劉 展,朱順海,趙其平,黃 兵,韓紅玉,黃文浩,2,姚亞文,董 輝

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200241;2.上海師范大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,上海 200234)

球蟲病是雞場(chǎng)中最普遍、造成損失最嚴(yán)重的疾病之一[1].它會(huì)損傷雞腸道上皮細(xì)胞,阻礙營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收,減少肉和蛋的生產(chǎn),全世界每年因球蟲病造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)20億美元[2].球蟲必須依靠宿主細(xì)胞來(lái)完成其生命周期,在球蟲感染的過(guò)程中,球蟲子孢子入侵宿主細(xì)胞是球蟲成功建立感染的關(guān)鍵階段[3].阻斷子孢子的入侵是防治球蟲病的一種有效方法.因此,鑒定與球蟲入侵宿主細(xì)胞相關(guān)的關(guān)鍵分子,對(duì)闡明球蟲入侵、感染的分子機(jī)制,有效地控制球蟲病具有積極的意義[4].

目前,對(duì)球蟲入侵宿主細(xì)胞機(jī)制的研究主要集中在蟲體蛋白上,而鮮有宿主蛋白的報(bào)道.但越來(lái)越多的研究表明,球蟲感染是一個(gè)復(fù)雜的、與宿主相互作用的過(guò)程.用酶、陽(yáng)離子復(fù)合物、蛋白酶抑制劑、寄生蟲蛋白抗體等外源化合物處理細(xì)胞后,可明顯改變子孢子入侵細(xì)胞的能力,說(shuō)明宿主蛋白在球蟲感染過(guò)程中扮演著重要角色[5].柔嫩艾美耳球蟲的入侵會(huì)引起宿主細(xì)胞F-actin的聚集,用細(xì)胞松弛素D處理細(xì)胞后,F-actin聚集不明顯,且球蟲的入侵率降低[6].激活細(xì)胞F-actin聚集重排的最重要受體—Integrin(整合素)抗體孵育細(xì)胞后,子孢子入侵率下降20%～80%,Integrin過(guò)表達(dá)后子孢子入侵率增加30%,缺失后入侵率下降90%,說(shuō)明Integrin介導(dǎo)的宿主細(xì)胞F-actin聚集在雞球蟲入侵過(guò)程中起著重要的作用[7].宿主脂肪酸結(jié)合蛋白4(fatty acid binding protein 4)過(guò)表達(dá)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)抗體均可明顯抑制球蟲子孢子的入侵[8-9],活化蛋白激酶C受體1(Receptor for Activated C Kinase 1, RACK1)抗體可促進(jìn)球蟲子孢子的入侵[3].這些研究都提示我們,宿主蛋白在球蟲入侵過(guò)程中發(fā)揮重要作用.

Ras相關(guān)的C3肉毒素底物1(Rac1)是Rho家族最具特征的一種小分子GTP酶,在肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重組和膜皺褶的形成中發(fā)揮重要作用[10].有研究顯示,Rac1廣泛參與細(xì)菌、病毒和寄生蟲入侵宿主細(xì)胞和胞內(nèi)發(fā)育的多個(gè)環(huán)節(jié)[11-13].因此,本研究對(duì)雞Rac1基因進(jìn)行了克隆和原核表達(dá),并通過(guò)體外入侵試驗(yàn),研究了該蛋白在柔嫩艾美耳球蟲子孢子入侵過(guò)程中的作用.

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、質(zhì)粒、蟲株和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雞胚成纖維細(xì)胞(DF-1)、原核表達(dá)載體pGEX-4T-1、柔嫩艾美耳球蟲上海株(資源編號(hào): CAAS21111611)由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所動(dòng)物原蟲病創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)保存.三黃雞購(gòu)于上海阜稷生物科技有限公司,在無(wú)球蟲的環(huán)境中飼養(yǎng),日糧及飲水中不添加任何抗球蟲藥物.8周齡新西蘭大白兔購(gòu)于上海甲干生物科技有限公司.

