吳 迪，安增選，樊天誼，朱 炎

(1. 復旦大學 生命科學學院 植物科學研究所，上海 200438； 2. 復旦大學 遺傳工程國家重點實驗室，上海 200438)

肌動蛋白相關蛋白(Actin-Related Proteins, ARPs)在蛋白一級結構序列上與傳統(tǒng)的肌動蛋白(Actin)有17%～60%的同源性,存在于所有的真核生物中，是一大類高度保守的蛋白家族[1].ARPs和Actin都具有肌動蛋白折疊(Actin-fold)的核苷酸結合口袋.根據(jù)與Actin序列的相似性，ARPs被進而分成多個亞家族.以酵母為例，與Actin相似性最高的命名為ARP1，ARP10的相似性最低[2].不同亞家族的ARPs具有結構和功能上的多樣性，并且有不同的亞細胞定位.酵母和其他物種中同源的ARP1～ARP3以及ARP10定位在細胞質中，而ARP4～ARP9則定位在細胞核中[3]，并且與Actin一起在許多染色質重塑復合物和組蛋白乙酰轉移酶復合物中被發(fā)現(xiàn)[4].

ARP5是酵母和人類INO80復合物中特有的亞基，在INO80染色質重塑功能上發(fā)揮著重要的功能.當發(fā)生DNA雙鏈斷裂(DSB)時，人類ARP5同源基因突變的細胞株系呈現(xiàn)細胞增長緩慢和組蛋白γ-H2A.X磷酸化累積受損的表型.酵母ARP5對于INO80染色質重塑因子富集到DSB位點啟動同源重組修復，以及DSB修復完成后被停滯的復制叉重新啟動等過程起到不可或缺的作用[5].擬南芥ARP5定位在細胞核中，ARP5的功能缺失突變體相對于野生型植物對基因毒試劑的處理更為敏感[6].

ARP6是所有已知SWR1復合物中特有的亞基，通常認為ARP6與另一亞基Swc6形成保守模塊，調控與組蛋白變異體H2A.Z的相互作用[7].含有ARP6在內的SWR1染色質重塑復合物參與組蛋白變異體H2A.Z摻入染色質，調控基因轉錄、異染色質形成與維持、染色質穩(wěn)定性以及DNA損傷修復等過程.擬南芥ARP6同源基因在植物各個器官中都有表達.arp6功能缺失突變體呈現(xiàn)多種發(fā)育上的表型，長短日照下都呈現(xiàn)早花的表型，植株整體呈現(xiàn)矮小叢生的表型[8].

我們之前的工作報道了擬南芥染色質重塑因子AtINO80和AtARP5形成蛋白復合物[9].由于AtINO80和PIE1功能缺失突變體雜交形成的雙突變體植物致死，而AtINO80和AtARP6功能缺失突變體雜交形成的雙突變體植物在植物生長和育性上也有著非常明顯的缺陷，不適合后續(xù)的遺傳分析.因此，我們構建了AtARP5和AtARP6功能缺失突變體的雙突變體植物atarp5-2atarp6-1.我們在之前的研究中報道了AtARP5和AtARP6共同參與維持植物基因組的穩(wěn)定[9].然而，兩者在植物生長發(fā)育中的功能互作并沒有完全揭示.這里，我們發(fā)現(xiàn)，兩個ARP蛋白共同參與了植物細胞大小以及植物細胞核倍性的調控.轉錄水平分析顯示，特定細胞周期相關基因在雙突變體植物atarp5-2atarp6-1中被協(xié)同上調.我們證實了兩個ARP蛋白共同結合DNA解旋酶RVB1，暗示了兩者可能存在的分子層面的協(xié)同機制.

1 材料與方法

1.1 材料

擬南芥Arabidopsisthaliana野生型WT為Col-0種子；突變體材料為：atarp5-2(GK_386F02)；atarp6-1(Garlic_599_G03)；雙突變體atarp5-2atarp6-1通過雜交分離獲得[9].大腸桿菌菌株：E.coliTOP10(用于克隆構建)；E.coliRosetta DE3(用于原核表達蛋白).農(nóng)桿菌菌株：A.tumefaciensGV3101(用于BiFC實驗中的植物轉化).克隆構建載體： pET-28a(用于構建His-tag融合蛋白)，pGEX-4T-1(用于構建GST-tag融合蛋白)，pXY-105/pXY-106(用于BiFC實驗).RNA抽提試劑TRIzol(Ambion公司)，反轉錄試劑盒(Promega公司)，克隆用DNA限制性內切酶、T4DNA連接酶、pMD19-T載體等(TaKaRa公司)，高保真KOD酶(Toyobo公司)，質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒等(Axygen公司).

