王丹丹,齊彤彤

(遼東學院 農學院，遼寧 丹東 118003)

石柱參，又名柱參，隸屬于五加科(Araliaceae)人參屬(Panax)。人參(PanaxginsengC. A. Mey.)是我國東北地區(qū)名貴藥材及補品，在遼寧省丹東市寬甸縣多有分布。石柱參種植地毗鄰鴨綠江，栽培方式不同于普通園參，且生長速度緩慢(長成成品需長達12～15 年時間)。在優(yōu)越環(huán)境下生長的石柱參形態(tài)特征與野生人參相似，人參總皂甙含量高于普通園參，在國際中藥市場享有盛譽。

磷脂(Phospholipid)是細胞膜的主要成分，其含量與組成存在個體差異，在細胞生長和應激反應中發(fā)生動態(tài)變化。磷脂酶可催化細胞膜中磷脂重構，其間產生多種脂源性第二信使。磷脂酶根據磷酸酯鍵水解位點，分類為4個基團，即磷脂酶A1 (PLA1)、磷脂酶A2 (PLA2)、磷脂酶C (PLC)和磷脂酶D (PLD)[1]。它們存在于不同的亞科或科，在底物選擇性、結構、輔助因子要求和反應條件方面均有不同。

磷脂酶C基因家族是磷脂酶家族的重要成員，它能調控植物生長發(fā)育過程。根據底物不同，磷脂酶C可分為非特異性磷脂酶C (NPC)和磷脂酰肌肽特異性磷脂酶C (PI-PLC)。PI-PLC可以水解磷脂酰肌醇4, 5-bisphosphate (PIP2)而產生兩個重要的信號分子：三磷酸肌醇(IP3)和甘油二酯(DAG)。蛋白激酶C (PKC)的家族成員可依靠上述信號分子釋放細胞中的Ca2+，從而被激活并參與植物的生長發(fā)育過程。NPC可以水解磷脂酰膽堿(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)生成磷脂酰絲氨酸(PS)、DAG和相應的磷酸基團[2-3]。隨著基因組測序技術的發(fā)展，越來越多的PLC基因被鑒定出來：擬南芥含有9個PI-PLC和6個NPC，番茄含有6個PI-PLC成員，棉花含有12個PI-PLC和9個NPC，玉米含有5個PI-PLC和4個NPC，水稻中有4個PI-PLC和5個NPC成員。在高等植物中，擬南芥和水稻中PLC家族基因的生物學功能分析較為明確：AtPI-PLC1參與高滲脅迫響應；AtPI-PLC2參與雌雄配子體發(fā)育的生長素調控；AtPI-PLC3參與干旱和鹽脅迫的早期反應，屬于轉錄因子AP2/ERF家族，是乙烯反應因子的下游靶基因；AtNPC1、AtPI-PLC3和AtPI-PLC9參與擬南芥的熱脅迫響應；AtPI-PLC5過表達可引起擬南芥葉片早衰或煙草葉片點狀枯萎；脫落酸可誘導AtPI-PLC6參與冷應激反應；生長素和細胞分裂素可將植物AtPI-PLC7和AtPI-PLC8表達上調，并在鹽脅迫、干旱和冷害下亦能上調；AtNPC4及其衍生脂質可增強對高滲透脅迫的抵抗力、調節(jié)ABA反應機制，促進植物對干旱和鹽脅迫的耐受性；AtNPC5和甘油三酯在輕度鹽脅迫下促進植物側根發(fā)育，OsNPC2對鹽和低溫處理敏感，特別是鹽處理下OsNPC2的表達增加了近8倍；多種脅迫同時誘導OsPI-PLC3的表達，特別是鹽處理下的表達增加了22倍。綜上所述，植物PLC基因在應激反應中發(fā)揮著重要作用[4-8]。

