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        豬圓環(huán)病毒3型TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用

        2022-01-18 06:43:38黃紅亮方倪然陳瑞愛(ài)
        中國(guó)獸醫(yī)雜志 2021年10期
        關(guān)鍵詞:重復(fù)性定量質(zhì)粒

        楊 斌 , 黃紅亮 , 方倪然 , 陳瑞愛(ài),

        [1. 華農(nóng)(肇慶)生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院有限公司 , 廣東 云浮 527300 ; 2.廣東溫氏大華農(nóng)生物科技有限公司 , 廣東 新興 527400 ]

        豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus)屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬,是一種無(wú)囊膜、共價(jià)閉合的單股環(huán)狀DNA病毒,是目前已知最小的動(dòng)物DNA病毒,主要由PCV1、PCV2和PCV3組成[1]。PCV3基因組全長(zhǎng)約2.0kb,感染后臨床上主要表現(xiàn)為斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)、豬呼吸道綜合征(PRDC)、皮炎和腎病綜合征(PDNS)、繁殖障礙等疾病[2-3]。自2015年豬圓環(huán)病毒3型(PCV3)在美國(guó)首次被發(fā)現(xiàn)以來(lái),已經(jīng)在北美洲、亞洲、歐洲三大洲多個(gè)國(guó)家檢出患病豬只的組織中含有PCV3[3-7]。目前,PCV3已經(jīng)成為造養(yǎng)豬業(yè)損失的重要病因之一,并且還有加劇的趨勢(shì)。為了進(jìn)一步防控PCV3的蔓延,如何能夠準(zhǔn)確及時(shí)地對(duì)患病豬只進(jìn)行診斷變得尤為重要。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是近幾年發(fā)展起來(lái)的一種新的核酸定量檢測(cè)技術(shù)。與普通PCR相比,實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)不僅具有操作靈活、速度快、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),而且還能夠準(zhǔn)確定量,實(shí)時(shí)監(jiān)控PCR過(guò)程,因此目前其已經(jīng)越來(lái)越多應(yīng)用在豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬瘟病毒(CSFV)、豬偽狂犬病毒(PRV)、豬圓環(huán)病毒2型病毒(PCV2)等豬病毒分子的檢測(cè)[8]。

        本試驗(yàn)通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)建立了一套針對(duì)PCV3的有效檢測(cè)方法,并且在臨床上加以應(yīng)用,本方法的建立為臨床上快速診斷PCV3并及時(shí)防控提供了科學(xué)依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 主要材料 PCV3陽(yáng)性樣品由廣東溫氏研究院惠贈(zèng),本試驗(yàn)所需要的其他豬病陽(yáng)性樣品如CSFV、PRRSV、PCV2、PRV等均由本實(shí)驗(yàn)保存。

        1.2 主要試劑 DNA Marker DL2 000、rTaq聚合酶預(yù)混液、膠回收試劑盒、JM109大腸桿菌細(xì)胞、T4 DNA連接酶、TaqDNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒,均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;G-Red核酸染料,購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司;DNA抽提試劑盒,購(gòu)自康寧生命科學(xué)(吳江)有限公司;LB培養(yǎng)基,購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;瓊脂糖,購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司;TAE緩沖液,購(gòu)自上海百賽生物技術(shù)有限公司。

        1.3 熒光定量PCR方法的建立

        1.3.1 探針和引物的設(shè)計(jì) 根據(jù)豬圓環(huán)病毒3型PCV3-Hebei-LY_2015毒株(GenBank登錄號(hào):MF318451.1)應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)1對(duì)引物和探針,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,引物和探針序列見(jiàn)表1。

        表1 引物探針序列及擴(kuò)增片段大小Table 1 Primer and probe sequence and amplified fragment size

        1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)品的制備 將目的片段連接pMD18-T載體,重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌,培養(yǎng)含有pMD18-T-PCV3的目的菌株并提取質(zhì)粒,將構(gòu)建的質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序鑒定無(wú)誤后用紫外分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒OD值,置于-20 ℃保存。

        1.3.3 熒光定量PCR反應(yīng)體系及條件的優(yōu)化 對(duì)循環(huán)數(shù)、探針濃度、退火溫度、模板量進(jìn)行摸索以獲得最佳的反應(yīng)條件。

        1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 經(jīng)過(guò)測(cè)定和計(jì)算,提取的質(zhì)??截悢?shù)為1.18×1011copies/μL。將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋1 000倍后,繼續(xù)做10倍系列稀釋,與之相對(duì)應(yīng)的模板濃度分別是1.18×108、1.18×107、1.18×106、1.18×105、1.18×104copies/μL和1.18×103copies/μL。以起始模板數(shù)作X軸,Ct值為Y軸做回歸曲線,建立PCV3的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

        1.3.5 敏感性試驗(yàn) 為了檢驗(yàn)TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)方法的敏感性,模板質(zhì)粒濃度為1.18×108、1.18×107、1.18×106、1.18×105、1.18×104、1.18×103、1.18×102copies/μL和1.18×101copies/μL,每個(gè)濃度做3個(gè)重復(fù)孔,進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。

