楊創(chuàng)業(yè)，章佳斌，曾業(yè)濤，廖永山，鄧岳文,3，王慶恒,3

化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)對馬氏珠母貝眼點幼蟲附著的影響

楊創(chuàng)業(yè)1，章佳斌1，曾業(yè)濤1，廖永山2，鄧岳文1,3，王慶恒1,3

（1. 廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 // 2. 廣東海洋大學(xué)珍珠研究所 // 3. 廣東省珍珠養(yǎng)殖與加工工程技術(shù)研究中心，廣東 湛江 524088）

【目的】研究血清素（5-HT）、蛻皮激素、γ-氨基丁酸（GABA）、腺嘌呤核苷、次黃嘌呤核苷和次黃嘌呤對馬氏珠母貝眼點幼蟲附著的影響?！痉椒ā恳圆煌瑵舛鹊?-HT、蛻皮激素、GABA、腺嘌呤核苷、次黃嘌呤核苷和次黃嘌呤溶液處理馬氏珠母貝眼點幼蟲，不同時間后，分析眼點幼蟲附著率的變化?！窘Y(jié)果】在24 ～ 96 h作用時間里，5-HT、蛻皮激素、GABA對眼點幼蟲附著的誘導(dǎo)效果整體上均呈上升趨勢；在24 ～ 120 h作用時間里，腺嘌呤核苷、次黃嘌呤核苷和次黃嘌呤對眼點幼蟲附著的誘導(dǎo)效果整體上呈上升趨勢。眼點幼蟲在10-5mol/L的5-HT和GABA處理24、48、72和96 h后，附著率均顯著高于對照組（< 0.01）；10-5mol/L的蛻皮激素處理24 h和72 h，10-6mol/L的蛻皮激素處理24 h和96 h，10-7mol/L的蛻皮激素處理24 h，附著率均顯著高于對照組（< 0.01）；10 μmol/L腺嘌呤核苷處理24、48、72和120 h，1 μmol/L腺嘌呤核苷處理24、48、72、96和120 h，附著率均顯著高于對照組（< 0.01）；10 μmol/L次黃嘌呤核苷處理48和72 h，1 μmol/L次黃嘌呤核苷處理48、72、96和120 h，附著率均顯著高于對照組（< 0.01）；10 μmol/L的次黃嘌呤處理72、96和120 h，附著率均顯著高于對照組（< 0.01）?！窘Y(jié)論】5-HT、蛻皮激素、GABA、腺嘌呤核苷、次黃嘌呤核苷和次黃嘌呤溶液在適宜的濃度和處理時間均可誘導(dǎo)馬氏珠母貝眼點幼蟲附著，其中10-5mol/L的5-HT處理24 h對附著率的誘導(dǎo)效果最佳，可達(dá)對照組的6.3倍。

馬氏珠母貝；眼點幼蟲；附著；化學(xué)物質(zhì)

貝類附著變態(tài)階段幼蟲對環(huán)境因素異常敏感，常因受到不良環(huán)境因素的影響，出現(xiàn)變態(tài)延遲或大量死亡，死亡率有時可以高達(dá)80% ～ 90%，給生產(chǎn)造成巨大損失[1]。在貝類苗種培育過程中，以優(yōu)化育苗技術(shù)方案來促進(jìn)浮游幼蟲大量同步定向附著和變態(tài)，可顯著提高育苗的產(chǎn)量和效益。研究表明，物理環(huán)境誘導(dǎo)（如基質(zhì)、水流、溫度和鹽度等）[2-4]、生物誘導(dǎo)[1, 5-6]及化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)[7-9]等均影響著貝類幼蟲的附著變態(tài)。然而，同一種藥物對于雙殼貝類，甚至同屬并不具備有普適性。例如，腎上腺素在厚殼貽貝（）眼點幼蟲具誘導(dǎo)作用[10]，而在紫貽貝（）上卻沒有作用[11]。因此，尋找促進(jìn)特定貝類附著變態(tài)的有效解決方案具有重要意義。

