。

2.2 日本醫(yī)蛭交配繁殖

30 d后，恒溫恒濕箱緩慢提溫至16 ℃，待醫(yī)蛭完全復(fù)蘇后，從越冬箱撿出稱取體質(zhì)量、喂食豬血，最后放入到加注曝氣3 d自來(lái)水(水面高30 mm)，水溫保持(20±1) ℃的塑料箱內(nèi)，進(jìn)行交配繁殖。

交配期間，為防止外界干擾帶來(lái)的應(yīng)激反應(yīng)，在塑料箱上蓋1層透氣遮陰網(wǎng)，每5 d觀察1次，記錄生殖環(huán)帶產(chǎn)生情況，最后將產(chǎn)環(huán)親蛭放入土層厚度4 cm的塑料網(wǎng)箱中。卵繭產(chǎn)出后，測(cè)量卵繭質(zhì)量(精確到0.01 g)和長(zhǎng)短徑(稱重前用吸水紙除去卵繭表面附著的水分)，卵繭的長(zhǎng)徑和短徑用游標(biāo)卡尺測(cè)量。試驗(yàn)結(jié)束后，測(cè)量親蛭的個(gè)體體質(zhì)量，統(tǒng)計(jì)存活條數(shù)、卵繭數(shù)量及卵繭大小、體質(zhì)量，計(jì)算親蛭體質(zhì)量下降率、存活率和產(chǎn)繭量。

2.3 日本醫(yī)蛭卵繭孵化

卵繭孵化在26 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行。在帶有透氣孔的塑料盒內(nèi)放置培養(yǎng)皿，將卵繭放于培養(yǎng)皿上，卵繭間距約10 mm，于卵繭上平鋪1層潤(rùn)濕的醫(yī)用紗布。盒內(nèi)注水約10 mm，將醫(yī)用紗布兩端浸入水中，使卵繭和紗布保持一定的潮濕度。孵化期間每日檢查卵繭的孵化情況，及時(shí)將孵出仔蛭挑出、稱取體質(zhì)量，并撿出已孵仔蛭的空殼和死繭。試驗(yàn)結(jié)束后，統(tǒng)計(jì)卵繭孵化率，測(cè)量仔蛭體質(zhì)量(精確到0.000 1 g)。

2.4 親蛭2次人工越冬繁殖試驗(yàn)

在完成第1次產(chǎn)繭的親蛭中，隨機(jī)挑選30條，飼料強(qiáng)化后，按照第1次越冬的方式方法進(jìn)行第2次人工越冬，時(shí)間為30 d。越冬結(jié)束后進(jìn)行交配繁殖，統(tǒng)計(jì)醫(yī)蛭的交配率、繁殖前后體質(zhì)量下降率、卵繭孵化率等繁殖生物學(xué)指標(biāo)。

2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

描述性統(tǒng)計(jì)值用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，其中：

×100%，

3 結(jié)果

3.1 日本醫(yī)蛭越冬成活率和體質(zhì)量變化

越冬共計(jì)30 d。越冬結(jié)束后，統(tǒng)計(jì)日本醫(yī)蛭存活數(shù)量：1號(hào)箱、2號(hào)箱和3號(hào)箱分別存活30、30和28條；成活率分別為100%、100%和93%，3組平均存活率約為98%(見(jiàn)表1)。

表1 日本醫(yī)蛭越冬前后體質(zhì)量變化

由表1可知，1號(hào)箱和2號(hào)箱越冬前平均體質(zhì)量為(0.99±0.33) g，越冬后平均體質(zhì)量為(0.85±0.30) g，平均體質(zhì)量下降率為(14.07±1.05)%；3號(hào)箱越冬前平均體質(zhì)量為(1.33±0.64) g，越冬后平均體質(zhì)量為(1.12±0.43) g，平均體質(zhì)量下降率為15.79%。由此可知，日本醫(yī)蛭經(jīng)過(guò)30 d越冬后，2個(gè)試驗(yàn)組醫(yī)蛭平均體質(zhì)量下降率相當(dāng)，且降低均比較明顯。

3.2 日本醫(yī)蛭交配率、產(chǎn)繭前后形態(tài)特征和體質(zhì)量變化

在(20±1)℃條件下，日本醫(yī)蛭初次越冬1號(hào)箱和2號(hào)箱產(chǎn)環(huán)數(shù)量分別為17和18條，交配率分別為56.70%和60.00%，平均交配率為58.35%，高于第2次越冬3號(hào)箱的13條和46.40%的平均交配率(見(jiàn)表2)。產(chǎn)繭前，日本醫(yī)蛭生殖環(huán)帶較體色明顯，呈淺土黃色(見(jiàn)圖1)，產(chǎn)繭后生殖環(huán)帶消失，其形態(tài)與其他醫(yī)蛭無(wú)差別。