目前，對石柱參的研究主要集中于栽培技術和功能基因的克隆上，對其PLC家族成員的克隆及表達研究還未見報道。因此，鑒定SzPLC家族成員并探討其功能具有重要的意義。本研究參考擬南芥(NM_125254.2)的AtPLC1基因設計引物，采用RT-PCR與RACE技術克隆石柱參PLC1全長基因，命名為SzPLC1基因。通過蛋白序列比對、結構域分析、蛋白網絡互作以及進化樹構建，為深入研究SzPLC1蛋白的特性及功能，并為最終解釋石柱參SzPLC1參與抗逆脅迫的分子機制以及基因工程手段在石柱參分子育種中的應用打下了良好的基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

5年生無病蟲害、生長勢良好的石柱參根組織，2020年7月采自丹東市寬甸滿族自治縣振江鎮(zhèn)大青村。

1.2 總RNA提取

取新鮮石柱參根組織0.5 g置于液氮中研磨至粉末狀，依據植物總 RNA 快速抽提試劑盒(Plant Total RNA Isolation Kit)說明書抽提石柱參總RNA，電泳檢測RNA完整性。以石柱參總RNA為模板，采用AMV 第一鏈 cDNA 合成試劑盒(AMV First Strand cDNA Synthesis Kit)生成cDNA第一鏈，-20 ℃保存[9]。

1.3 石柱參SzPLC1全長基因的克隆

以擬南芥(NP_568881.1)的AtPLC1基因設計引物(見表1)，克隆石柱參SzPLC1的核心片段，并根據核心片段設計5′-RACE和3′-RACE引物。采用生工生物工程(上海)股份有限公司的5′-RACE和3′-RACE試劑盒，以SzPLC1核心片段為模板快速擴增SzPLC1基因的5′-RACE片段和3′-RACE片段。PCR 擴增體系(50 μL)：5′和3′-RACE cDNA 2.5 μL，LA緩沖液 (10×) 25 μL，LA聚合酶混合液1.0 μL，PCR-Grade H2O 15.5 μL，UPM(10×)5 μL，5′，3′GSP 引物1.0 μL。反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性45 s，69 ℃退火45 s，72 ℃延伸3 min，40次循環(huán)；72 ℃延伸10 min。采用凝膠回收試劑盒純化、回收PCR特異性擴增產物，連接pUC19載體后轉化入感受態(tài)細胞，生工生物工程(上海)股份有限公司測序。 采用DNAstar軟件拼接5′ -RACE、核心序列與3′-RACE 3個片段，最終獲得石柱參SzPLC1全長基因[10-12]。

表1 引物信息

1.4 石柱參SzPLC1基因生物信息學分析

根據SzPLC1基因全長序列，采用ORF Finder預測SzPLC1基因開放閱讀框，采用在線分析軟件Prot Param分析理化特性，采用Prot Scale分析氨基酸序列的疏水性和親水性，采用SWISS MODEL在線軟件預測蛋白質三級結構，采用String(http://string-db. org/)預測其蛋白互作網絡；采用DNAMAN軟件與Blast在線軟件對其同源氨基酸進行多重比對，用Clustalx和MEGA 7.0 軟件構建石柱參SzPLC1基因系統(tǒng)進化樹[13]。

1.5 干旱脅迫對石柱參SzPLC1基因的脅迫表達

對土壤進行3個含水量設置：充分灌溉處理(對照組)，土壤相對含水量保持在(90±5) %；輕度干旱脅迫處理，土壤相對含水量保持在(65±5) %；重度干旱脅迫處理，土壤相對含水量保持在(35±5)%。每個處理5盆，在干旱處理的第0、6、12、20 d及復水后6 d取樣并保存到冰箱。采用Primer Premier 6軟件設計SzPLC1基因特異性引物PLC1-qF/R，以18S-F/R為內參引物，通過qRT-PCR對SzPLC1基因進行實時熒光定量(qRT-PCR)分析，檢測干旱條件下SzPLC1基因表達量水平，3次生物學重復后取平均值[14]。