馬氏珠母貝（）是我國南方沿海特色養(yǎng)殖貝類，主要用于培育海水珍珠，同時具有較高營養(yǎng)和藥用價值[12]，然而，苗種生產(chǎn)中的幼蟲附著變態(tài)率低的問題一直是限制馬氏珠母貝產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要因素之一。為縮短幼蟲附著變態(tài)時間，提高幼蟲附著變態(tài)率，本團隊前期利用代謝組結(jié)合轉(zhuǎn)錄組技術(shù)研究了馬氏珠母貝幼蟲附著變態(tài)過程調(diào)控特征，篩選了參與附著變態(tài)過程的差異代謝物，包括血清素（5-HT）、γ-氨基丁酸（GABA）、蛻皮激素、腺嘌呤核苷、次黃嘌呤核苷和次黃嘌呤等[13]。本研究在此基礎(chǔ)上探討了以上差異代謝物對馬氏珠母貝眼點幼蟲附著的影響，以期為高效苗種培育提供技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

從本團隊培育的馬氏珠母貝黑殼色品系中挑出性腺成熟的個體，清洗貝體表面的附著物，剖取馬氏珠母貝的精子和卵子，將收集到的精子與卵子在砂濾海水中混合，使其受精（溫度25 °C ± 1 °C，鹽度30 ± 1）。完成受精后，使用砂濾海水洗滌受精卵3 ～ 4次，去除多余的精子和未成熟的卵子，并將卵移入新的砂濾海水中進(jìn)行早期培育。受精后21 d，幼蟲后腹部口與肛門之間出現(xiàn)足和鰓的原基，在足原基的基部前方兩側(cè)靠近貝殼的位置出現(xiàn)圓形或橢圓形的眼點，選取此時期幼蟲作為實驗材料。

1.2 實驗方法

實驗開始前，使用過濾海水分別配制成5-HT、蛻皮激素 [助溶劑為0.9 μL/L二甲基亞砜 (DMSO)溶液]、GABA、腺嘌呤核苷、次黃嘌呤核苷和次黃嘌呤的儲備液。5-HT設(shè)計3個濃度實驗梯度，分別是10-5、10-6、10-7mol/L和1個空白對照組，作用時間為24、48、72和96 h；蛻皮激素設(shè)計3個濃度實驗梯度，分別是10-5、10-6和10-7mol/L，對照組為1個空白對照組和0.9 μL/L DMSO溶液組，作用時間為24、48、72和96 h；GABA設(shè)計3個濃度實驗梯度，分別是10-5、10-6、10-7mol/L和1個空白對照組，作用時間為24、48、72和96 h；腺嘌呤核苷設(shè)計3個濃度實驗梯度，分別是10-4、10-5、10-6mol/L和1個空白對照組，作用時間為24、48、72、96和120 h；次黃嘌呤核苷設(shè)計3個濃度實驗梯度，分別是10-4、10-5、10-6mol/L和1個空白對照組，作用時間為24、48、72、96和120 h；次黃嘌呤設(shè)計3個濃度實驗梯度，分別是10-4、10-5、10-6mol/L和1個空白對照組，作用時間為24、48、72、96和120 h。

實驗在60 mL的一次性培養(yǎng)皿中進(jìn)行，各培養(yǎng)皿中放置40 mL過濾海水，每個培養(yǎng)皿幼蟲數(shù)為80 ～ 130只，并通過微型蠕動泵進(jìn)行增氧，每12 h投喂湛江等鞭金藻（），各組處理設(shè)置3個重復(fù)。

通過對附著在培養(yǎng)皿中的幼蟲進(jìn)行計數(shù)并統(tǒng)計附著率（附著率= 附著個體數(shù)/實驗個體總數(shù)），具體技術(shù)方法參照Yu等[14]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)運用EXCEL進(jìn)行處理，將獲得的附著率百分比數(shù)值進(jìn)行平方根的反正弦轉(zhuǎn)換，以增加數(shù)據(jù)的正態(tài)和方差齊性。采用SPSS 26. 0對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，若差異達(dá)到顯著，則進(jìn)行Tukey多重比較，顯著性水平= 0.05。