1.2 試劑

2×PCR Master Mix、E.coliTop10、E.coliBL21(DE3)、DNA Marker(DL2 000)購(gòu)于上海天根生物科技有限公司;瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒購(gòu)于德國(guó)QIAGEN公司;限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、XhoⅠ、T4DNA連接酶、MiniBEST Universal RNA Extraction Kit、One Step TB Green?PrimeScriptTMRT-PCR Kit Ⅱ購(gòu)于TaKaRa公司;鼠源GST標(biāo)簽抗體、Western blot及IP細(xì)胞裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、Protein A+G Agarose、增強(qiáng)型CCK-8溶液、DAPI染色液購(gòu)于碧云天公司;DMEM、胎牛血清(Fetal Bovine Serum, FBS)、胰蛋白酶、PBS緩沖液、雙抗購(gòu)于美國(guó)Gibco公司;弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、牛血清白蛋白(BSA)、抗熒光猝滅劑、蛋白酶抑制劑購(gòu)于美國(guó)Sigma公司;VybrantTMCFDA SE Cell Tracer Kit、蛋白Marker(Protein Ladder)購(gòu)于賽默飛公司;4%組織細(xì)胞固定液、NSC23766購(gòu)于索萊寶公司;Alexa Fluor?647 Goat Anti-Rabbit IgG購(gòu)于 Invitrogen公司;胃蛋白酶購(gòu)于生工生物工程(上海)股份有限公司;GST·BindTMResin購(gòu)于Novagen公司.

1.3 cDNA模板的制備

取1.0×106個(gè)DF-1細(xì)胞,按照MiniBEST Universal RNA Extraction Kit說(shuō)明書提取細(xì)胞總RNA,取少量總RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性,利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度.符合要求后,使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒制備cDNA.

1.4 Rac1基因的克隆與鑒定

根據(jù)雞Rac1(GenBank登錄號(hào): NM_205017.1)的編碼區(qū)(579 bp)序列,設(shè)計(jì)引物,上游引物為: 5’-CGGAATTCATGCAGGCCATCAAGTGTGTG-3’,下游引物為: 5’-CCCTCGAGTTACAGCAGCA GACATTTTCTCTTCC-3’,并在上、下游引物中分別加入EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)(下劃線標(biāo)注).以DF-1細(xì)胞的cDNA為模板對(duì)雞Rac1基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR擴(kuò)增程序: 94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸90 s,40個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min.經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)PCR產(chǎn)物后,對(duì)目的片段進(jìn)行回收純化,克隆至pGEM-T-Easy載體,轉(zhuǎn)化至E.coliTop10細(xì)胞中,并涂布于LB固體培養(yǎng)基上,于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 h,挑取單克隆菌落并用PCR鑒定,將鑒定正確的菌液送至上海擎科生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序.將測(cè)序結(jié)果與Rac1全長(zhǎng)序列進(jìn)行BLAST相似性分析(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/),并使用ExPASy對(duì)其進(jìn)行氨基酸序列和相對(duì)分子質(zhì)量預(yù)測(cè)(http:∥www.expasy.org/tolls/protparam.html).

1.5 Rac1重組蛋白的表達(dá)與純化

將測(cè)序正確的Rac1片段與pGEX-4T-1質(zhì)粒分別用EcoRⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切,經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后,回收目的片段,連接,轉(zhuǎn)化至E.coliTop10感受態(tài)細(xì)胞,并涂布于含有Amp+的LB固體培養(yǎng)基上,于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 h,挑取單克隆菌落,經(jīng)PCR、雙酶切鑒定為陽(yáng)性后進(jìn)行測(cè)序.將測(cè)序正確的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)中,在37 ℃、180 r/min的搖床中搖動(dòng)培養(yǎng)至OD值為0.6左右,加入IPTG(終濃度1 mmol/L),繼續(xù)在搖床中誘導(dǎo)表達(dá)8 h后,低溫離心收集菌液沉淀,加入2 mL PBS重懸沉淀,超聲波裂解重懸液.裂解液在4 ℃、12 000×g下離心10 min,通過(guò)SDS-PAGE確定蛋白可在上清中表達(dá),按照GST·BindTMResin說(shuō)明書對(duì)上清中的目的蛋白進(jìn)行純化.