        1.3.6 特異性試驗(yàn) 提取PCV2、PRV的DNA以及PRRSV和CSFV的RNA(經(jīng)反轉(zhuǎn)錄為cDNA),并且按照上述方法進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè),同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照。

        1.3.7 重復(fù)性試驗(yàn) 為了檢驗(yàn)TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)方法的可重復(fù)性和穩(wěn)定性,本試驗(yàn)選取濃度為108、107、106、105、104copies/μL和103copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板,每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒設(shè)3個(gè)重復(fù)孔,進(jìn)行組內(nèi)重復(fù)試驗(yàn);同時(shí)每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒選取不同時(shí)間分別做3次獨(dú)立的重復(fù)性檢測(cè)作為組間重復(fù)性檢測(cè)。統(tǒng)計(jì)組內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)和組間重復(fù)性試驗(yàn)的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)(%),以此來(lái)評(píng)價(jià)該檢測(cè)方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

        1.3.8 PCV3熒光定量PCR方法臨床檢測(cè) 選取30份疑似PCV3感染的仔豬組織樣品用PCV3常規(guī)PCR檢測(cè)方法和本試驗(yàn)建立的TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)方法進(jìn)行同時(shí)檢測(cè),統(tǒng)計(jì)PCV3的陽(yáng)性樣品數(shù)量,比較2種檢測(cè)方法的敏感性。

        2 結(jié)果

        2.1 標(biāo)準(zhǔn)品的建立 將特異性引物經(jīng)PCR擴(kuò)增所獲得的約179 bp的目的條帶回收,連接pMD-18T載體后,轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109,平板培養(yǎng)后經(jīng)PCR挑取陽(yáng)性菌株,測(cè)序后與GenBank登錄的PCV3序列比對(duì),同源性為98%~100%,表明該序列確為PCV3序列。取陽(yáng)性菌株培養(yǎng)提取質(zhì)粒后,檢測(cè)其濃度并計(jì)算拷貝數(shù)為1.18×1011copies/μL。將質(zhì)粒作為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品,置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

        2.2 熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化 對(duì)熒光定量PCR的循環(huán)數(shù)、探針濃度、退火溫度、模板量進(jìn)行摸索得到以下最佳反應(yīng)體系(20 μL):TaqMan Fast qPCR Master Mix 10 μL,PCV3-FI 0.4 μL,PCV3-R1 0.4 μL PCV3-Pn 0.4 μL,ddH2O 7.8 μL,Template(DNA)1.0 μL。最佳反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性10 s,57 ℃退火15 s,72 ℃延伸30 s,45個(gè)循環(huán)。

        2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 將構(gòu)建好的質(zhì)粒進(jìn)行10倍系列稀釋,共6個(gè)點(diǎn),每個(gè)點(diǎn)做3次重復(fù),通過(guò)預(yù)試驗(yàn)選取合適標(biāo)準(zhǔn)品用于制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示:6個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)品均具有重復(fù)性和單一性。根據(jù)擴(kuò)增獲得的各梯度的Ct值,計(jì)算并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1),得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=-3.28X+41.605,斜率=-3.28,擴(kuò)增效率:E=10-1/斜率-1=10-1/-3.28-1=101.763%,相關(guān)系數(shù):R2=0.998,截距=41.605。

        圖1 PCV3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.1 PCV3 real-time fluorescence quantitative PCR standard curve

        2.4 敏感性試驗(yàn) 將標(biāo)準(zhǔn)品從1.18×109copies/μL開始10倍系列稀釋,稀釋到11.8 copies/μL,用已經(jīng)建立的熒光定量PCR檢測(cè)方法檢測(cè)仍然能夠檢出(圖2)。說(shuō)明該方法具有良好的敏感性。

        圖2 10倍系列稀釋樣品擴(kuò)增曲線Fig.2 Amplification curve of 10-fold serial dilution samples

        2.5 特異性試驗(yàn) 提取的PCV2、PRV的DNA以及PRRSV和CSFV的RNA(經(jīng)過(guò)反轉(zhuǎn)錄為cDNA),按照上述方法進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè),結(jié)果顯示,僅PCV的樣品可擴(kuò)增出1條標(biāo)準(zhǔn)的S型曲線(圖3),而其他4種病毒均不能擴(kuò)增出S型曲線,因此,確定PCV2、PRV、PRRSV和CSFV均為陰性,表明該方法特異性好。

        圖3 PCV3特異性曲線 Fig.3 PCV3 specific curve

        2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 經(jīng)過(guò)計(jì)算,組內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)差在0.07~0.24,變異系數(shù)在0.35~1.10(表2);組間重復(fù)性試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)差在0.12~0.34,變異系數(shù)在0.63~1.50(表3)。兩者變異系數(shù)均小于2%,試驗(yàn)結(jié)果顯示,該TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)方法具有極高的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。

