張鶴平 ， 劉建釵 ， 許劍琴 ， 馬云飛 ， 劉利強(qiáng) ， 閆金坤 ， 劉彥威 ， 王九峰

(1.河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院 ， 河北 邯鄲 056021 ； 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 北京 海淀 100193)

腸毒素性大腸桿菌(EnterotoxigenicEscherichiacoli，ETEC)是引起斷奶仔豬腹瀉的重要病因之一。仔豬發(fā)生腹瀉后死亡率增加、增重下降，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[1-3]。使用抗生素治療是目前治療大腸桿菌腹瀉的主要手段。雖然抗生素對(duì)仔豬細(xì)菌性腹瀉有一定療效，但抗生素的使用會(huì)產(chǎn)生細(xì)菌耐藥、畜產(chǎn)品質(zhì)量安全等一系列問(wèn)題。中藥對(duì)致病性大腸桿菌有直接或間接殺滅作用，可調(diào)節(jié)動(dòng)物機(jī)體免疫力，具有療效可靠、毒副作用小、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)。中藥可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子、修復(fù)腸組織結(jié)構(gòu)、抗內(nèi)毒素(ET)等機(jī)制，起到調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、抗炎等作用[4-5]。白苦敗痢散由白頭翁、苦參、敗醬草、厚樸、葶藶子組成[6]。本試驗(yàn)建立仔豬大腸桿菌腹瀉模型，使用中藥白苦敗痢散治療，結(jié)合剖檢變化、組織病理切片，觀察臨床療效，為其臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 35日齡斷奶仔豬48頭(28日齡斷奶)，杜長(zhǎng)大三元雜交，購(gòu)自河北省邯鄲某豬場(chǎng)，仔豬健康，沒(méi)有接種過(guò)大腸桿菌菌苗。購(gòu)進(jìn)后常規(guī)飼養(yǎng) 1周，觀察仔豬無(wú)異常情況后再進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)藥物 白苦敗痢散，批號(hào)：20160301；規(guī)格0.5 g/g，每1 g散劑中含0.5 g生藥；推薦使用劑量2 g/(kg·bw)。拌料用。中試廠家：北京中農(nóng)勁騰生物技術(shù)股份有限公司。恩諾沙星溶液：含量5%，規(guī)格2 mL/支。每頭仔豬口服2 mL，1 次/d，深圳華泰動(dòng)物藥業(yè)有限公司。

1.3 菌株 豬源腸毒素性大腸桿菌(ETEC)，編號(hào):CVCC225，血清型O149：K91，K88 ac，該菌分離自腹瀉新生仔豬小腸黏膜。由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)臨床獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.4 主要試劑 4%多聚甲醛，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；甲醛、無(wú)水乙醇、95%乙醇、二甲苯，均購(gòu)自中國(guó)國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.5 大腸桿菌菌液的制備 將復(fù)壯過(guò)的大腸桿菌接種于肉湯培養(yǎng)基，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，涂板法細(xì)菌計(jì)數(shù)。無(wú)菌吸取0.1 mL菌液至滅菌試管，加0.9 mL滅菌生理鹽水，做10倍倍比稀釋。分別取10-5、10-6、10-7、10-8稀釋梯度的菌液100 μL，涂布于無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h，計(jì)數(shù)。根據(jù)菌落計(jì)數(shù)結(jié)果，配成菌液濃度3×109CFU/mL的菌懸液(4 ℃?zhèn)溆?。

1.6 動(dòng)物分組及處理

1.6.1 攻毒、試驗(yàn)分組 將48頭35日齡斷奶仔豬，飼養(yǎng)觀察1周，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、感染對(duì)照組、白苦敗痢散高劑量組、白苦敗痢散中劑量組、白苦敗痢散低劑量組和藥物對(duì)照組，每組8頭。飼養(yǎng)觀察結(jié)束后，除空白對(duì)照組外，其他仔豬灌服3×109CFU/mL菌液(根據(jù)預(yù)試驗(yàn)確定每頭仔豬50 mL)，1次/d，連續(xù)灌服3 d，攻菌造模。造模后，空白對(duì)照組、感染對(duì)照組仔豬灌服50 mL生理鹽水；白苦敗痢散高、中、低劑量組分別按4、2 g/(kg·bw)和1 g/(kg·bw)劑量，用生理鹽水稀釋成50 mL藥液灌服，藥物對(duì)照組灌服恩諾沙星，2 mL/頭，1次/d，連用5 d。仔豬按分組隔離飼養(yǎng)，處理期間仔豬正常飼喂，自由采食，自由飲水。每天07:00～08:00、19:00～20:00觀察記錄仔豬精神、被毛、采食、腹瀉及死亡狀況。

1.6.2 生產(chǎn)性能測(cè)定 仔豬攻毒3 d后，分別在試驗(yàn)前、試驗(yàn)結(jié)束后空腹稱重，并記錄各組仔豬采食量，計(jì)算日增重。