1.6 Rac1重組蛋白的驗(yàn)證

利用Western blot對(duì)純化后的重組蛋白進(jìn)行驗(yàn)證.取10 μg純化后的重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上,用5%脫脂乳37 ℃封閉2 h后,加入鼠抗GST標(biāo)簽抗體(1∶1 000稀釋),4 ℃孵育12 h, PBST洗5遍;二抗使用山羊抗鼠IgG(1∶5 000稀釋)室溫孵育45 min, PBST洗5遍,然后用顯影液孵育2 min后,于ChemiDoc TMTouch Imaging System成像系統(tǒng)中成像.

1.7 Rac1重組蛋白多克隆抗體的制備

將純化后的Rac1-GST重組蛋白與弗氏完全佐劑進(jìn)行1∶1乳化,通過(guò)皮下注射方式對(duì)8周齡的新西蘭大白兔進(jìn)行免疫,一周后將純化后的Rac1-GST重組蛋白與弗氏不完全佐劑以1∶1乳化后進(jìn)行3次加強(qiáng)免疫,最后再用純化后的Rac1-GST重組蛋白加強(qiáng)免疫一次,免疫結(jié)束一周后收集血清.

1.8 柔嫩艾美耳球蟲子孢子的收集

1日齡三黃雞在無(wú)球蟲的條件下飼養(yǎng)2周后,經(jīng)口接種柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊(3.0×104/只).收集接種后6～8 d雞糞便中的卵囊,培養(yǎng)至卵囊孢子化率達(dá)90%左右時(shí)[14],用飽和食鹽水漂浮法和次氯酸鈉消化法純化孢子化卵囊[15].在純化好的孢子化卵囊沉淀中加入5 mL PBS和適量玻璃珠,于振蕩器上震蕩至卵囊破壁率達(dá)到90%,3 000×g離心8 min,用含有0.5%的胰蛋白酶和7%雞膽汁的HBBS(Hank’s Balance Buffer Saline) 平衡鹽緩沖液重懸沉淀,置于41 ℃水浴鍋中消化1 h至子孢子逸出率約90%時(shí),離心,用HBBS平衡鹽緩沖液重懸沉淀,加入到G3砂芯漏斗中,收集濾液,離心后獲得子孢子[16].

1.9 細(xì)胞樣品的收集

DF-1細(xì)胞(1.5×106/瓶)接入T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,加入5 mL完全培養(yǎng)基,于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞覆蓋率為80%～90%左右.子孢子用含有2%血清和5%雙抗的完全培養(yǎng)基重懸,于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育2 h,3 500×g離心10 min,棄上清,完全培養(yǎng)基重懸后,按子孢子與細(xì)胞3∶1(MOI=3)的比例將子孢子接入細(xì)胞中,在41 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),并收集接種后1,2,6,12,24,36,48,60,72 h的細(xì)胞樣品,于-80 ℃保存.同時(shí)設(shè)置未感染子孢子的DF-1細(xì)胞為對(duì)照組.

