許譯天，劉 暢，李 琳

(1. 復(fù)旦大學(xué) 遺傳工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200438; 2. 復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,上海 200438)

光是地球生命活動(dòng)的能量來源，同時(shí)也是一種不可或缺的環(huán)境信號(hào)，植物的萌發(fā)、生長發(fā)育、開花結(jié)果、衰老死亡等一系列活動(dòng)都與光有關(guān).植物葉片中的葉綠素可以吸收波長630 nm左右的紅光和470 nm左右的藍(lán)紫光進(jìn)行光合作用[1].自然條件下，在充足光照環(huán)境中，紅光與遠(yuǎn)紅光的比例(R/FR)通常在1.2左右，但是當(dāng)植物高密度種植時(shí)，位于上層的植物葉片會(huì)吸收紅光和藍(lán)紫光進(jìn)行光合作用并反射遠(yuǎn)紅光，這使下層植物接收到的R/FR降低[2-3]，從而感受到鄰近競爭者的存在，我們將這種環(huán)境稱為蔭影(Shade, SH).此外，太陽與地面的傾角以及周圍環(huán)境因素的變化也會(huì)影響R/FR的值，比如黎明和黃昏時(shí)分，由于大氣對(duì)光的吸收和散射作用，R/FR會(huì)有所下降[2].蔭影不耐受植物在蔭影下會(huì)產(chǎn)生避蔭反應(yīng)(Shade Avoidance Response, SAR)，發(fā)生一系列形態(tài)學(xué)變化，如下胚軸、節(jié)間的伸長、葉柄的延伸[4]；持續(xù)的蔭影會(huì)導(dǎo)致早花、分枝減少、對(duì)食草昆蟲更敏感以及種子減少等表型[5].

在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐中，過高種植密度導(dǎo)致的避蔭反應(yīng)往往對(duì)于需要收獲果實(shí)的農(nóng)作物具有較為嚴(yán)重的負(fù)面影響，比如高密度種植會(huì)降低玉米葉片的葉綠素含量和凈光合速率，使穗粒數(shù)和千粒重減少，導(dǎo)致單株產(chǎn)量下降[6]；蔭影也會(huì)抑制小麥的光合效率，導(dǎo)致其成穗數(shù)下降[7]；同樣，水稻的產(chǎn)量及質(zhì)量也會(huì)受到蔭影的影響[8]；油菜在種植密度過高時(shí)單位面積有效角果數(shù)和總產(chǎn)量均被抑制[9].因此，了解避蔭反應(yīng)產(chǎn)生的分子機(jī)制，嘗試改善植物在避蔭反應(yīng)下的不利表型，探究提高高密度種植下作物產(chǎn)量的方法，是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)突破的重要環(huán)節(jié).

番茄(Solanumlycopersicum)作為一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，其栽培面積大、經(jīng)濟(jì)效益高，特別在中國北方，番茄已經(jīng)成為主要作物之一.光照條件對(duì)于番茄的生長發(fā)育十分重要，研究發(fā)現(xiàn)，紅光處理能使金棚朝冠番茄果實(shí)具有更高的可溶性固形物含量和糖酸比[10]；遠(yuǎn)紅光處理能導(dǎo)致番茄“Komeett”的葉面積變大且葉柄伸長[11]；改變紅光藍(lán)光比例也會(huì)影響北京櫻桃番茄的光合效率以及干重積累等表型[12].在蔭影下生長的番茄其表型和產(chǎn)量也會(huì)受到明顯的影響，比如，通過降低紅光與遠(yuǎn)紅光比例(R/FR=0.5)來模擬蔭影處理能夠增加栽培品種Moneymaker(MM)的節(jié)間長度[13]，從而使自身能夠與臨近植物競爭更多陽光.同時(shí)，持續(xù)的蔭影處理會(huì)使野生型番茄真葉面積增大[14]，并導(dǎo)致番茄栽培品種M82的葉形改變及花青素降解[15].針對(duì)大棚中真實(shí)的密植環(huán)境研究發(fā)現(xiàn)，過高的種植密度會(huì)導(dǎo)致番茄植株的節(jié)間長度及株高增加、莖干變細(xì)、葉面積增大[16]；同時(shí)，高密度種植會(huì)延長番茄的生長周期，并使單果重量降低，且容易引發(fā)病蟲害[17].由此可見，過高的種植密度會(huì)影響番茄的產(chǎn)量，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成不利的影響.