平均日采食量=(配料總量-剩料量)/(試驗(yàn)天數(shù)×每組試驗(yàn)豬數(shù))

平均日增重=(試驗(yàn)?zāi)┢骄w重-初期平均體重)/試驗(yàn)天數(shù)

1.6.3 動(dòng)物處理及樣品采集 試驗(yàn)結(jié)束后，各組仔豬頸靜脈采血，抗凝血采集2 mL，用于血液常規(guī)分析，采血后頸部放血處死。打開(kāi)腹腔，觀察腹腔臟器病理變化。采集空白對(duì)照組、感染對(duì)照組、白苦敗痢散高、中、低劑量組及藥物對(duì)照組仔豬空腸、回腸組織中段1.5 cm，分別標(biāo)記并保存于4%多聚甲醛固定，用于H.E.染色，以觀察腸道組織學(xué)病理變化。

1.6.4 療效判定 試驗(yàn)結(jié)束后對(duì)腹瀉癥狀消失的仔豬，無(wú)菌采集糞便檢測(cè)攻毒菌清除情況。根據(jù)所觀察臨床表現(xiàn)，按下述標(biāo)準(zhǔn)判斷療效。

治愈：治療后腹瀉癥狀消失、肛門(mén)周圍無(wú)污物。無(wú)菌取仔豬腸道糞便進(jìn)行分離、培養(yǎng)，分離不到致病性大腸桿菌。治愈率=治愈數(shù)/每組仔豬總數(shù)×100%。

有效：治療后臨床癥狀得到部分緩解或完全恢復(fù)，腹瀉次數(shù)減少或正常，糞便變稠或正常，精神狀態(tài)、食欲有明顯好轉(zhuǎn)或正常。有效率=有效數(shù)/每組仔豬總數(shù)×100%。

無(wú)效：治療后臨床癥狀無(wú)明顯改善，仔豬腹瀉未得到改善，甚至出現(xiàn)死亡。

1.7 數(shù)據(jù)分析 統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 白苦敗痢散治療腹瀉仔豬的療效

2.1.1 臨床療效 從腹瀉癥狀停止的仔豬糞便中未分離到致病性大腸桿菌，統(tǒng)計(jì)為治愈仔豬。白苦敗痢散治療仔豬大腸桿菌性腹瀉的臨床療效結(jié)果見(jiàn)表1。白苦敗痢散高、中、低劑量組的治愈率分別為62.5%、62.5%和37.5%，有效率分別為87.5%、75.0%和62.5%。藥物對(duì)照組治愈率為75.0%，有效率為87.5%。

表1 白苦敗痢散治療仔豬腹瀉的臨床療效Table 1 Clinical effect of Baikubailisan on diarrhea piglets (頭，%)

2.1.2 白苦敗痢散對(duì)腹瀉仔豬生產(chǎn)性能的影響 結(jié)果見(jiàn)表2。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，感染對(duì)照組仔豬日增重低于空白對(duì)照組，差異顯著(P<0.05)；白苦敗痢散高、中劑量組仔豬日增重高于感染對(duì)照組，差異顯著(P<0.05)；白苦敗痢散高、中劑量組仔豬日增重與藥物對(duì)照組相比，差異不顯著(P>0.05)。

表2 白苦敗痢散對(duì)腹瀉仔豬生產(chǎn)性能的影響Table 2 Effect of Baikubailisan on growth performance of diarrhea piglets (kg)

2.2 血液學(xué)指標(biāo)變化 結(jié)果見(jiàn)表3。給藥5 d后，紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC)各組差異不顯著(P>0.05)。白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)感染對(duì)照組高于空白對(duì)照組，差異顯著(P<0.05); 白苦敗痢散低劑量組低于空白對(duì)照組，差異顯著(P<0.05)；白苦敗痢散中、高劑量組低于感染對(duì)照組，差異極顯著(P<0.01)。中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)(Gran)感染對(duì)照組高于空白對(duì)照組，差異顯著(P<0.05)；白苦敗痢散低劑量組低于感染對(duì)照組，差異顯著(P<0.05)；白苦敗痢散中、高劑量組低于感染對(duì)照組，差異極顯著(P<0.01)。

表3 白苦敗痢散對(duì)仔豬大腸桿菌腹瀉血液學(xué)指標(biāo)的影響Table 3 Effect of Baikubailisan on haematological indexes of Escherichia coli diarrhea piglets

2.3 剖檢變化、腸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察

2.3.1 剖檢變化 空白對(duì)照組仔豬十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸無(wú)明顯病理變化(圖1)。感染對(duì)照組空腸、回腸充血，腫脹，腸系膜充血。白苦敗痢散中、高劑量組和藥物對(duì)照組仔豬空腸、回腸恢復(fù)正常，無(wú)充血、腫脹。