1.10 子孢子感染對(duì)Rac1轉(zhuǎn)錄水平的影響

將保存的感染后1,2,6,12,24,36,48,60,72 h的細(xì)胞樣品和未感染組的細(xì)胞樣品,按照MiniBEST Universal RNA Extraction Kit說(shuō)明書提取細(xì)胞總RNA.根據(jù)已發(fā)表的Rac1與GAPDH(內(nèi)參)的序列設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行qPCR,Rac1上游引物: 5’-ACACAACCAATGCGTTTCCT-3’,下游引物: 5’-GGTAGGAGAGTGGGCGTAG-3’;GAPDH上游引物: 5’-GGCACTGTCAAGGCTGAGAACG-3’,下游引物: 5’-TGAGATGATAACACGCTTAGCACCAC-3’.按照One Step TB Green Prime ScriptTMRT-PCR Kit Ⅱ說(shuō)明書進(jìn)行qPCR,反應(yīng)體系: One Step TB Green RT-PCR Buffer 4(2×)10 μL、Prime Script 1 Step Enzyme Mix 2 0.8 μL、PCR Forward Primer(10 μmol/L) 0.8 μL、PCR Reverse Primer(10 μmol/L) 0.8 μL、ROX Reference Dye or Dye Ⅱ(50×) 0.4 μL、Total RNA 2 μL、RNase Free ddH2O 5.2 μL.使用7 500 Fast Real-Time PCR System進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增條件為: 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)42 ℃ 5 min, 95 ℃ 10 s;PCR反應(yīng)95 ℃ 5 s,60 ℃ 34 s，共40個(gè)循環(huán)；溶解曲線默認(rèn)儀器設(shè)置.每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)重復(fù),按照公式ΔΔCt=(Ct目的RNA-Ct內(nèi)參)處理組/(Ct目的RNA-Ct內(nèi)參)對(duì)照組,對(duì)目的基因mRNA的Ct值作轉(zhuǎn)換,表示試驗(yàn)組表達(dá)量于對(duì)照組的倍數(shù)改變.

1.11 子孢子感染對(duì)Rac1翻譯水平的影響

用WB/IP細(xì)胞裂解液對(duì)未感染組和感染組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞樣品進(jìn)行裂解,提取蛋白.每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取20 μg蛋白,進(jìn)行SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上,用5%脫脂乳37 ℃封閉2 h后,加入一抗,使用兔抗Rac1-GST多克隆抗體(1∶100稀釋,本實(shí)驗(yàn)室制備)或兔抗雞GAPDH多克隆抗體(1∶2 000稀釋);4 ℃孵育12 h,PBST洗5遍,二抗使用山羊抗兔IgG(1∶5 000稀釋)室溫孵育45 min,PBST洗5遍,然后用顯影液孵育2 min后,于ChemiDoc TMTouch Imaging System成像系統(tǒng)中成像.

1.12 子孢子感染對(duì)Rac1分布的影響

在細(xì)胞六孔板中放入細(xì)胞爬片,將DF-1細(xì)胞(1.0×106/孔)接入六孔板中,于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞覆蓋率為80%～90%左右.將子孢子用含有CFDA SE標(biāo)記液(1∶20 000稀釋)的PBS孵育15 min,3 500×g離心10 min.用溫?zé)岬腜BS洗滌子孢子,3 500×g離心10 min棄上清,完全培養(yǎng)基重懸后,按子孢子與細(xì)胞3∶1(MOI=3)的比例將子孢子接入細(xì)胞中,在41 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng).在15 min、30 min和2 h時(shí)取出六孔板,對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定、通透、封閉后,加入兔抗Rac1-GST多克隆抗體(1∶100稀釋),在37 ℃條件下孵育2 h.PBS洗滌3次后,加入Alexa Fluor?647 Goat Anti-Rabbit IgG(1∶500稀釋),室溫孵育45 min.PBS洗滌3次后,加入DAPI在室溫條件下對(duì)細(xì)胞核染色15 min,滴加抗熒光淬滅劑處理,在熒光顯微鏡下觀察.同時(shí)設(shè)置未感染子孢子的DF-1細(xì)胞為對(duì)照組.

1.13 Rac1多克隆抗體對(duì)子孢子入侵能力的影響

將DF-1細(xì)胞(3.0×105/孔)接入24孔板中,于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞覆蓋率為80%～90%左右.使用Protein A+G Agarose純化Rac1多克隆抗體,并用BCA法測(cè)定抗體濃度.將24孔板中原有的培養(yǎng)基棄去,加入含有純化的兔抗Rac1 IgG或正常兔IgG的培養(yǎng)基與細(xì)胞共孵育,使抗體終濃度為50,100,200,300,400 μg/mL,于37 ℃,5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3 h.對(duì)新鮮的子孢子進(jìn)行CFDA SE標(biāo)記后,按子孢子與細(xì)胞3∶1(MOI=3)的比例將子孢子接入細(xì)胞中,在41 ℃,5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h,用Cytomics FC500流式細(xì)胞儀檢測(cè)子孢子的入侵情況.以相同濃度的家兔IgG作為陰性對(duì)照,并以未經(jīng)抗體孵育的細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照.共進(jìn)行3次試驗(yàn).