1.2 方法

1.2.1 微分干涉相差顯微鏡觀測植物細胞

葉片透明液： 8 g水合氯醛，1 mL甘油，2 mL水，充分混勻溶解.取植物葉片浸沒于葉片透明液中，在65 ℃孵育1～3 h，直至葉片呈透明.將透明處理后的葉片置于載玻片上，通過微分干涉相差顯微鏡(Zeiss Imager.A2)下觀察并拍照.照片用Image J進行細胞大小的分析，相應數(shù)據(jù)導入Excel中進行分析.

1.2.2 流式細胞分析

收取萌發(fā)后25 d的擬南芥相應葉片，用刀片切碎釋放細胞核.過濾后離心.重懸至溶液(1×MgSO4buffer、6.5 mmol/L DTT、0.1 mg/mL Propidium iodide、1 μg/mL RNase)中，37 ℃放置15 min.上流式細胞儀(BD Calibur)分析.

1.2.3 轉錄水平分析

收取12 d大小的植物幼苗作為材料，抽提RNA.使用Ambion公司的TRIzol試劑抽提RNA，并用Promega公司的反轉錄試劑盒進行反轉錄.檢測引物的序列參考文獻[10].

1.2.4 原核蛋白表達以及Pull-down實驗

通過反轉錄和高保真酶，從野生型擬南芥幼苗中獲取RVB1,AtARP5和AtARP6的全長cDNA.測序后，將相應CDS克隆至pET-28a和pGEX-4T-1中，獲得His-RVB1和GST-AtARP5、GST-AtARP6的表達克隆.后通過誘導表達，利用鎳柱和GSH親和柱純化.Pull-down實驗，先將純化好的GST-AtARP5、GST-AtARP6以及GST-NRP1(用于負對照實驗)偶聯(lián)到GSH親和柱，充分洗脫后，將His-RVB1與相應親和柱混勻，再用1×PBS溶液充分洗脫.最后加1×SDS loading buffer煮beads溶解，走SDS-PAGE膠上樣.

1.2.5 雙分子熒光互補實驗(Bimolecular Fluorescent Complimentary, BiFC)

種植一個月左右的煙草，待其長出4～10片幼嫩葉片時即可使用.pXY105載體用于構建cYFP在N端的融合蛋白；pXY106載體用于構建nYFP在N端的融合蛋白.轉化至農(nóng)桿菌A.tumefaciensGV3101后，挑選單克隆.轉化后的農(nóng)桿菌過夜培養(yǎng)后，用BiFC重懸液(10 mmol/L MgCl2，100 μmol/L乙酰丁香酮，1 mmol/L MES-KOH，pH 5.6)至合適OD600濃度(0.5左右)，用注射器推射至煙草幼嫩葉片的背面，直至整個煙草葉片浸濕，避光培養(yǎng)2 d后，用激光共聚焦顯微鏡觀察并拍攝.