2 結(jié)果

2.1 5-HT對馬氏珠母貝眼點幼蟲附著率的影響

在24 ～ 96 h作用時間里，5-HT對馬氏珠母貝眼點幼蟲附著的誘導(dǎo)效果整體呈上升趨勢（圖1）。其中，10-5mol/L的5-HT對幼蟲附著的誘導(dǎo)效果最佳，10-5mol/L的5-HT處理24、48、72和96 h后，幼蟲的附著率均顯著高于對照組（< 0.05），附著率分別是對照組的6.3倍、6.0倍、3.9倍和2.0倍；10-6mol/L和10-7mol/L的5-HT對馬氏珠母貝眼點幼蟲附著率無顯著提高（0.05）。

2.2 蛻皮激素對馬氏珠母貝眼點幼蟲附著率影響

在24 ～ 96 h作用時間里，蛻皮激素對馬氏珠母貝眼點幼蟲附著的誘導(dǎo)效果整體上呈上升趨勢（圖2）。10-5mol/L的蛻皮激素處理24 h和72 h后，眼點幼蟲附著率均顯著高于對照組和DMSO組（< 0.05），附著率分別是對照組的2.4倍和2.6倍；10-6mol/L的蛻皮激素處理24 h和96 h后，幼蟲附著率均顯著高于對照組（< 0.05），附著率分別是對照組的2.0倍和2.1倍；10-7mol/L的蛻皮激素處理24 h后，幼蟲的附著率顯著高于對照組（< 0.05），附著率是對照組的2.5倍。

相同濃度處理組在不同時間之間，凡含一個相同大寫字母，表示差異不顯著（P > 0.05），相同時間里不同濃度處理組之間，凡含一個相同小寫字母表示差異不顯著（P > 0.05）

2.3 GABA對馬氏珠母貝眼點幼蟲附著率的影響

在24 ～ 96 h作用時間里，GABA對馬氏珠母貝眼點幼蟲附著的誘導(dǎo)效果整體呈上升趨勢（圖3）。10-5mol/L的GABA對幼蟲附著的誘導(dǎo)效果最佳，10-5mol/L的GABA處理24、48、72和96 h后，幼蟲的附著率均顯著高于對照組（< 0.05），附著率分別是對照組的5.5倍、3.0倍、2.8倍和2.2倍；10-6mol/L和10-7mol/L的GABA對馬氏珠母貝眼點幼蟲附著率無顯著提高（> 0.05）。

相同濃度處理組在不同時間之間，凡含一個相同大寫字母，表示差異不顯著（P > 0.05），相同時間里不同濃度處理組之間，凡含一個相同小寫字母表示差異不顯著（P > 0.05）

2.4 腺嘌呤核苷對馬氏珠母貝眼點幼蟲附著率影響

在24 ～ 120 h作用時間里，腺嘌呤核苷對馬氏珠母貝眼點幼蟲附著的誘導(dǎo)效果整體呈上升趨勢（圖4）。10 μmol/L的腺嘌呤核苷處理24、48、72和120 h后，幼蟲附著率均顯著高于對照組（< 0.05），附著率分別是對照組的2.1倍、3.5倍、2.7倍和2.1倍；1 μmol/L的腺嘌呤核苷處理24、48、72、96和120 h后，幼蟲附著率均顯著高于對照組（< 0.05），附著率分別是對照組的1.9倍、3.0倍、2.6倍、2.1倍和2.3倍；0.1 μmol/L的腺嘌呤核苷對馬氏珠母貝眼點幼蟲附著率無顯著提高（> 0.05）。