1.14 NSC23766抑制Rac1活性對(duì)子孢子入侵能力的影響

將DF-1細(xì)胞(3.0×105/孔)接入24孔板中,于37 ℃,5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞覆蓋率為80%～90%左右.棄掉孔內(nèi)原有培養(yǎng)基,加入NSC23766抑制劑,使抑制劑終濃度為100 μmol/L,200 μmol/L,培養(yǎng)3 h后,用PBS將細(xì)胞清洗3遍以去除殘余的抑制劑,按子孢子與細(xì)胞3∶1(MOI=3)的比例將已經(jīng)用CFDA SE標(biāo)記過(guò)的子孢子接入細(xì)胞中,在41 ℃,5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h,用Cytomics FC500流式細(xì)胞儀檢測(cè)子孢子的入侵情況.以未經(jīng)抑制劑處理的細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照.共進(jìn)行3次試驗(yàn).

1.15 NSC23766抑制Rac1活性對(duì)細(xì)胞活性的影響

將DF-1細(xì)胞(8×104/孔)接入96孔板中,每孔加入0.1 mL完全培養(yǎng)基于37 ℃,5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞覆蓋率為80%～90%左右.棄掉孔內(nèi)原有培養(yǎng)基,加入0.1 mL含NSC23766的完全培養(yǎng)基,使抑制劑終濃度為100 μmol/L,200 μmol/L,培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3 h后,用PBS將細(xì)胞清洗3遍以去除殘余的抑制劑,每孔加入0.1 mL含有10% CCK-8的完全培養(yǎng)基,37 ℃,5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h.用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光值.同時(shí)設(shè)置未加入抑制劑的對(duì)照組,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.

1.16 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析.通過(guò)單因素方差分析評(píng)估Rac1的轉(zhuǎn)錄水平、翻譯水平和各組子孢子入侵率的差異，并使用鄧肯多重范圍檢驗(yàn)對(duì)各組數(shù)據(jù)的平均值進(jìn)行比較.差異顯著用P<0.05表示，差異極顯著用P<0.01表示.

2 結(jié) 果

2.1 Rac1基因的克隆

以DF-1細(xì)胞的cDNA為模板,PCR擴(kuò)增得到一條大小約為579 bp的條帶(圖1),通過(guò)BLASTN比對(duì),發(fā)現(xiàn)獲得的序列與已發(fā)表的雞Rac1(登錄號(hào): NM_205017.1)基因同源性為100%,證明擴(kuò)增到的基因?yàn)殡uRac1基因,所編碼的氨基酸序列長(zhǎng)192 aa,預(yù)測(cè)相對(duì)分子質(zhì)量約21.5 kDa.

圖1 Rac1基因的PCR克隆Fig.1 The PCR result of Rac1M: DL2000相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1: Rac1 PCR擴(kuò)增結(jié)果.

2.2 Rac1重組蛋白的表達(dá)與純化

SDS-PAGE結(jié)果顯示,加入IPTG(1 mmol/L)誘導(dǎo)后2～8 h,在43～55 kDa之間均有蛋白表達(dá),與預(yù)測(cè)的目的蛋白大小(47.5 kDa,包括21.5 kDa 的Rac1重組蛋白和26 kDa的GST標(biāo)簽蛋白)相符,且蛋白表達(dá)量在8 h達(dá)到最高(圖2(a)),對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化,可得到較純的Rac1重組蛋白(圖2(b)).

圖2 Rac1重組蛋白的表達(dá)與純化Fig.2 Expression and purification of Rac1 recombinant protein(a) Rac1的誘導(dǎo)表達(dá);(b) Rac1的純化;M: 蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1: 陰性對(duì)照(無(wú)IPTG誘導(dǎo));2: IPTG誘導(dǎo)后2 h;3: IPTG誘導(dǎo)后4 h;4: IPTG誘導(dǎo)后6 h;5: IPTG誘導(dǎo)后8 h;6: 純化的Rac1.