2 結 果

2.1 AtARP5和AtARP6同時功能缺失導致植物葉片細胞面積減小

我們在之前的工作中報道了atarp5-2atarp6-1雙突變體的植物在幼苗時期的表型.相對于野生型WT和各自的單突變體，雙突變體的植物幼苗葉片面積變小，真葉葉片上卷.我們繼續(xù)在土壤中培養(yǎng)植物，發(fā)現(xiàn)這樣的生長抑制一直出現(xiàn)在植物的整個營養(yǎng)生長階段(圖1(a)).由于植物葉片面積減小，我們想觀測是否葉肉細胞面積同樣減小.我們對萌發(fā)后25 d擬南芥的第一對真葉進行了透明液處理，并利用微分干涉相差顯微鏡(DIC)進行了觀察(圖1(b))，用Image J軟件對拍攝的葉肉柵欄細胞面積進行了定量統(tǒng)計.與野生型(～2 460 μm2)相比，atarp5-2柵欄細胞的平均面積(～2 226 μm2)降低程度并不大，而atarp6-1(～1 822 μm2)的降低程度較為明顯.但atarp5-2atarp6-1雙突變體(～1 259 μm2)則有著顯著性的下降程度(圖1(c)).我們對采集的數(shù)據(jù)進行了頻率分析.所有植物的葉肉柵欄細胞面積都呈現(xiàn)較為標準的正態(tài)分布曲線(圖1(d)).橫坐標代表細胞面積的對數(shù)值.結果顯示，atarp5-2atarp6-1雙突變體的峰值明顯向左偏移，再一次表明雙突變體的細胞大小受到了明顯的抑制.根據(jù)葉片的大小與葉肉柵欄細胞的平均面積可以簡單地估算葉片內細胞的數(shù)量.相對于野生型植物(定為100%)，atarp5-2和atarp6-1柵欄細胞的數(shù)量略微降低(～92.9%±3.3%和～88.9%±2.4%)，但atarp5-2atarp6-1雙突變體則有著顯著性的下降程度(～74.8%±1.8%).我們的結果表明AtARP5和AtARP6在控制植物葉片面積、以及細胞大小和數(shù)量上都有著協(xié)同的調控作用.

圖1 AtARP5和AtARP6功能同時缺失導致植物葉片細胞面積減小Fig.1 The simultaneous loss-of-function in AtARP5 and AtARP6 results in the decrease of leaf cell area(a) 萌發(fā)后25 d的擬南芥表型；(b) 萌發(fā)后25 d的擬南芥葉片的DIC照片，Bar=100 μm；(c) 利用Image J對葉片柵欄細胞面積進行統(tǒng)計(每種植物統(tǒng)計>200個細胞)，圖中顯示了不同植物的細胞面積的平均值和方差.單位是100 μm2；(d) 橫坐標表示細胞面積的對數(shù)值，縱坐標表示不同面積的細胞出現(xiàn)的頻率.

2.2 atarp5-2 atarp6-1雙突變體內植物細胞的倍性下降

接下來，我們通過流式細胞儀檢測了萌發(fā)后35 d擬南芥蓮座葉的葉細胞核倍性(η).第1對真葉的數(shù)據(jù)顯示，野生型植物的葉片已經(jīng)出現(xiàn)了32C的細胞，而16C的細胞的比例占比最大.這樣的分布比例在單突變體atarp5-2和atarp6-1都沒有發(fā)生明顯的改變，但atarp5-2atarp6-1雙突變體則檢測不到32C細胞，表明雙突變體內的細胞內復制現(xiàn)象以及細胞倍性發(fā)生了改變(圖2(a)).我們通過公式I內復制=(0×η2C)+(1×η4C)+(2×η8C)+(3×η16C)+(4×η32C)計算了相應的內復制指數(shù)(I內復制).atarp5-2atarp6-1雙突變體的I內復制只有1.472 3，明顯低于野生型(2.223 7)和各自的單突變體atarp5-2(2.070 7)和atarp6-1(2.013 3).表明AtARP5和AtARP6在維持和控制葉片細胞內復制進程中有著明顯的協(xié)同作用.

圖2 葉細胞核倍性的比較Fig.2 Comparison of nuclear ploidy levels of leaf cells(a) 第一對真葉的核倍性比較；(b) 第三對真葉的核倍性比較.

我們同樣檢測了第3對真葉，相應的結果與第1對真葉的結果類似(圖2(b)).表明兩個ARP蛋白的功能互作在植物的營養(yǎng)器官發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用.

