劉 怡，陳敏琪，張 翼,3，千忠吉,3

海洋土曲霉C23-3代謝產(chǎn)物epi-aszonalenin A對內(nèi)皮細胞的活性機制

劉 怡1，陳敏琪2，張 翼2,3，千忠吉1,3

（廣東海洋大學1.化學與環(huán)境學院 / 2.食品科技學院，廣東 湛江 524088；3. 廣東海洋大學深圳研究院，廣東 深圳 518120）

【目的】探究海洋土霉菌代謝產(chǎn)物epi-aszonalenin A（EAA）對氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)誘導HUVEC人臍靜脈內(nèi)皮細胞的動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)血管新生的作用?！痉椒ā坑肅CK法檢測細胞活力，DCFH-DA法測定活性氧（ROS）的含量，劃痕實驗檢測細胞遷移能力，血管生成實驗檢測細胞成管能力，酶聯(lián)免疫吸附法ELISA試劑盒檢測LOX-1和VEGF蛋白表達情況，蛋白免疫印跡法檢測MAPK通路、細胞間黏附分子-1（ICAM-1）、血管細胞黏附分子-1（VCAM-1）的蛋白的表達情況，分子對接模擬EAA與LOX-1蛋白的相互作用?！窘Y果】CCK法證明EAA對HUVEC細胞無明顯毒性作用（> 0.05）；與空白組相比，EAA對HUVEC細胞的遷移和血管生成起到顯著抑制作用（< 0.001）；與對照組相比，隨著實驗組EAA濃度增加，細胞內(nèi)ROS含量顯著減少（< 0.001），LOX-1、VEGF、MAPK通路蛋白p38、JNK、ERK的磷酸化和ICAM-1、VCAM-1的表達也顯著降低（< 0.001）；此外EAA能與LOX-1形成穩(wěn)定的相互作用?！窘Y論】EAA能清除ROS，抑制HUVEC細胞炎性因子的表達和血管生成。

土曲霉；代謝產(chǎn)物；人臍靜脈內(nèi)皮細胞；血管生成；抗炎；氧化型低密度脂蛋白

動脈粥樣硬化（Atherosc1erosis，As）是一種炎癥性心血管疾病，是引起冠心病、腦梗死、血栓塞性疾病等多種疾病主要原因[1]。其典型特征之一是斑塊內(nèi)氧化修飾的低密度脂蛋白（ox-LDL）的積累，這些脂蛋白可通過特定受體，即凝集素型氧化LDL受體(LOX-1)[2]，導致氧化應激，細胞內(nèi)ROS過量積累，從而誘導內(nèi)皮細胞的功能障礙和凋亡。由ox-LDL引起的AS主要由內(nèi)皮受體LOX-1介導，而LOX-1過度表達可導致內(nèi)皮激活和損傷[3]，同時會誘導AS疾病中的斑塊形成[4]。研究表明[5]，低氧環(huán)境對AS疾病發(fā)展有促進作用，使低氧誘導因子-1α（HIF-1α）的蛋白表達增加，而后能對VEGF的蛋白分泌激活誘導，從而刺激其生長最終導致血管新生[6]。VEGF作為主要的一種人體內(nèi)血管生成的關鍵調控因子，是促進血管新生被研究最多的關鍵蛋白[7]。血管生成在AS疾病進展中有重大意義，缺氧和炎癥狀態(tài)會使血管生成和炎癥因子過度表達，促進AS病變區(qū)域的斑塊發(fā)展，穩(wěn)定性降低，從而引起斑塊出血、破裂或其他病變衍生[8]。AS同時會引起VEGF下游通路MAPKs的過表達[9]，也會引起內(nèi)皮細胞血管新生因子和包括黏附分子（ICAM-1、VCAM-1）的過度表達[10]，又會引起進一步刺激血管新生因子和炎癥因子，激發(fā)正反饋機制，動脈粥樣硬化中形成不穩(wěn)定斑塊，出血或破裂后造成急性冠狀動脈綜合征[11-12]。但目前已有抗血管生成藥物在臨床應用中副作用極大[13-14]。因此，需要找到更好應用于抗動脈粥樣硬化斑塊血管生成特效藥物。