圖1 仔豬剖檢變化Fig.1 Changes of piglets in autopsyA: 感染對(duì)照組； B: 白苦敗痢散中劑量組； C: 藥物對(duì)照組A: Infected control group; B: Baikubailisan medium-dose group; C: Drug control group

2.3.2 腸組織形態(tài)學(xué)觀察 空白對(duì)照組空腸黏膜結(jié)構(gòu)基本正常(圖2)，黏膜上皮形態(tài)正常，柱狀細(xì)胞排列整齊。感染對(duì)照組仔豬空腸可見(jiàn)絨毛部分脫落，散落在腸腔中，黏膜上皮受損，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。白苦敗痢散高、中劑量組、藥物對(duì)照組治愈的仔豬空腸黏膜層結(jié)構(gòu)趨于完整。

圖2 空腸組織結(jié)構(gòu)變化(H.E.染色，200×)Fig.2 Structural changes of jejunum (H.E.staining,200×)A： 空白對(duì)照組； B： 感染對(duì)照組； C： 白苦敗痢散中劑量組； D： 藥物對(duì)照組箭頭: 腸黏膜脫落，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)A: Blank control group; B: Infected control group; C: Baikubailisan medium-dose group; D: Drug control group Arrow: Intestinal mucosa shedding and inflammatory cells infiltrating

空白對(duì)照組仔豬回腸結(jié)構(gòu)組織完整(圖3)，絨毛整齊，輪廓清晰；感染對(duì)照組回腸黏膜層受損嚴(yán)重，黏膜大面積脫落，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；白苦敗痢散高、中劑量組和藥物對(duì)照組治愈的仔豬回腸黏膜層結(jié)構(gòu)趨于完整。

圖3 回腸組織結(jié)構(gòu)變化(H.E.染色, 200×)Fig.3 Changes of tissue structure of ileum in piglets(H.E.staining, 200×)A： 空白對(duì)照組； B： 感染對(duì)照組； C： 白苦敗痢散中劑量組； D： 藥物對(duì)照組箭頭： 上皮黏膜脫落A: Blank control group; B: Infected control group; C: Baikubailisan medium-dose group; D: Drug control group Arrow: The epithelial mucosa was exfoliated

3 討論

動(dòng)物腹瀉模型是研究動(dòng)物腹瀉發(fā)生機(jī)制、中獸藥治療動(dòng)物腹瀉療效及其機(jī)理的常見(jiàn)方法。張賽奇用3×109CFU/mL大腸桿菌液5 mL/(10kg·bw)灌服21日齡斷奶仔豬，連續(xù)灌服菌液3 d，建造了仔豬腹瀉模型[7]。本試驗(yàn)按照預(yù)試驗(yàn)確定的攻菌劑量用3×109CFU/mL菌液50 mL連續(xù)給仔豬灌服3 d，成功建立了仔豬大腸桿菌性腹瀉模型。

ETEC導(dǎo)致仔豬腹瀉是通過(guò)在小腸定植以及產(chǎn)生腸毒素而發(fā)生的[8]。ETEC黏附于上皮細(xì)胞的刷狀緣，破壞細(xì)胞連接，導(dǎo)致腸道炎癥和腹瀉[1]。本試驗(yàn)中感染對(duì)照組仔豬空腸、回腸黏膜充血，水腫，說(shuō)明ETEC引起了斷奶仔豬小腸炎癥反應(yīng)。白苦敗痢散治療后仔豬空腸、回腸黏膜結(jié)構(gòu)趨于完整，說(shuō)明白苦敗痢散有助于腹瀉仔豬小腸組織結(jié)構(gòu)的恢復(fù)，起到治療仔豬腹瀉的作用。

白細(xì)胞總數(shù)通常用于評(píng)估嚴(yán)重細(xì)菌感染的風(fēng)險(xiǎn)，白細(xì)胞數(shù)量的增加表明存在系統(tǒng)性炎癥[9]。細(xì)菌感染后，中性粒細(xì)胞通過(guò)增加骨髓干細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力、增加炎性產(chǎn)物的生成等，應(yīng)對(duì)細(xì)菌感染，以清除侵入機(jī)體的細(xì)菌[10]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，給藥5 d后，攻毒后腹瀉仔豬與空白對(duì)照組相比，白細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞百分比差異顯著，說(shuō)明斷奶仔豬受到病菌感染發(fā)生炎癥；白苦敗痢散高、中、低劑量組仔豬與空白對(duì)照組相比，紅細(xì)胞數(shù)、白細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞百分比差異不顯著，各血液學(xué)指標(biāo)恢復(fù)正常，說(shuō)明仔豬腹瀉癥狀停止或減輕，炎癥消失或減輕、機(jī)體脫水狀況得到改善。

4 結(jié)論

中、高劑量白苦敗痢散治療仔豬大腸桿菌性腹瀉的有效率分別為75.0%和87.5%。白苦敗痢散治療后，仔豬的生產(chǎn)性能得到明顯改善。