由表3可知，產(chǎn)繭前1、2號(hào)箱平均體質(zhì)量為(1.09±0.44) g，3號(hào)箱為(1.23±0.60) g；產(chǎn)繭后1、2號(hào)箱平均體質(zhì)量為(0.71±0.29) g，體質(zhì)量下降率為(34.65±1.41)%；3號(hào)箱平均體質(zhì)量為(0.77±0.44) g，體質(zhì)量下降率為37.40%。產(chǎn)繭前后，個(gè)體體質(zhì)量下降明顯。

表2 日本醫(yī)蛭產(chǎn)環(huán)數(shù)量及交配率

表3 日本醫(yī)蛭產(chǎn)繭前后體質(zhì)量變化

3.3 卵繭數(shù)量、大小及收集時(shí)間

受精卵主要產(chǎn)在土壤中下層的孔隙中，卵繭呈橢圓形，外面包裹1層較厚的淡黃色泡沫狀保護(hù)層(見(jiàn)圖2)。產(chǎn)繭期間共翻土5次(3號(hào)箱4次)取卵繭。如表4所示：1、2號(hào)箱獲取卵繭66枚，平均產(chǎn)繭量(1.10±0.04)枚/條，卵繭質(zhì)量和長(zhǎng)短徑平均值為(0.12±0.04)g和(1.11±0.18) cm×(0.81±0.16) cm；3號(hào)箱獲取卵繭24枚，平均產(chǎn)繭量為0.86枚/條,卵繭質(zhì)量和長(zhǎng)短徑平均值為(0.12±0.03)g和(1.12±0.19) cm×(0.79±0.14) cm。1、2號(hào)箱集中產(chǎn)繭期在2020年7月25日—2020年8月13日，共計(jì)19 d，收集繭53枚，占1、2號(hào)箱卵繭總數(shù)的80.30%；3號(hào)箱集中在2020年1月16日—2020年2月6日，共計(jì)21 d，收集繭21枚，占3號(hào)箱卵繭總數(shù)的87.5%。

表4 日本醫(yī)蛭產(chǎn)繭量及卵繭形態(tài)

表5 日本醫(yī)蛭不同時(shí)間產(chǎn)卵繭數(shù)量

3.4 日本醫(yī)蛭卵繭孵化率及初孵仔蛭

卵繭孵化在(26±1) ℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行。2次孵化分別進(jìn)行了54和51 d。1、2號(hào)箱活繭合計(jì)55枚，平均孵化率為83.27%(見(jiàn)表6)；共孵化仔蛭573條，平均產(chǎn)仔蛭數(shù)為10.42條/枚，平均體質(zhì)量為(0.005 1±0.004 7) g，最大體質(zhì)量為0.018 3 g，最小體質(zhì)量為0.000 9 g。3號(hào)箱活繭22枚，平均孵化率為91.67%(見(jiàn)表6)；孵化仔蛭178條，平均產(chǎn)仔蛭數(shù)為8.09條/枚，平均體質(zhì)量(0.005 4±0.002 6) g，最大體質(zhì)量為0.011 6 g，最小體質(zhì)量為0.001 7 g。

初孵仔蛭從卵繭一端的小孔逸出。仔蛭的體形與成蛭很像，但體表顏色略有不同，個(gè)體較大的呈深褐色，背部條紋明顯；個(gè)體小的呈淺黃色，體表透光，條紋不明顯。

表6 日本醫(yī)蛭孵化率

4 討論

4.1 人工越冬對(duì)繁養(yǎng)殖的影響

在自然界中，日本醫(yī)蛭11月中下旬開(kāi)始潛入深土中越冬，當(dāng)溫度降到5 ℃左右時(shí)進(jìn)入冬眠狀態(tài)，停止攝食和活動(dòng)，翌年4月中旬開(kāi)始出土攝食和交配[1,15]。本研究依據(jù)日本醫(yī)蛭繁殖生物學(xué)特性，通過(guò)人工干預(yù)越冬的方法，使日本醫(yī)蛭從自然越冬4 ～ 5個(gè)月縮短到1個(gè)月，不僅降低了人工養(yǎng)殖過(guò)程中由于越冬期長(zhǎng)導(dǎo)致醫(yī)蛭體力不支、土質(zhì)敗壞而引起的死亡，還有效提高了繁殖效率，使日本醫(yī)蛭1年交配1次提高到1年交配2次(2020年7月和2021年1月)。本研究中，第2次越冬繁殖試驗(yàn)交配率為46.40%，略低于第1次越冬繁殖試驗(yàn)的平均交配率58.35%，這可能有兩方面的原因：一方面是由于越冬時(shí)間短，個(gè)別醫(yī)蛭性腺尚未完全恢復(fù)；另一方面是在交配過(guò)程中親蛭受到外界干擾而導(dǎo)致交配失敗。這在今后的試驗(yàn)中還有待進(jìn)一步的研究。