近年來對內(nèi)生真菌和海洋真菌的研究越來越多，這些真菌為篩選新的高活性低毒性天然產(chǎn)物提供了一線希望[15]。epi-aszonalenin A（EAA）是一種從廣東徐聞的牡丹珊瑚()內(nèi)分離的土曲霉C23-3代謝產(chǎn)物。海洋真菌土曲霉C23-3(GDMCC No.60316)采自徐聞珊瑚自然保護區(qū)，現(xiàn)保存于廣東省微生物菌種保藏中心。土曲霉()屬于子囊菌門內(nèi)，是廣泛存在于海洋和陸地的一種真菌[16]。

有許多研究發(fā)現(xiàn)并證明土曲霉衍生化合物具有抗炎、抗氧化活性[17-18]，但是未見關于抗動脈粥樣硬化的活性成果報道。生物堿EAA目前為止也未見研究報道，是一種未被開發(fā)活性的潛在可利用生物堿。因此，本研究以抗動脈粥樣硬化疾病中斑塊病變的方向來研究EAA的抗炎、抗血管生成作用機制，從而為海洋土曲霉代謝產(chǎn)物在海洋藥物研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

人臍靜脈內(nèi)皮細胞HUVEC（蘇州北納創(chuàng)聯(lián)生物技術有限公司）；低密度脂蛋白ox-LDL（上海源葉生物科技有限公司）；LOX-1 ELISA試劑盒、VEGF ELISA試劑盒（武漢酶免生物科技有限公司）；小鼠多克隆抗體p38(sc-535)、p-p38(sc-166182)、JNK(sc-7345)、p-JNK(sc-6254)、ERK(sc-94)、p-ERK(sc-81492)、ICAM-1(sc-107)、VCAM-1(sc-13106)、羊抗鼠IgG-HRP(sc-2005)（美國Santa Cruz Biotechnology）。

酶標儀（Bioteck儀器公司）；顯微鏡（廣州吉迪有限公司）；細胞計數(shù)儀（Bioteck儀器公司）；小型垂直電泳槽和電轉槽（Bio-Rad公司）；全自動化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）；凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 土曲霉代謝物提取與分離 土曲霉C23-3菌株在馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液(PDB)中在1 L燒瓶中在28℃、150 r/min的搖床上發(fā)酵7 d。完成后，將培養(yǎng)物過濾，分離出上清液和菌絲體，分別用乙酸乙酯和乙酸乙酯加氯仿-甲醇（體積分數(shù)1∶1），混合液提取。合并兩種提取物并真空濃縮成粗提取物。該提取物在Sephadex LH-20柱上分離，用氯仿-甲醇（體積分數(shù)1∶1）洗脫，得到不同餾分。Fr6通過Sephadex LH-20柱進一步純化，由甲醇洗脫，然后通過制備型RP-18 HPLC以體積分數(shù)70∶30甲醇-水洗脫，得到純化合物epi-aszonalenin A[19]。

Epi-aszonalenin A, 白色無定型粉末，1H結果(CDCl3):H6.04 (1H, s, H-2)，7.32 (1H, dd,= 7.4, 1.8 Hz, H-5)，7.10 (1H, m, H-6), 7.20 (1H, m, H-7)，7.84 (1H, m, H-8)，3.05 (1H, d,=13.1 Hz, H-10a)，2.49 (1H, dd,= 13.1, 9.7 Hz, H-10b)，4.02 (1H, d,= 9.7 Hz, H-11)，6.75 (1H, d,= 8.0Hz, H-15)，7.39 (1H, td,= 7.2, 1.4 Hz, H-16)，7.20 (1H, m, H-17)，7.98 (1H, d,= 7.0Hz, H-18)，5.81 (1H, dd,= 17.4, 10.9Hz, H-23)，5.10 (1H, d,= 17.4 Hz, H-24)，5.07 (1H, d,= 10.9 Hz, H-24)，1.11 (3H, s, H-25)，0.88 (3H, s, H-26)，2.66 (3H, s, H-28) (1)，分子質量為415 u。