2.3 Rac1重組蛋白的驗(yàn)證

以鼠源抗GST標(biāo)簽抗體作為一抗鑒定純化的Rac1重組蛋白,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在43～55 kDa處出現(xiàn)一條特異性條帶(圖3),大小與預(yù)測(cè)分子量一致.

圖3 Rac1重組蛋白的Western blot驗(yàn)證Fig.3 Identification of Rac1 recombinant proteins by Western blotM: 蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1: 純化的蛋白.

2.4 子孢子感染后細(xì)胞中Rac1轉(zhuǎn)錄水平的變化

使用qPCR對(duì)子孢子感染后1～72 h DF-1細(xì)胞中Rac1的mRNA水平進(jìn)行測(cè)定.結(jié)果顯示： 與未感染組相比,子孢子感染60 h和72 h時(shí)DF-1細(xì)胞中Rac1的mRNA水平顯著上升,而感染1～48 h時(shí)無(wú)明顯變化(圖4).

圖4 E.tenella子孢子感染DF-1細(xì)胞中Rac1的mRNA表達(dá)水平Fig.4 Rac1 mRNA expression levels in E.tenella sporozoite-infected DF-1 Cells**，***分別表示與未感染組相比t檢驗(yàn)的P<0.01，P<0.001.

2.5 子孢子感染后細(xì)胞中Rac1翻譯水平的變化

利用Western blot對(duì)子孢子感染后6 h,36 h,72 h和未感染組的DF-1細(xì)胞中Rac1蛋白表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)定.結(jié)果顯示,與未感染組相比,子孢子感染后的DF-1細(xì)胞中Rac1蛋白表達(dá)水平無(wú)顯著變化(圖5，見(jiàn)第764頁(yè)).

圖5 E.tenella子孢子感染DF-1細(xì)胞中Rac1蛋白表達(dá)水平Fig. 5 Rac1 protein expression levels in E.tenella sporozoite-infected DF-1 cells(a) 內(nèi)參GAPDH和Rac1的Western blot結(jié)果;(b) Rac1蛋白的相對(duì)表達(dá)量.

2.6 子孢子感染的DF-1細(xì)胞中Rac1的分布

通過(guò)間接免疫熒光的方法對(duì)子孢子感染15 min,30 min,2 h和未感染子孢子的DF-1細(xì)胞中Rac1的分布情況進(jìn)行測(cè)定.結(jié)果顯示(圖6，見(jiàn)第764頁(yè)): 子孢子感染15 min和30 min后,在子孢子頂端Rac1的熒光強(qiáng)度增加,隨著時(shí)間的增加這種現(xiàn)象逐漸減弱.

圖6 Rac1在E.tenella子孢子入侵DF-1細(xì)胞后分布的變化Fig.6 Changes of Rac1 distribution after E.tenella sporozoite invasion DF-1 cell(a) 未感染組DF-1細(xì)胞中的Rac1;(b) 感染子孢子15 min后DF-1細(xì)胞中的Rac1;(c) 感染子孢子30 min后DF-1細(xì)胞中的Rac1;(d) 感染子孢子2 h后DF-1細(xì)胞中的Rac1.

2.7 Rac1多克隆抗體對(duì)子孢子入侵能力的影響

利用體外入侵試驗(yàn)分析Rac1多克隆抗體孵育DF-1細(xì)胞后對(duì)子孢子入侵能力的影響.結(jié)果顯示： 與相同劑量的兔IgG處理的細(xì)胞和未處理組相比,用不同濃度的Rac1多克隆抗體處理的DF-1細(xì)胞,入侵率無(wú)顯著差異(圖7，見(jiàn)第764頁(yè)).