相同濃度處理組在不同時間之間，凡含一個相同大寫字母，表示差異不顯著（P > 0.05），相同時間里不同濃度處理組之間，凡含一個相同小寫字母表示差異不顯著（P > 0.05）

2.5 次黃嘌呤核苷對馬氏珠母貝眼點幼蟲附著率影響

在24 ～ 120 h作用時間里，次黃嘌呤核苷對馬氏珠母貝眼點幼蟲附著誘導(dǎo)效果整體呈上升趨勢（圖5）。10 μmol/L次黃嘌呤核苷處理48 h和72 h后，幼蟲附著率均顯著高于對照組（< 0.05），附著率分別是對照組2.4倍和1.8倍；1 μmol/L次黃嘌呤核苷處理48、72、96和120 h后，幼蟲附著率均顯著高于對照組（< 0.05），附著率分別是對照組1.8倍、1.5倍、1.3倍和1.3倍；0.1 μmol/L次黃嘌呤核苷對馬氏珠母貝眼點幼蟲附著率無顯著提高（> 0.05）。

相同濃度處理組在不同時間之間，凡含一個相同大寫字母，表示差異不顯著（P > 0.05），相同時間里不同濃度處理組之間，凡含一個相同小寫字母表示差異不顯著（P > 0.05）

2.6 次黃嘌呤對馬氏珠母貝眼點幼蟲附著率影響

在24 ～ 120 h作用時間里，次黃嘌呤對馬氏珠母貝眼點幼蟲附著的誘導(dǎo)效果整體呈上升趨勢（圖6）。10 μmol/L的次黃嘌呤處理72、96和120 h后，幼蟲附著率均顯著高于對照組（< 0.05），附著率分別是對照組的1.8倍、1.6倍和1.8倍；0.1 μmol/L和1 μmol/L的次黃嘌呤對馬氏珠母貝眼點幼蟲附著率無顯著提高（> 0.05）。

相同濃度處理組在不同時間之間，凡含一個相同大寫字母，表示差異不顯著（P > 0.05），相同時間里不同濃度處理組之間，凡含一個相同小寫字母表示差異不顯著（P > 0.05）

3 討論

在水產(chǎn)經(jīng)濟貝類的苗種生產(chǎn)中，幼蟲附著變態(tài)的成功與否直接決定出苗量和育苗的成敗。提高幼蟲附著變態(tài)率是解決這一問題的主要途徑之一。化學(xué)物質(zhì)通過對軟體動物行為方式或生活方式的影響，可使更多幼蟲附著到基質(zhì)上。因此，幼蟲一旦探測到化學(xué)信號，就可能會改變其垂直分布，使幼蟲集中分布在水體的底部或附著在附著基上[15]。

5-HT是一種神經(jīng)遞質(zhì)和調(diào)節(jié)劑，在無脊椎動物的神經(jīng)系統(tǒng)中起著重要的作用[16]。研究表明，5-HT可以誘導(dǎo)大珠母貝（）[17]和羊鮑（）[8]等幼蟲的變態(tài)發(fā)育。本研究中，10-5mol/L的5-HT處理24、48、72和96 h后，馬氏珠母貝眼點幼蟲的附著率均顯著高于對照組，最高可達(dá)對照組的6.3倍。該結(jié)果與Yu等[14]的誘導(dǎo)結(jié)果相似；同時與本團隊馬氏珠母貝眼點幼蟲附著變態(tài)前后轉(zhuǎn)錄組與代謝組研究中血清素及血清素受體相關(guān)基因的變化相呼應(yīng)[13]。