1.2.1 細胞培養(yǎng) HUVEC細胞在Eagle DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，添加體積分數(shù)10％胎牛血清（FBS）和體積分數(shù)1％青霉素-鏈霉素，并在含體積分數(shù)5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中恒溫37 ℃培養(yǎng)。

1.2.2 細胞活性實驗 將HUVEC細胞接種在96孔板中培養(yǎng)，生長穩(wěn)定后加入DMEM培養(yǎng)基和不同濃度的樣品，濃度設置為0、1、5和10 μmol/L。繼續(xù)在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。棄其上清，用PBS潤洗細胞后加入10 μL的CCK-8溶液，37 ℃避光培養(yǎng)1 h。用酶標儀檢測每孔波長為450 nm時的值并記錄分析。

1.2.3 細胞遷移實驗 將HUVEC細胞接種在24孔板上培養(yǎng)，生長穩(wěn)定后用200 μL的槍頭在孔板中劃出邊緣整齊的傷口，用PBS溶液去除細胞碎片后，生長穩(wěn)定后加入DMEM培養(yǎng)基和不同濃度的樣品，濃度設置為0、1和10 μmol/L。分別于0、12 和24 h用顯微鏡對細胞向創(chuàng)面邊緣遷移的情況進行拍照并記錄分析。

1.2.4 Western blot 將HUVEC細胞在6孔板中培養(yǎng)，生長穩(wěn)定后加入DMEM培養(yǎng)基和不同濃度的樣品，濃度設置為0、1和10 μmol/L。1 h后加入10 μL的Ox-LDL（50 μg/mL）。設置空白組和陽性對照組，空白組中不加EAA和ox-LDL，陽性對照組不加EAA。培養(yǎng)24 h后棄其上清后，加入適量裂解液，將用細胞刮刀將細胞掛下，并在12 000 r/min，4℃離心15 min取上清液。BCA蛋白定量，并調整各組細胞培養(yǎng)上清液中的蛋白濃度。通過SDS-PAGE電泳后，根據(jù)蛋白分子大小將凝膠分切，置于NC膜上通過SDS-PAGE電泳進行蛋白印跡轉移，在體積分數(shù)5%的脫脂牛奶中封閉2 h，用TBST清洗條帶3次，每次10 min。分別加入對應的一抗溶液常溫孵育4 h，用TBST清洗條帶3次后加入對應的二抗溶液常溫孵育2 h后再次清洗。利用全自動化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)顯色觀察并拍照記錄。分析系統(tǒng)分析讀取條帶面積、寬度和灰度值，做統(tǒng)計分析。

1.2.5 酶聯(lián)免疫吸附 通過ELISA試劑盒測定HUVEC細胞中LOX-1蛋白的表達量。將HUVEC細胞在6孔板中培養(yǎng)，生長穩(wěn)定后加入DMEM培養(yǎng)基和不同濃度的樣品，濃度設置為0、1和10 μmol/L。1 h后加入10 μL的Ox-LDL（50 μg/mL）。設置空白組和陽性對照組，空白組不加EAA和ox-LDL，陽性對照組不加EAA。棄其上清后，加入PBS溶液，用細胞刮刀將細胞掛下，細胞懸浮液收集于無菌試管中反復凍融裂解蛋白后，12 000 r/min，4℃離心15 min得上清液，再根據(jù)試劑盒中的方案分析LOX-1蛋白的表達量。

1.2.6 血管生成實驗 實驗所用槍頭和96孔板進行?20 ℃預冷，在冰上每孔加入60 μL基質膠，放入培養(yǎng)箱中靜置30 min。將HUVEC懸液用細胞計數(shù)儀確定最終所需濃度（1 × 106cell/mL）后，每孔共加入EAA（0、1和10 μmol/L）和細胞懸液混合液200 μL，并設置一組陽性對照組，加入10 μLOx-LDL（50 μg/mL）。在培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h后用顯微鏡拍照記錄。