圖7 多克隆抗體對(duì)E.tenella子孢子入侵DF-1細(xì)胞的影響Fig.7 Effect of anti-Rac1 antibody on E.tenella sporozoite invasion DF-1 cell

2.8 NSC23766抑制Rac1活性對(duì)子孢子入侵能力的影響

使用NSC23766抑制DF-1細(xì)胞中Rac1的活性后,利用體外入侵試驗(yàn)檢測(cè)球蟲子孢子入侵的能力.結(jié)果顯示: 使用抑制劑處理組的子孢子入侵率相比未處理組顯著降低,且這種抑制作用與抑制劑的使用濃度成正比(圖8).

圖8 使用NSC23766抑制Rac1活性對(duì)E.tenella子孢子入侵DF-1細(xì)胞的影響Fig.8 Effect of inhibition of Rac1 activity with NSC23766 onE.tenella sporozoite invasion DF-1 cell **，***分別表示與未感染組相比t檢驗(yàn)的P<0.01，P<0.001.

2.9 NSC23766抑制Rac1活性對(duì)細(xì)胞活性的影響

通過(guò)CCK-8試劑檢測(cè)用含有100 μmol/L和200 μmol/L NSC23766的完全培養(yǎng)基孵育DF-1細(xì)胞后,對(duì)其活性的影響.結(jié)果顯示: 抑制劑處理組細(xì)胞相比對(duì)照組細(xì)胞,細(xì)胞活性并無(wú)顯著影響(圖9).

圖9 抑制Rac1活性對(duì)DF-1細(xì)胞活性的影響Fig.9 Effect of inhibition of Rac1 activity on DF-1 cell activity

3 討 論

Rac1是一種小GTP結(jié)合蛋白,屬于Ras超家族中Rho亞家族的成員,在正常細(xì)胞中廣泛存在,是控制真核細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的分子開關(guān)[17].Rac1的活性受到鳥嘌呤核苷酸交換因子(GEFs)和GTP酶激活蛋白的調(diào)控,是連接生長(zhǎng)因子與聚合肌動(dòng)蛋白組織信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的重要組成部分,通過(guò)對(duì)細(xì)胞外信號(hào)的響應(yīng),調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重組,細(xì)胞黏附和膜皺褶的形成[18].Rac1可以和Cdc42激活PI(3)K改變肌動(dòng)蛋白的結(jié)構(gòu),介導(dǎo)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和侵襲性增加[19].除了在調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架中的作用外,Rac1還參與m-CSF受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),通過(guò)PI3K/AKT途徑介導(dǎo)某些細(xì)胞的抗凋亡信號(hào)[20].此外,Rac還是吞噬細(xì)胞NADPH氧化酶的重要激活因子[21].

為了研究Rac1在球蟲感染過(guò)程中的作用,我們選擇了DF-1細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?因?yàn)槿崮郯蓝蛳x的宿主是雞,DF-1細(xì)胞來(lái)源于原代雞胚成纖維細(xì)胞,作為球蟲體外入侵模型更加貼近宿主.子孢子入侵DF-1細(xì)胞24 h可發(fā)育為滋養(yǎng)體,48 h發(fā)育為未成熟裂殖體,72 h 為第一代成熟裂殖體[22],說(shuō)明DF-1細(xì)胞為子孢子的體外發(fā)育提供了較為合適的環(huán)境.本研究對(duì)子孢子入侵DF-1細(xì)胞不同時(shí)間段的Rac1轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)在柔嫩艾美耳球蟲子孢子感染細(xì)胞60～72 h時(shí),DF-1細(xì)胞中Rac1的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高,但1～48 h并無(wú)明顯變化.Western blot的結(jié)果顯示Rac1蛋白的表達(dá)水平在感染前后無(wú)明顯差異.我們推測(cè),這可能是因?yàn)檎婧嘶虮磉_(dá)的轉(zhuǎn)錄和翻譯發(fā)生的時(shí)間和地點(diǎn)不同,基因轉(zhuǎn)錄后還要經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控和加工、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的降解、翻譯后修飾等多種調(diào)控機(jī)制,因此導(dǎo)致了mRNA水平和蛋白表達(dá)水平的差異.已有研究表明,隨著弓形蟲速殖子入侵宿主細(xì)胞時(shí)間的延長(zhǎng),宿主細(xì)胞Rac1的第71位絲氨酸發(fā)生磷酸化,但整體蛋白表達(dá)水平并無(wú)明顯變化[23].Rac1是GTP結(jié)合蛋白,GDP/GTP的交換速率決定了Rac1的活性,而磷酸化會(huì)抑制GTP與Rac1的結(jié)合,使其整體活性下降[24].所以我們推測(cè)Rac1在球蟲入侵過(guò)程中發(fā)揮的作用依賴于其整體活化水平而與蛋白表達(dá)總水平無(wú)太大聯(lián)系.