4.2 日本醫(yī)蛭產(chǎn)繭前后體質(zhì)量變化及產(chǎn)繭量

2次越冬試驗(yàn)產(chǎn)繭前平均體質(zhì)量分別為(1.09±0.44) g和(1.23±0.60) g；產(chǎn)繭后平均體質(zhì)量分別為(0.71±0.29) g和(0.77±0.44) g，體質(zhì)量下降率分別為(34.65±1.41)%和37.40%，2次越冬試驗(yàn)之間體質(zhì)量和體質(zhì)量下降率差異變化不顯著，這與張健等日本醫(yī)蛭產(chǎn)繭后30% ～35%的體質(zhì)量下降率的研究結(jié)果相近[11]。由此可見(jiàn)，2次越冬產(chǎn)繭并不會(huì)過(guò)多消耗醫(yī)蛭體能而降低其活力。在產(chǎn)繭量方面，2次越冬日本醫(yī)蛭平均產(chǎn)繭量分別為(1.10±0.04)枚/條和0.86枚/條，第2次交配率低于第1次交配率是導(dǎo)致平均產(chǎn)繭量略低的主要原因。而在相關(guān)的醫(yī)蛭科水蛭繁殖研究中，本試驗(yàn)2次平均產(chǎn)繭量均低于已有報(bào)道的菲牛蛭、寬體金線蛭和日本醫(yī)蛭的平均產(chǎn)繭量3.83枚/條、1.80和0.70枚/條[11-12,16]，這可能與水蛭種類、個(gè)體大小、生活習(xí)性、生態(tài)環(huán)境以及試驗(yàn)條件等因素有一定關(guān)系。

另外，本研究中還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)受到人為刺激或驚擾時(shí)，正在產(chǎn)繭的日本醫(yī)蛭會(huì)出現(xiàn)逃逸現(xiàn)象而終止產(chǎn)繭；已產(chǎn)卵繭會(huì)出現(xiàn)未成形及無(wú)法形成土黃色蜂窩狀或海綿狀保護(hù)膜的情況，這種卵繭不能孵化出仔蛭。因此，在繁殖過(guò)程中，應(yīng)保持室內(nèi)安靜，維持室內(nèi)溫度和濕度穩(wěn)定，盡量降低人為刺激和環(huán)境刺激對(duì)其交配和產(chǎn)繭的影響。

4.3 日本醫(yī)蛭卵繭形態(tài)、大小、體質(zhì)量及孵化情況

本研究中日本醫(yī)蛭的卵繭呈卵圓形，繭膜分2層，卵繭外層是1層泡沫狀保護(hù)層，里層是卵繭膜，膜內(nèi)包裹著果凍狀液體，這與資料中記載的日本醫(yī)蛭卵繭形態(tài)一致[1]。兩次試驗(yàn)卵繭每枚的平均質(zhì)量、大小分別為(0.12±0.04) g、(1.11±0.18)×(0.81±0.16) cm和(0.12±0.03) g、(1.12±0.19) cm×(0.79±0.14) cm。可見(jiàn)，2次越冬卵繭質(zhì)量和大小均無(wú)顯著差異。另外，2次越冬繁殖平均孵化量分別為10.42和8.09條/枚，平均體質(zhì)量分別為(0.005 1±0.004 7) g和(0.005 4±0.0026) g，與已有報(bào)道日本醫(yī)蛭卵繭平均孵化量(8.5±0.97)條/枚、平均體質(zhì)量(0.007 7±0.002 5) g結(jié)果相符[11]。由此說(shuō)明短期越冬和2次繁殖對(duì)卵繭孵化質(zhì)量無(wú)明顯影響。

目前，關(guān)于日本醫(yī)蛭人工繁殖的相關(guān)研究較少，人工增繁殖技術(shù)還不太成熟。而本研究通過(guò)人為改變?cè)蕉瑮l件，縮短越冬時(shí)間，使得交配、產(chǎn)繭和孵化從1年1繁提高到1年2繁，初步實(shí)現(xiàn)了仔蛭的增收增產(chǎn)，為今后日本醫(yī)蛭工廠化繁養(yǎng)殖提供了一定的參考。