1.2.7 ROS分析 將HUVEC細胞接種于24孔板中。生長穩(wěn)定后加入DMEM培養(yǎng)基和不同濃度的樣品，濃度設置為0、1和10 μmol/L。1 h后加入10 μL的Ox-LDL（50 μg/mL）。設置空白組和陽性對照組，空白組中不加EAA和ox-LDL，陽性對照組不加EAA。放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h。棄去舊培養(yǎng)基，用PBS緩沖溶液潤洗細胞3次，加入200 μL DCFH-DA試劑(10 μmol/L)后置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育30 min。于熒光倒置顯微鏡下觀察并拍照記錄分析。

1.2.8 分子對接 采用ChemBioDraw Ultra 14.0畫出化合物EAA的結構（圖1），然后用ChemBio3D Ultra 14.0轉化為三維結構，并使用MMFF94力場進行優(yōu)化。血凝素樣氧化低密度脂蛋白受體（LOX-1）的三維結構從RCSB Protein Data Bank (www.rcsb.org)下載得到，選取LOX-1與其抑制劑Dioxane共晶的三維結構（PDB ID: 1YPQ）作為本課題對接所用的蛋白。LOX-1和化合物EAA均使用AutodockTools 1.5.6[20]轉化為PDBQT格式。本研究采用Autodock vina 1.1.2[21]進行分子對接研究。根據(jù)配體Dioxane位置，確定LOX-1活性位點的坐標為：center_= 10.008，center_= 5.816，center_= 20.360；size_= 20，size_= 20，size_= 20。為增加計算準確度，將參數(shù)exhaustiveness設置為100。除特別說明，其他參數(shù)均采用默認值。最后，選取打分值最高的構象用PyMoL 1.7.6進行結果分析。

1.3 統(tǒng)計分析

采用Image J、Graphpad Prism 5.0軟件進行數(shù)據(jù)處理分析及制圖。所有實驗結果以平均值±標準差表示，顯著性差異使用單因素方差分析（one-way ANOVA分析）。與對照組相比，< 0.05代表有差異，< 0.01代表差異顯著，< 0.001代表差異極顯著。

2 實驗結果

2.1 EAA對HUVEC細胞活力的影響

由圖2可見，當EAA濃度為1、5和10 μmol/L時，與同條件下空白組相比，HUVEC的細胞活性均無顯著差異（> 0.05）。該實驗結果表明濃度為0～10 μmol/L的EAA對HUVEC在無細胞毒性作用，該濃度范圍可進行后續(xù)活性探究，因此后續(xù)選用低濃度1 μmol/L和高濃度10 μmol/L進行活性研究。

2.2 EAA對HUVEC細胞中LOX-1和VEGF蛋白表達的影響

由圖3、4可見，Ox-LDL可顯著性誘導HUVEC細胞中受體蛋白LOX-1和血管生成關鍵蛋白VEGF的表達（< 0.01），而當EAA濃度為1、10 μmol/L時可以有效對其表達起到抑制作用（< 0.001），并且高濃度組的實驗組抑制效果顯著。因此可推論，EAA以劑量依賴方式減少HUVEC細胞中LOX-1和VEGF蛋白的表達及抑制Ox-LDL對細胞的影響。

陽性對照組不加EAA，處理組1加EAA 1 μmol/L及 Ox-LDL，處理組2加EAA 10 μmol/L及 Ox-LDL；與對照組相比* P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001

陽性對照組不加EAA，處理組1加EAA 1 μmol/L及 Ox-LDL，處理組2加EAA 10 μmol/L及 Ox-LDL；與對照組相比* P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001

2.3 EAA對HUVEC細胞中ROS活性氧的影響

由圖6可見AA濃度為0 μmol/L時，熒光較少，而與空白組相比ox-LDL組顯著誘導了HUVEC細胞的ROS水平（<0.001）。當EAA濃度為1、10 μmol/L時可有效對ROS的產(chǎn)生起到抑制作用（<0.001），且高濃度組的實驗組抑制效果顯著。該結果表明高濃度ETT以劑量依賴方式顯著減輕了HUVEC中的ROS產(chǎn)生。

圖5 HUVEC的ROS熒光圖

陽性對照組不加EAA，處理組1加EAA 1 μmol/L及 Ox-LDL，處理組2加EAA 10 μmol/L及 Ox-LDL；與對照組相比* P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001