        表2 組內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)Table 2 Intra group repeatability test

        表3 組間重復(fù)性試驗(yàn)Table 3 Inter group repeatability test

        2.7 臨床檢測(cè) 用PCV3常規(guī)PCR檢測(cè)方法和TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)方法對(duì)30份疑似PCV3感染的仔豬心臟、肝臟、肺臟、淋巴結(jié)、扁桃體等組織樣品進(jìn)行同時(shí)檢測(cè),結(jié)果表明:常規(guī)PCR檢測(cè)方法共檢出17份PCV3陽(yáng)性樣品,TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)方法檢出21份PCV3陽(yáng)性樣品,經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),其中4份樣品中PCV3的病毒含量低于常規(guī)PCR檢測(cè)方法檢測(cè)濃度下限,因此說(shuō)明TaqMan熒光定量PCR具有更高的靈敏性。

        3 討論

        2015年6月,美國(guó)堪薩斯州立大學(xué)Palinski等研究人員從北卡羅來(lái)納州的一個(gè)暴發(fā)皮炎和腎病綜合征(PDNS)的豬場(chǎng)中檢測(cè)到一種新型豬圓環(huán)病毒,并且通過(guò)宏基因組測(cè)序和遺傳進(jìn)化分析將其命名為圓環(huán)病毒3型[2]。隨后分別在韓國(guó)、巴西、意大利、泰國(guó)的患病豬只中檢測(cè)到PCV3[4,6-7,9]。2017年,Ku等首次對(duì)我國(guó)11個(gè)省市的PCV3流行情況進(jìn)行調(diào)查,結(jié)果顯示:農(nóng)場(chǎng)陽(yáng)性率為68.6%(24/35),樣本陽(yáng)性率為34.7%(77/222),PCV2和PCV3的混合感染率為15.8%(35/222)[10];2018年,趙宇等對(duì)河南地區(qū)的152份病料進(jìn)行檢測(cè),其中有46份病料為PCV2和PCV3混合感染,混合感染率為30.3%,還有一部分病料中檢測(cè)到了PRRSV、PEDV、PRV存在[11]。由此說(shuō)明目前PCV3在我國(guó)流行已經(jīng)呈常態(tài)化、復(fù)雜化且有逐年遞增的趨勢(shì),因此如何及時(shí)、準(zhǔn)確的檢測(cè)PCV3,成為預(yù)防和控制PCV3流行蔓延的關(guān)鍵。

        實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是近幾年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新的核酸定量檢測(cè)技術(shù),實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)PCR從定性到定量的飛躍。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程,最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法,這種方法不僅具有特異性強(qiáng),自動(dòng)化程度高,而且還能夠有效防止污染,準(zhǔn)確定量,實(shí)時(shí)監(jiān)控,目前臨床上多采用SYBR Green法檢測(cè)PCV3[12],但是由于染料能夠與任意DNA雙鏈結(jié)合發(fā)光,所以很容易與非特異性雙鏈DNA結(jié)合,產(chǎn)生假陽(yáng)性,導(dǎo)致特異性較差[8]。實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)主要分為SYBR Green法和TaqMan探針?lè)āS捎赟YBR Green法價(jià)格相對(duì)便宜并且實(shí)現(xiàn)了全閉管式操作,減少了假陽(yáng)性現(xiàn)象的出現(xiàn),同時(shí)探針技術(shù)的高特異性和光譜技術(shù)的高敏感性既克服了常規(guī)PCR技術(shù)只能實(shí)現(xiàn)定性檢測(cè)的不足,又解決了SYBR Green法特異性不強(qiáng)等缺點(diǎn),更加適應(yīng)臨床檢測(cè)[13-14]。

        本試驗(yàn)首次通過(guò)在PCV3 Cap蛋白上設(shè)計(jì)引物增強(qiáng)了檢測(cè)的準(zhǔn)確性,該檢測(cè)方法實(shí)現(xiàn)了全閉管式操作,減少了假陽(yáng)性現(xiàn)象的出現(xiàn),同時(shí)TaqMan探針技術(shù)的高特異性和光譜技術(shù)的高敏感性既克服了常規(guī)PCR技術(shù)只能實(shí)現(xiàn)定性檢測(cè)的不足,又解決了SYBR Green法特異性不強(qiáng)等缺點(diǎn),更加適應(yīng)臨床檢測(cè);該方法靈敏度高,特異性和重復(fù)性較好,最低檢測(cè)下限為11.8 copies/μL,經(jīng)與目前已發(fā)表的豬圓環(huán)病毒3型Real-time PCR等檢測(cè)方法進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn),該方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好等優(yōu)勢(shì),該方法的建立為PCV3的早期快速檢測(cè)及其流行病學(xué)調(diào)查,以及預(yù)防和控制我國(guó)PCV3的流行提供了快速、簡(jiǎn)便和可靠的技術(shù)工具。

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