2.3 atarp5-2 atarp6-1雙突變體細胞周期相關基因的轉錄水平

由于雙突變體呈現(xiàn)了葉肉細胞面積減小以及細胞核倍性降低的表型，我們推測這可能由于細胞復制進程出現(xiàn)缺陷.接下來，我們檢驗了萌發(fā)后12 d不同擬南芥背景下細胞周期的標志性基因：CYCD3;3(G1期)，組蛋白基因H3.1(S期)，CYCB1;1(G2-M期)，CYCA2;1(G2期).我們發(fā)現(xiàn)，相對于野生型，單突變體的各個標志性基因的轉錄水平并沒有明顯的改變，但在雙突變體背景下，S期的H3.1基因和G2-M期的CYCB1;1基因的轉錄水平有著顯著性的上調(圖3).隨后，我們細致地分析了DNA復制過程中的一些關鍵基因的轉錄水平，包括滑動鉗位因子基因PCNA(ProliferatingCellularNuclearAntigen1)，復制起始因子基因CDT1A(ChromatinlicensingandDNAreplicationfactor1A)、CDT1B、CDC6A(CellDivisionControl6A)、CDC6B，復制起始識別復合體的亞基基因ORC1a(OriginofReplicationComplex1a)、ORC1b、ORC3、ORC6，微小染色體維持蛋白基因MCM3、MCM4、MCM7[10-11].結果顯示，在雙突變體背景下，與DNA復制起始相關的CDT1B、ORC1a和ORC1b的轉錄水平顯著上調，暗示AtARP5和AtARP6同時缺失可能導致細胞DNA復制的起始出現(xiàn)異常.

圖3 細胞周期和DNA復制基因表達水平的定量RT-PCR分析Fig.3 Quantitative RT-PCR analysis of the expression levels of cell cycle and DNA replication genesFC(Fold change)>1.5，同時P<0.05的基因被標注成顯著性差異(*).

2.4 AtARP5和AtARP6共同結合DNA解旋酶RVB1

由于AtARP5和AtARP6分別是擬南芥INO80和SWR1染色質重塑復合物中的特異性亞基.因此兩者之間的功能互作可以理解為兩個重塑復合物活性之間的互作.但目前，聯(lián)系兩個重塑復合物的分子機制并沒有被很好地建立起來.我們之前的工作顯示，AtARP5親和層析中親和蛋白的質譜結果包含了DNA解旋酶RVB1.該蛋白在進化中保守，在酵母中同時結合INO80和SWR1蛋白.酵母RVB1在體外具有DNA解旋酶活性并且可以結合復制叉[12].在擬南芥中，RVB1是致死基因，其功能缺失突變體無法獲得，通過RNAi技術構建得到的弱突變體也出現(xiàn)了分生組織的生長問題[13].

由于實驗結果顯示atarp5-2atarp6-1雙突變體出現(xiàn)了DNA復制進程的問題，因此我們推測ARP5和ARP6可能與RVB1存在著功能以及分子上的關聯(lián).因此，我們試圖通過蛋白質層面的研究建立起相應的聯(lián)系.我們構建了His-tag在N端融合的RVB1(表征分子量約為60 kDa)，以及GST-tag在N端融合的ARP5(表征分子量約為106 kDa)和ARP6(表征分子量約為70 kDa).NRP1是植物中的組蛋白分子伴侶，對于H2A-H2B有著較高的親和力.我們同樣構建了GST-tag在N端融合的NRP1(表征分子量約為55 kDa，但因為NRP1蛋白偏酸性，實際條帶在電泳中超過70 kDa)，作為蛋白互作中的負對照.我們利用這些蛋白在體外進行了Pull-down實驗.Pull-down結果顯示，His-RVB1并不能結合GST-NRP1，但能與GST-AtARP5以及GST-AtARP6結合(圖4(a)).我們進而利用BiFC驗證相應的蛋白互作.將YFP的N端(Yn)融合到RVB1，將YFP的C端(Yc)融合到NRP1、AtARP5和AtARP6蛋白，注射到煙草葉片后，在煙草細胞中觀測到Yn-AtRVB1/Yc-AtARP5和Yn-AtRVB1/Yc-AtARP6的組合都能產(chǎn)生熒光信號，但Yn-AtRVB1/Yc-NRP1并沒有觀測到熒光信號(圖4(b))，表明RVB1可以分別與AtARP5和AtARP6蛋白結合.

圖4 RVB1可以分別結合AtARP5和AtARP6Fig.4 RVB1 can interact with AtARP5 and AtARP6, respectively (a) Pull-down實驗.GST-fusion proteins(GST-NRP1,GST-AtARP5和GST-AtARP6)分別固定在GSH親和柱上，His-RVB1作為樣品分別上樣，充分洗脫后，beads用SDS-PAGE上樣液煮樣，利用SDS-PAGE檢測.被GST-AtARP5和GST-AtARP6捕獲的His-RVB1用黃色箭頭標注；(b) BiFC實驗.Bar=100 μm.