蛻皮激素是節(jié)肢動物幼蟲啟動變態(tài)過程中最重要的激素之一，蛻皮激素與蛻皮激素受體觸發(fā)昆蟲變態(tài)的一系列級聯(lián)反應(yīng)[18]。蛻皮激素受體最初被認(rèn)為是蛻皮動物所特有，但現(xiàn)有基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析顯示，蛻皮激素受體以及蛻皮激素級聯(lián)反應(yīng)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子同樣存在于軟體動物，例如，長牡蠣（）[19]、青螺（）[20]和光滑雙臍螺（）[21]。Vogeler等[22]研究發(fā)現(xiàn)蛻皮激素在長牡蠣（）變態(tài)前的面盤幼蟲中高表達(dá)，推測了蛻皮激素在雙殼類變態(tài)中起到誘導(dǎo)作用。Chelikowsk等[23]在對海灣扇貝（）的研究中發(fā)現(xiàn)，合成的蛻皮激素與pavlovol（微藻屬的一種甾醇，與蛻皮激素結(jié)構(gòu)相似）能夠誘導(dǎo)海灣扇貝幼蟲的變態(tài)。本團隊前期的代謝組分析發(fā)現(xiàn)蛻皮激素在進(jìn)入稚貝期后發(fā)生下調(diào)；并且甾醇激素生物合成通路在幼蟲附著期到稚貝期之間被富集[13]。本研究結(jié)果顯示，適宜濃度的蛻皮激素能夠引起馬氏珠母貝眼點幼蟲附著率上升，進(jìn)一步證明馬氏珠母貝的附著受到蛻皮激素的調(diào)控。

GABA是一種重要的抑制性氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)，它是由谷氨酸經(jīng)谷氨酸脫羧酶催化脫羧基產(chǎn)生，GABA敏感細(xì)胞的去極化可能參與幼體的附著變態(tài)，并在多種貝類中發(fā)揮作用[24-25]。然而，GABA可能對一些貝類的幼蟲產(chǎn)生毒性作用，例如綠唇貽貝（）[26]；Young等[26]推測該毒性作用是由于GABA受體導(dǎo)致的神經(jīng)元膜的抑制性超極化。但是GABA在適宜濃度時，其誘導(dǎo)效果顯著，且無毒副作用。本研究中，10-5mol/L的GABA處理24、48、72和96 h后，馬氏珠母貝眼點幼蟲的附著率均顯著高于對照組，最高可達(dá)對照組的5.5倍。這與誘導(dǎo)西施舌幼蟲附著變態(tài)的GABA適宜濃度相一致[27]。

嘌呤類物質(zhì)可以作為一種信號分子影響魚類與多毛類的生理活動。例如，ATP、ADP、AMP和腺嘌呤核苷可以提高魚類的食欲，而次黃嘌呤3-N-氧化物可以引起魚類的回避行為或警惕行為[28-29]；嘌呤代謝物尿酸和次黃嘌呤核苷可以分別作為精子和卵子的釋放信息素[30-31]。He等[32]研究發(fā)現(xiàn)腺嘌呤核苷、次黃嘌呤核苷與次黃嘌呤作為信息素，可以誘導(dǎo)沙篩貝（）幼蟲的沉降形成聚集，并且三種嘌呤共同作用的誘導(dǎo)效果比單一嘌呤的作用更強，且沙篩貝對特定比例的嘌呤混合物最為敏感。本研究發(fā)現(xiàn)腺嘌呤核苷、次黃嘌呤核苷與次黃嘌呤對馬氏珠母貝幼蟲的附著存在不同程度的誘導(dǎo)作用，推測嘌呤可能作為一種信號分子誘導(dǎo)馬氏珠母貝幼蟲附著。但是，是否存在誘導(dǎo)幼蟲附著的最佳特定比例及嘌呤類化合物是如何引起馬氏珠母貝幼蟲變態(tài)等問題還需要進(jìn)一步研究。

本研究中，5-HT、蛻皮激素、GABA、腺嘌呤核苷酸、次黃嘌呤核苷酸和次黃嘌呤溶液在適宜的濃度和處理時間均可誘導(dǎo)馬氏珠母貝眼點幼蟲附著，其中10-5mol/L的5-HT處理24 h對附著率的誘導(dǎo)效果最佳，可達(dá)對照組的6.3倍。研究結(jié)果為珍珠貝幼蟲附著變態(tài)研究奠定基礎(chǔ)，有助于為高效的商業(yè)化苗種培育提供技術(shù)支撐。