2 結果與分析

2.1 石柱參SzPLC1基因cDNA全長克隆

以擬南芥(NP_568881.1)序列為模板設計引物，采用RT-PCR與RACE技術克隆SzPLC1基因全長cDNA序列(圖1)，采用SeqMan程序將5’-RACE(521 bp)、核心序列(1 068 bp)與3’-RACE(387 bp)3段DNA序列進行拼接，獲得1條長度為1 725 bp的DNA片段，以該序列為模板，采用Primer Premier 5.0設計SzPLC1基因特異性引物，以石柱參cDNA為模板克隆SzPLC1全長序列。結果顯示，克隆得到的SzPLC1序列與拼接的序列長度一致，可確定為SzPLC1基因(見圖1)。

2.2 石柱參SzPLC1基因理化特性分析

石柱參SzPLC1基因cDNA全長為1 725 bp(見圖2)，包含1個1 455 bp的完整開放閱讀框(ORF)，編碼484個氨基酸，其5’-UTR長252 bp， 3’-UTR長18 bp。Prot Param 分析表明：SzPLC1蛋白質分子式為C2444H3803N655O738S21，含8147個原子，分子質量為54.8 ku，等電點pI為5.85，含有63個帶負電荷氨基酸殘基、55個帶正電荷氨基酸殘基；蘇氨酸(Ser)含量最高(7.9%)，半胱氨酸(Cys)含量最低(1.8%)，脂肪系數(shù)為76.10。Prot Scale分析表明：SzPLC1蛋白親水性氨基酸數(shù)量顯著多于疏水性氨基酸數(shù)量，292、283位氨基酸殘基的親水性最強(MIN：-2.644)，64位的疏水性最強(MAX：1.889)，推斷SzPLC1蛋白為親水性蛋白(圖3)；SignalP-4.1預測SzPLC1蛋白無信號肽，無剪切位點，說明該蛋白翻譯后無需跨膜轉運；PSORT Prediction預測蛋白質的亞細胞定位表明該蛋白質可能存在于細胞質膜。Smart在線分析顯示：GaSQS蛋白具有2個結構域(見圖4)，即X區(qū)(105～249，1.04×10-53)和Y區(qū)(293～410，1.55×10-61)，約含有150和130個氨基酸殘基；SOPMA預測SzPLC蛋白二級結構(見圖5)，包括無規(guī)則卷曲(40.91%)、α-螺旋(37.54%)、延伸鏈(18.39%)和β-轉角(4.96%)；SWISS-MODEL預測SzPLC蛋白三級結構(見圖6)，表明SzPLC蛋白具有由多個無規(guī)則卷曲和α-螺旋形成的中央激活位點空穴區(qū)域，符合磷脂酶的理化特性，有利于形成底物結合域和催化位點，該區(qū)域可與Ca2+結合，而Ca2+又能與底物二磷酸結合，因此推測該核心部位可能是酶的活性中心。

2.3 石柱參SzPLC1蛋白互作網絡分析

String蛋白互作網絡分析表明，與SzPLC1蛋白互作的蛋白質共有9個(見圖7)，即： G蛋白α亞基、G蛋白β亞基、G蛋白γ亞基1、G蛋白γ亞基2、 G 蛋白偶聯(lián)受體、鈣依賴性磷脂結合蛋白家族、SPA7蛋白、TATC膜蛋白和阿拉伯半乳糖蛋白。這些蛋白均是磷脂酰肌醇信號通路的重要酶類，說明SzPLC1是磷脂酰肌醇信號通路中關鍵的酶，其分子功能涉及催化活性和結合。生物過程主要涉及代謝過程、細胞過程、對刺激的反應、生物調節(jié)、生物過程調節(jié)和信號轉導等。