2.4 EAA 對HUVEC細胞的遷移的影響

根據(jù)圖8的細胞劃痕實驗結果分析，當EAA濃度為1、10 μmol/L時可以有效對細胞遷移起到抑制作用（< 0.001），并且高濃度組的實驗組細胞的遷移被抑制的效果顯著。根據(jù)12 h和24 h的對比可見，抑制效果可持續(xù)24 h，且效果隨時間呈正比。結果表明EAA在細胞水平上具有抑制HUVEC細胞的遷移作用且是以劑量依賴的方式。

2.5 EAA對HUVEC細胞血管形成的影響

根據(jù)圖9的血管形成實驗圖分析，EAA濃度為0 μmol/L時，HUVEC呈連接網(wǎng)狀較多，而對照組中Ox-LDL顯著性誘導HUVEC細胞的血管形成，細胞網(wǎng)狀結構密集。EAA實驗組的細胞集合明顯少于空白組和對照組，HUVEC細胞主要呈單一分散排布的狀態(tài)。該結果表明EAA以劑量依賴的方式抑制HUVEC細胞血管形成。

圖7 EAA的細胞劃痕圖片

與空白組相比,* P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001

圖9 EAA對HUVEC的血管生成影響

2.6 EAA對HUVEC細胞中MAPK通s路表達影響

由圖10和11免疫印跡條帶結果分析，Ox-LDL可顯著誘導HUVEC細胞MAPK通路蛋白的表達（<0.01），當EAA的濃度為1、10 μmol/L時可以有效對p38、JNK和ERK的磷酸化起到抑制作用（<0.001），并且高濃度組的實驗組抑制效果顯著。因此可推論，EAA以劑量依賴的方式減少HUVEC細胞中MAPK通路蛋白的表達及抑制其活性以達到抑制細胞遷移生長的作用。

“－”表示不添加，“＋”表示添加

陽性對照組不加EAA，處理組1加EAA 1 μmol/L及 Ox-LDL，處理組2加EAA 10 μmol/L及 Ox-LDL；與對照組相比* P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001

2.7 EAA對HUVEC細胞中ICAM-1和VCAM-1蛋白表達的影響

由圖12和13的蛋白免疫印跡條帶結果分析，Ox-LDL可顯著誘導HUVEC細胞ICAM-1和VCAM-1蛋白的表達（<0.01），當EAA濃度為1、10 μmol/L時可以有效對ICAM-1和VCAM-1蛋白表達起到抑制作用（<0.001），并且高濃度實驗組抑制效果顯著。因此可推論，EAA以劑量依賴的方式減少HUVEC細胞中ICAM-1和VCAM-1蛋白的表達以達到抑制動脈粥樣硬化斑塊形成作用。

“－”表示不添加，“＋”表示添加

陽性對照組不加EAA，處理組1加EAA 1 μmol/L及 Ox-LDL，處理組2加EAA 10 μmol/L及 Ox-LDL；與對照組相比* P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001

2.8 EAA與LOX-1分子模擬對接

為從分子水平闡明LOX-1與化合物EAA的作用模式，將化合物EAA對接至LOX-1的活性口袋，其親和力為-26.37 kJ/mol，理論結合模式如圖14和15所示。由圖14可以看出，化合物EAA的活性口袋中呈現(xiàn)出緊湊的結合模式。EAA處于一個由氨基酸Asp-147、Trp-148、Leu-157、Phe-158、Ser-159、Ser-160、Leu-175、Gln-193和Tyr-197所組成的腔袋，形成強烈的疏水性相互作用（圖15）。EAA的可以與氨基酸Phe-158形成長為5.3×10-10m的氫鍵作用（圖15），這是EAA和LOX-1之間最主要作用力。