為了研究Rac1在子孢子入侵DF-1細(xì)胞中的作用,我們用純化的Rac1多克隆抗體孵育DF-1細(xì)胞后,利用體外入侵試驗(yàn)檢測(cè)子孢子入侵DF-1細(xì)胞的效率.結(jié)果顯示： 與對(duì)照組和使用相同劑量的兔IgG處理的DF-1細(xì)胞相比,用50,100,200,300,400 μmol/L抗體孵育后子孢子入侵效率無(wú)顯著變化.我們推測(cè)抗體孵育只作用于細(xì)胞表面,而Rac1在細(xì)胞中高表達(dá),所以抗體孵育的方法并不能很好的封閉Rac1的功能.

為了進(jìn)一步研究Rac1在子孢子入侵宿主細(xì)胞過(guò)程中的功能作用,我們利用間接免疫熒光觀察了子孢子感染前后Rac1分布的變化.發(fā)現(xiàn)在子孢子入侵DF-1細(xì)胞15～30 min后,在子孢子頂端觀察到Rac1的熒光強(qiáng)度增強(qiáng),而在子孢子入侵2 h后這種現(xiàn)象基本消失.在已有研究中也發(fā)現(xiàn),白色念珠菌感染兔角膜上皮細(xì)胞后,Rac1和RhoA與肌動(dòng)蛋白共同定位在細(xì)菌入侵的部位[25].弓型蟲速殖子入侵早期,會(huì)激活并招募宿主Rac1聚集到弓形蟲的納蟲泡上[26].克氏錐蟲感染MDCK細(xì)胞后可以激活Rac1使纖維狀肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重組[13].因此,我們推測(cè)Rac1可能參與了多種病原微生物入侵宿主細(xì)胞過(guò)程中細(xì)胞骨架的重排作用.

NSC23766(C24H35N7.3HCl)是一種被廣泛應(yīng)用的Rac1特異性小分子抑制劑,其分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)使它可以融入Rac1的表面溝槽,靶向作用于Rac1,抑制其結(jié)合和激活,同時(shí)不干擾緊密相關(guān)的Cdc42或RhoA的活化[27].同時(shí)NSC23766的抑制作用具有劑量依賴性,本實(shí)驗(yàn)中所使用的低濃度(100 μmol/L)NSC23766已被證明能夠顯著抑制內(nèi)源性Rac1的活性[28].在分別用終濃度為100和200 μmol/L的NSC23766處理DF-1細(xì)胞后,我們檢測(cè)了子孢子的入侵效率,結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,抑制劑處理組子孢子入侵率隨抑制劑濃度的增加而降低.有研究顯示阻礙細(xì)胞骨架重排的措施都會(huì)減弱寄生蟲對(duì)宿主細(xì)胞的有效入侵,弓形蟲侵入宿主細(xì)胞能引起明顯的細(xì)胞骨架重排現(xiàn)象,用Rac1抑制劑處理后重排現(xiàn)象變?nèi)?速殖子入侵率降低[26].柔嫩艾美耳球蟲子孢子入侵HCT-8細(xì)胞引起F-actin的聚集,細(xì)胞松弛素D處理后,重排現(xiàn)象和子孢子入侵率均下降[6].這些結(jié)果提示我們,在球蟲入侵宿主細(xì)胞的過(guò)程中Rac1參與了細(xì)胞骨架的重排,抑制Rac1活性可能會(huì)干擾其參與細(xì)胞骨架的重排作用,從而阻礙了球蟲子孢子入侵宿主細(xì)胞.