2.4 石柱參SzPLC1蛋白的系統(tǒng)進化分析

經Blast比對，SzPLC1蛋白與較多十字花科植物均具有較高同源性(80%～98%)。從NCBI 數(shù)據庫選取10個與SzPLC1蛋白高度同源的氨基酸序列，用MEGA7.0構建PLC1蛋白系統(tǒng)進化樹(見圖8)。結果表明：10個PLC1氨基酸序列匯聚為兩大支，其中十字花科聚為一支，另一支均為豆科的PLC1氨基酸序列。石柱參SzPLC1蛋白與蘿卜Raphanussativus(XP_018480211.1) 的PLC1蛋白表現(xiàn)出較高的同源性(95%)，親緣關系最為相近，說明該蛋白高度保守。

2.5 石柱參SzPLC1干旱脅迫表達

在干旱處理的第0、6、12、20 d及復水后6 d，分別對3種處理后的各時期石柱參SzPLC1蛋白的表達量進行測定，結果表明：充分灌溉處理(對照組)的SzPLC1蛋白表達水平相對較穩(wěn)定；輕度干旱脅迫處理與重度干旱脅迫處理的石柱參植株SzPLC1蛋白表達水平隨著干旱處理時間的延長而升高，直至20 d時達到峰值，復水后6 d表達量有明顯下降趨勢，其中，重度干旱脅迫處理的SzPLC1蛋白表達量高于其他兩個處理，在干旱處理20 d時，SzPLC1蛋白的表達量約為對照組的5.4倍。說明SzPLC1蛋白的功能具有抗干旱脅迫的作用。

3 討論

磷脂是細胞膜重要的組成成分，其水解產物是DAG和IP3，也是細胞跨膜信號轉導中重要的2個第二信使，催化上述反應的水解酶便是磷脂酶類， IP3可激活PI-PLC水解PIP2，再次生成第二信使DAG和IP3，對植物細胞增殖、分化、代謝以及分泌等過程發(fā)揮作用，所以，磷脂酶C是一種重要的脂質水解酶，參與脂質介導的信號轉導，在許多植物非生物脅迫信號轉導和發(fā)育中發(fā)揮重要作用。根據基質的不同，PLC在植物中可分為PI-PLC和NPC。PI-PLC的結構主要由pH結構域(涉及膜靶向和蛋白結合)、EF-hand結構域(并非所有PI-PLC基因都含有EF-hand結構域)、催化結構域(X和Y結構域)和C2結構域組成，與動物的PLC相比，植物中的PLC缺少pH結構域。研究表明PI-PLC的催化活性嚴格依賴于X/Y結構域(涉及底物結合和催化)[15]。X結構域非常保守，存在于細菌、動物和植物中。X結構域中單個氨基酸的變化可以顯著影響PI-PLC的功能。

非生物脅迫包括干旱脅迫、低溫脅迫和鹽脅迫，是植物在其生長發(fā)育過程中常見的脅迫，可導致植物減產。在各種非生物脅迫下，PLC基因被轉錄激活說明該信號轉導酶在植物適應惡劣環(huán)境條件時的重要性。干旱脅迫誘導煙草NtPLC1、馬鈴薯StPLC1和StPLC2表達，此外，棉花GhNPC5和GhNPC9以及擬南芥的同源基因AtNPC1在高溫脅迫下被強烈誘導，說明PLC基因在不同植物中具有相似的生理學功能，可通過系統(tǒng)進化預測不同物種PLC蛋白質功能。例如，OsPLC1和TaPLC1對鹽脅迫比較敏感，脅迫后PLC蛋白質表達量明顯上調，此外，提高玉米的耐旱性可通過過表達ZmPLC1蛋白[16-17]來實現(xiàn)。本研究發(fā)現(xiàn)石柱參SzPLC1對干旱脅迫表現(xiàn)出了良好的抗逆性，SzPLC1蛋白表達量隨著干旱脅迫時間的延長而呈上升趨勢，其中輕度干旱脅迫處理的SzPLC1蛋白的表達量明顯低于重度干旱脅迫處理，說明SzPLC1參與了多種細胞代謝過程和信號轉導途徑，具有抗干旱脅迫的作用。