圖14 EAA對接至LOX-1的活性口袋的整體圖

圖15 EAA對接至LOX-1的活性口袋的細節(jié)圖

總之，上述的分子對接研究對EAA和LOX-1的相互作用給予了合理的解釋，為進一步研究LOX-1抑制劑奠定了基礎。

3 討論

動脈粥樣硬化的發(fā)病機理十分復雜，主要涉及內(nèi)皮細胞（ECs）、脂質代謝和血管平滑肌肉細胞（VSMC）。而在這些因素中，血管內(nèi)皮細胞（VEC）損傷是動脈粥樣硬化病變開始的早期步驟[22]。Ox-LDL通過多種機制促進動脈粥樣硬化斑塊的形成和進展，包括誘導內(nèi)皮損傷、內(nèi)皮細胞凋亡、巨噬細胞形成泡沫細胞和破壞抗氧化能力[2]。因此，本研究以Ox-LDL處理人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC），引起內(nèi)皮細胞損傷，研究EAA抗動脈粥樣硬化疾病中血管生成病變的作用機制。有研究表明，LOX-1是Ox-LDL主要的內(nèi)皮受體，可被Ox-LDL誘導引起過度表達，進而導致內(nèi)皮激活和傷害，進而導致氧化和炎癥反應，各種炎癥介質和細胞因子不平衡表達[23-24]。本研究中EAA在無細胞毒性的基礎上，能夠抑制HUVEC細胞的遷移和血管生成行為，這說明EAA具有抗細胞轉移和血管生成的潛力。同時，EAA能顯著降低由Ox-LDL誘導的HUVEC細胞LOX-1和VEGF蛋白表達，因此EAA具有減少炎癥反應和斑塊內(nèi)血管生成的活性。

細胞內(nèi)積累過量的ROS被視為氧化應激的根本原因之一，ROS可促進動脈粥樣硬化發(fā)展過程中內(nèi)皮細胞凋亡和炎癥因子的表達，進而引起炎癥反應和功能障礙[25]。EAA能夠降低由Ox-LDL誘導的HUVEC細胞ROS產(chǎn)生，減少內(nèi)皮功能障礙和炎癥反應發(fā)生的可能。黏附分子ICAM-1和VCAM-1是免疫球蛋白超家族（IGSF）的成員，是重要的一種炎癥因子，能夠促進炎癥部位的黏連性[26]。MAPK通路是調節(jié)動脈粥樣硬化中的關鍵通路之一，參與動脈粥樣硬化炎癥反應的調節(jié)，能夠通過生長、炎癥凋亡等多種方式調控細胞[27]。VEGF作為血管的有效促分裂原，是血管生成和內(nèi)皮細胞的主要調節(jié)劑之一，MAPK信號通路同時也是VEGF的下游通路之一，能夠被VEGF調節(jié)從而促進血管內(nèi)皮細胞的增殖、侵襲和血管生成[9]。EAA表現(xiàn)出對MAPK信號通路、ICAM-1和VCAM-1蛋白表達具有顯著的抑制作用，這些結果說明EAA能夠通過抑制Ox-LDL誘導的炎癥和血管新生，表現(xiàn)出優(yōu)秀的抗動脈粥樣硬化活性。分子對接結果顯示，EAA與LOX-1產(chǎn)生穩(wěn)定的氫鍵，具有相互作用，這表明EAA具有有效減少黏附分子、血管生成因子和炎癥因子表達的活性。因實驗條件，本研究沒能對其他炎癥通路和侵襲、血管生成通路進行驗證，這將是今后進一步研究的重點。

4 結論

綜上所述，海洋土曲霉代謝產(chǎn)物epi-aszonalenin A（EAA）能抑制氧化型低密度脂蛋白Ox-LDL誘導的HUVEC細胞中LOX-1、VEGF、MAPK信號通路、ICAM-1和VCAM-1蛋白表達，從而使HUVEC細胞炎癥、遷移和血管生成得到抑制。分子對接預測分析進一步證實EAA與LOX-1具有穩(wěn)定的結合位點。這為海洋土曲霉代謝產(chǎn)物EAA成為潛在動脈粥樣硬化斑塊血管生成預防功能性產(chǎn)品或治療藥物提供理論依據(jù)。

[1] LIBBY P. Atherosclerosis in inflammation[J]. Nature, 2002, 420(6917): 868-874.

[2] PIRILLO A, NORATA G D, CATAPANO A L. LOX-1, OxLDL, and atherosclerosis[J]. Mediators of Inflammation, 2013(24): 152786.