3 討 論

真核生物的基因組DNA是以染色質的形式存在，因而染色質的動態(tài)調控影響了所有以基因組DNA為模板的生理活動，如DNA復制、基因組內復制、細胞增殖等過程.染色質重塑因子利用ATP水解能量主動調控染色質結構，探索不同染色質重塑因子之間的功能互作，有助于理解真核生物調控染色質結構的分子機制.在進化中，INO80和SWR1同屬于一個染色質重塑因子家族，它們通過結合多個亞基，成為重要的染色質重塑復合物.

SWR1蛋白復合物調控組蛋白變異體H2A.Z摻入染色質以及在染色質的分布，對基因轉錄有著復雜的調控作用.INO80蛋白復合物在基因轉錄調控、DNA損傷修復和基因組穩(wěn)定性上起著重要的表觀遺傳調控作用.我們之前在研究擬南芥AtINO80以及SWR1染色質重塑復合物的過程中，發(fā)現(xiàn)AtINO80與擬南芥SWR1同源基因PIE1的互作對于植物的生長有著極為重要的作用，兩者的同時缺失導致植物致死.而AtINO80與AtARP6的遺傳互作表明，盡管可以拿到雙突變體，但植物胚胎高比例地死亡，即便少量存活后成長為植物，也出現(xiàn)發(fā)育極為不良的現(xiàn)象，育性極度下降[9].這些表型的觀測表明，擬南芥INO80和SWR1染色質重塑復合物在細胞增殖和植物生長中發(fā)揮著至關重要的協(xié)同作用.

在本研究工作中，我們利用作為INO80復合物和SWR1復合物中特有的成員AtARP5和AtARP6做了遺傳分析.我們的結果顯示，atarp5-2atarp6-1雙突變體最明顯的表型是葉片面積減少，對其葉肉柵欄組織細胞大小統(tǒng)計后發(fā)現(xiàn)，atarp5-2，atarp6-1和atarp5-2atarp6-1葉肉柵欄細胞面積依次減小.通過RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，雙突變背景下細胞周期及DNA復制相關基因H3.1、CDT1B、ORC1a和ORC1b以及關卡基因CYCB1;1的轉錄水平上調.在表型和細胞層面的分析中，我們觀測到雙突變體在細胞增殖以及細胞倍性上相對于野生型和各自的單突變體都受到了影響，我們推測AtARP5和AtARP6在DNA復制以及細胞周期相關基因的轉錄調控等方面發(fā)揮了協(xié)同的作用.盡管目前肌動蛋白相關蛋白在不同染色質重塑復合物中的具體分子活性尚不清楚，但我們的細胞和分子實驗的結果顯示，兩個復合物核心組分AtINO80和PIE1充分發(fā)揮其重塑活性，分別需要依賴AtARP5和AtARP6的參與.

我們利用體外Pull-down實驗和體內BiFC實驗，驗證了DNA解旋酶可以分別結合AtARP5和AtARP6.由于RVB1在體外具有解旋酶活性和結合復制叉的能力[12]，同時由于RVB1是致死基因，其弱突變體表型相似于atino80atarp6-1觀測到的表型，因此，我們猜測AtARP5和AtARP6可以通過RVB1的活性輸出發(fā)揮調控作用.S期的進程有賴于復制叉的不斷延伸，細胞需要持續(xù)地通過打開原有染色質結構才能釋放出DNA母鏈用于后續(xù)的半保留復制，因而DNA解旋酶的活性需要有效地偶聯(lián)到能重塑染色質結構的蛋白復合物，才能有效地推動S期的進程.目前，我們還不能解釋兩個復合物如何在復制叉穩(wěn)定性和延伸性上協(xié)同工作，此外RVB1的活性調控機制由于其基因突變致死從而在遺傳上沒有深入下去.未來我們可以通過構建篩選GFP融合的RVB1轉基因植物，進一步開展ARP5、ARP6和RVB1在體內的分子關聯(lián)研究，同時利用RNAi技術構建RVB1的弱突變體，深入研究擬南芥INO80和SWR1蛋白復合物在植物細胞增殖中的功能關聯(lián).