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Effect of Chemical Cues on Settlement of Pearl OysterEyespot Larvae

YANG Chuang-ye1, ZHANG Jia-bin1, ZENG Ye-tao1, LIAO Yong-shan2, DENG Yue-wen1,3, WANG Qing-heng1,3

（1.// 2.// 3.,524088,）

【Objective】The objective of the present study was to research the effects of 5-Hydroxytryptamine (5-HT), ecdysone, γ-aminobutyric acid (GABA), adenine nucleotides, hypoxanthine nucleotides and hypoxanthine on theeyespot larvae settlement of. 【Method】By studying thetime-course and changes on settlement rate of eyespot larvae after5 treating with different concentrations of 5-HT, ecdysone, GABA, adenine nucleotides, hypoxanthine nucleotides and hypoxanthine.【Result】During the 24?96 h, the settlement of eyespot larvae was induced by 5-HT, ecdysone and GABA showed an overall upward trend. During the 24-120 h, the settlement of eyespot larvae induced by adenine nucleotides, hypoxanthine nucleotides and hypoxanthine showed an overall upward trend. After treatment with 10-5mol/L 5-HT and GABA for 24 h, 48 h, 72 h and 96 h, the settlement rate of eyespot larvae was significantly higher than that of the control group (< 0.01). The 10-5mol/L ecdysone treatment for 24 h and 72 h, 10-6mol/L ecdysone treatment for 24 h and 96 h, and 10-7mol/L ecdysone treatment for 24 h, the settlement rate of eyespot larvae was significantly higher than that of the control group (< 0.01). The 10 μmol/L adenosine nucleotides treatment for 24 h, 48 h, 72 h and 120 h, 1 μmol/L adenosine nucleotides treatment for 24 h, 48 h, 72 h, 96 h and 120 h, the settlement rate of eyespot larvae was significantly higher than that of the control group (< 0.01). The10 μmol/L inosine treatment for 48 h and 72 h, 1 μmol/L inosine treatment for 48 h, 72 h, 96 h and 120 h, the eyespot larval settlement rate was significantly higher than that of the control group (< 0.01). 10 μmol/L hypoxanthine treatment for 72 h, 96 h and 120 h, the eyespot larvae settlement rate was significantly higher than the control group (< 0.01).【Conclusion】With an appropriate concentration and treatment time, 5-HT, ecdysone, GABA, adenine nucleotides, hypoxanthine nucleotides and hypoxanthine solutions could induce eyespot larvae settlement and a 10-5mol/L 5-HT treatment for 24 h presented the best induction effect on eyespot larvae settlement rate, which showed 6.3 times higher than that of control group.

; eyespot larvae; settlement; chemical cues

S917.4

A

1673-9159（2022）01-0029-06

10.3969/j.issn.1673-9159.2022.01.005

楊創(chuàng)業(yè)，章佳斌，曾業(yè)濤，等. 化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)對馬氏珠母貝眼點幼蟲附著的影響[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報，2022，42（1）：29-34.

2021-08-22

國家自然科學(xué)基金（32102817）；廣東省基礎(chǔ)與應(yīng)用基礎(chǔ)研究基金項目（2019A1515111026）；廣東省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳項目（2020KJ146和粵財農(nóng)[2020]4號）；廣東省教育廳項目（2019KQNCX043和2020ZDZX1045）；大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（CXXL2020045）

楊創(chuàng)業(yè)（1990－），男，博士，講師，研究方向為無脊椎動物增養(yǎng)殖及珍珠培育。E-mail：yangcy@gdou.edu.cn

鄧岳文，教授，研究方向為珍珠貝養(yǎng)殖與育珠。E-mail：dengyw@gdou.edu.cn

（責(zé)任編輯：劉嶺）