[3] SAWAMURA T, KUME N, AOYAMA T, et al. An endothelial receptor for oxidized low-density lipoprotein[J]. Nature, 1997, 386(6620): 73-77.

[4] AKHMEDOV A, ROZENBERG I, PANENI F, et al. Endothelial overexpression of LOX-1 increases plaque formation and promotes atherosclerosis[J]. European Heart Journal, 2014, 35(40): 2839-2848.

[5] JUN J, REINKE C, BEDJA D, et al. Effect of intermittent hypoxia on atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice[J]. Atherosclerosis, 2010, 209(2): 381-386.

[6] FERRARA N, GERBER H P, LECOUTER J. The biology of VEGF and its receptors[J]. Nature Medicine, 2003, 9(6): 669-676.

[7] AOKI K, WATANABE K, SATO M, et al. Effects of rhizoxin, a microbial angiogenesis inhibitor, on angiogenic endothelial cell functions[J]. European Journal of Pharmacology, 2003, 459(2/3): 131-138.

[8] MORENO P R, PURUSHOTHAMAN K R, ZIAS E, et al. Neovascularization in human atherosclerosis[J]. Current Molecular Medicine, 2006, 6(5): 457-477.

[9] PRADHAN R, SINGHVI G, DUBEY S K, et al. MAPK pathway: a potential target for the treatment of non-small-cell lung carcinoma[J]. Future Medicinal Chemistry, 2019, 11(8): 793-795.

[10] 毛洋, 劉小瓊, 王洪梅, 等. 細胞間黏附分子1、血管細胞黏附分子1促進兔動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)血管新生[J]. 中國動脈硬化雜志, 2014, 22(3): 217-222.

[11] KOLODGIE F D, GOLD H K, BURKE A P, et al. Intraplaque hemorrhage and progression of coronary atheroma[J]. The New England Journal of Medicine, 2003, 349(24): 2316-2325.

[12] PARMA L, BAGANHA F, QUAX P H A, et al. Plaque angiogenesis and intraplaque hemorrhage in atherosclerosis[J]. European Journal of Pharmacology, 2017, 816: 107-115.

[13] MAUREA N, COPPOLA C, PISCOPO G, et al. Pathophysiology of cardiotoxicity from target therapy and angiogenesis inhibitors[J]. Journal of Cardiovascular Medicine (Hagerstown, Md), 2016, 17(Suppl 1 Special issue on Cardiotoxicity from Antiblastic Drugs and Cardioprotection): e19-e26.

[14] TOCCHETTI C G, GALLUCCI G, COPPOLA C, et al. The emerging issue of cardiac dysfunction induced by antineoplastic angiogenesis inhibitors[J]. European Journal of Heart Failure, 2013, 15(5): 482-489.

[15] SCHUEFFLER A, ANKE T. Fungal natural products in research and development[J]. Natural Product Reports, 2014, 31(10): 1425-1448.

[16] 楊靜明, 楊文聰, 劉亞月, 等. 化學誘導對一株海洋來源土曲霉C23-3次生代謝產(chǎn)物及其生物活性的影響[J]. 微生物學通報, 2019, 46(3): 441-452.

[17] ZHANG Y Y, ZHANG Y, YAO Y B, et al. Butyrolactone-I from coral-derived fungusattenuates neuro-inflammatory response via suppression of NF-κB pathway in BV-2 cells[J]. Marine Drugs, 2018, 16(6): E202.

[18] GUO F, LI Z L, XU X W, et al. Butenolide derivatives from the plant endophytic fungus[J]. Fitoterapia, 2016, 113: 44-50.

[19] RANK C, PHIPPS R K, HARRIS P, et al. Epi-Aszonalenins A, B, and C from[J]. Tetrahedron Letters, 2006, 47(34): 6099-6102.

[20] MORRIS G M, HUEY R, LINDSTROM W, et al. AutoDock4 and AutoDockTools4: Automated docking with selective receptor flexibility[J]. Journal of Computational Chemistry, 2009, 30(16): 2785-2791.

[21] TROTT O, OLSON A J. AutoDock Vina: improving the speed and accuracy of docking with a new scoring function, efficient optimization, and multithreading[J]. Journal of Computational Chemistry, 2010, 31(2): 455-461.

[12] WANG T, BUTANY J. Pathogenesis of atherosclerosis[J]. Diagnostic Histopathology, 2017, 23(11): 473-478.

[23] SAWAMURA T, KAKUTANI M, CHEN M Y, et al. LOX-1, an endothelial receptor for oxidized LDL Implications for induction of endothelium dysfunction in the pathogenesis of vascular diseases[C]//Lipoprotein Metabolism and Atherogenesis, 2000: 45:193-198.

[24] KATTOOR A J, KANURI S H, MEHTA J L. Role of ox-LDL and LOX-1 in atherogenesis[J]. Current Medicinal Chemistry, 2019, 26(9): 1693-1700.

[25] KATTOOR A J, POTHINENI N V K, PALAGIRI D, et al. Oxidative stress in atherosclerosis[J]. Current Atherosclerosis Reports, 2017, 19(11): 42.

[26] HUBBARD A K, ROTHLEIN R. Intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) expression and cell signaling cascades[J]. Free Radical Biology and Medicine, 2000, 28(9): 1379-1386.

[27] MAO J J, LIU J T, PANG X M, et al. Nicotine induces the expression of C-reactive protein via MAPK-dependent signal pathway in U937 macrophages[J]. Molecules and Cells, 2012, 34(5): 457-461.

Activie Mechanism of Epi-aszonalenin A Derived fromC23-3 on Endothelial Cells

LIU Yi1, CHEN Min-qi2, ZHANG Yi2,3, QIAN Zhong-ji1,3,

（1./ 2.,,524088,; 3.,518120,）

【Objective】To analyze the effect of epi-aszonalenin A (EAA), a metabolite of coral-derived fungus, on angiogenesis in atherosclerotic plaques induced by oxidized low-density lipoprotein (ox-LDL).【Methods】CCK method was used to detect cell viability; DCFH-DA was used to detect ROS content; scratch test was used to analyze the migration ability of human umbilical vein endothelial cells(HUVEC); angiogenesis was used to detect tube capacity; ELISA kit was used to detect the LOX-1 and VEGF proteins; western blotting was used to detect the expression of MAPK pathway, ICAM-1, VCAM-1 proteins; Molecular docking was used to simulate the interaction of EAA with LOX-1 protein.【Results】CCK method showed that EAA had no significant toxic effect on HUVEC (> 0.05). Compared with the blank control, EAA significantly inhibited cell migration and angiogenesis. Compared with the control group, ETT concentration in the experimental group increased. ROS content decreased significantly (< 0.001). LOX-1 and VEGF the expression of phosphorylation of p38, JNK, and ERK in MAPK pathway and ICAM-1 and VCAM-1 decreased gradually (< 0.001). Moreover, it can form a stable interaction with LOX-1. 【Conclusion】EAA can clear ROS and inhibit the expression of inflammatory factors and angiogenesis in HUVEC.

; metabolite; human umbilical vein endothelial cell; angiogenesis; anti-inflammatory;human oxidized low density lipoprotein

R915

A

1673-9159（2022）01-0059-08

10.3969/j.issn.1673-9159.2022.01.009

劉怡，陳敏琪，張翼，等. 海洋土曲霉C23-3代謝產(chǎn)物epi-aszonalenin A對內(nèi)皮細胞的活性機制[J]. 廣東海洋大學學報，2022，42（1）：59-66.

2021-11-03

深圳市國際合作研究項目協(xié)同創(chuàng)新專項（GJHZ20190823111601682）；南海海洋生物醫(yī)藥資源研發(fā)公共服務平臺項目（XM-202008-01B1）；廣東省基礎與應用基礎研究基金（2020A1515011075）

劉怡（1998－），女，碩士研究生，研究方向為海洋活性物質研究與開發(fā)。E-mail：Sioney61@163.com

張翼（1978－），男，博士，教授，研究方向為海洋天然物化學。E-mail:hebeizhangyi@163.com

千忠吉（1978－），男，博士，副教授，研究方向為海洋生物活性物質的研究與利用。E-mail：zjqian78@163.com

（責任編輯：劉嶺）