目前對(duì)番茄中避蔭反應(yīng)分子機(jī)制的研究還很少.已知番茄中含有5種光敏色素(Phytochrome)，分別為phyA、phyB1、phyB2、phyC和phyE，其中phyB1、phyB2和phyE同屬于phyB亞家族，它們主要感受紅光與遠(yuǎn)紅光[13,18].光敏色素phyB的突變體幼苗在紅光照射下具有相較野生型更長的下胚軸，它對(duì)紅光照射不敏感.研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)對(duì)番茄進(jìn)行35 d的長時(shí)間蔭影(R/FR=0.5)處理后，tri/phyB1單突變體具有與對(duì)照MM相比更長的節(jié)間，而其他光敏色素單突變體如phyB2、friop則與對(duì)照組表型類似[13].但是對(duì)于光敏色素調(diào)控番茄避蔭反應(yīng)的具體機(jī)制卻還沒有研究.同時(shí)，蔭影會(huì)對(duì)番茄的色素含量產(chǎn)生影響[15,19]，但是在色素相關(guān)突變體中番茄的避蔭反應(yīng)也沒有研究.光敏色素相互作用因子(Phytochrome Interacting Factors, PIFs)是一類bHLH轉(zhuǎn)錄因子，在擬南芥中已經(jīng)證明它可以在光敏色素的下游發(fā)揮功能，調(diào)節(jié)植物的避蔭反應(yīng)[20].番茄中共有8個(gè)PIFs(PIF1a, PIF1b, PIF3, PIF4, PIF7a, PIF7b, PIF8a, PIF8b)[21]，PIF4對(duì)于番茄葉片衰老、果實(shí)中類胡蘿卜素的合成以及番茄耐高溫能力的發(fā)揮有著重要的調(diào)控作用[22].最近的研究發(fā)現(xiàn)，蔭影下番茄Ailsa Craig(AC)中的PIF4也可以通過調(diào)控生長素合成和信號(hào)傳遞相關(guān)基因的表達(dá)促進(jìn)下胚軸伸長[23].但是目前對(duì)于番茄中避蔭反應(yīng)的表型及分子機(jī)制的研究都還處于起步階段.

在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，提高高密度種植狀態(tài)下作物產(chǎn)量的方法主要有兩種： 一是對(duì)農(nóng)作物品種的改良，比如雜交水稻[24]、轉(zhuǎn)基因玉米[25]等，而這需要對(duì)該物種避蔭反應(yīng)產(chǎn)生的分子機(jī)制有一定的了解；二是種植培養(yǎng)方式的改良，通過對(duì)光條件、土壤資源、生長空間的綜合利用從而實(shí)現(xiàn)產(chǎn)量的提高.比如，對(duì)于大田中種植的作物，通過使用寬窄行種植代替等行距種植[26-27]，可以提高玉米、高粱等作物在高密度種植下的群體光能利用率，增加光合作用面積，從而提高作物的生產(chǎn)潛力.對(duì)空心菜、番茄等蔬菜，也可以利用日光溫室或塑料大棚來改變溫度、光照時(shí)間、光強(qiáng)光質(zhì)等關(guān)鍵環(huán)境條件[28-30]，從而改善作物生長狀態(tài)及產(chǎn)量.

之前的研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)整光照強(qiáng)度和方式可以影響植物的生長發(fā)育[29,31]，補(bǔ)充額外的光源也可以改善果實(shí)的品質(zhì)[32]，但是這些研究都集中在對(duì)頂部光條件的改變上.傳統(tǒng)的頂部補(bǔ)光對(duì)那些被上部葉片遮蔽的底部葉片來說收效甚微，底部補(bǔ)光可以讓那些被遮蔽的葉片感受到光，但是否能幫助緩解避蔭反應(yīng)的表型還不清楚.在本研究中，我們使用LED三色光屏模擬蔭影，測量了番茄幼苗第一節(jié)間長度、第一對(duì)真葉葉綠素、花青素含量，以此表征番茄在蔭影下的生長情況，并檢測了相關(guān)基因的表達(dá)水平.通過檢測光受體突變體的表型，發(fā)現(xiàn)phyB1可能作為一種重要的元件調(diào)控番茄在蔭影下的節(jié)間伸長和花青素的積累.在番茄幼苗底部進(jìn)行紅光和藍(lán)光的補(bǔ)充照射，可以部分恢復(fù)番茄花青素含量和節(jié)間長度的表型，這表明可以通過底部補(bǔ)光的方法來減弱番茄的避蔭反應(yīng)，為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供可行的方法.

1 材料與方法

1.1 材料

表1顯示了實(shí)驗(yàn)中所涉及到的番茄品種信息.MM、AC為番茄栽培品種；friop、friself、tri/phyB1、phyB2為光敏色素突變體；cry1為藍(lán)光受體突變體.其中，friop、friself為對(duì)遠(yuǎn)紅光不敏感的突變體，在遠(yuǎn)紅光下表現(xiàn)出更長的下胚軸；tri/phyB1為對(duì)紅光不敏感的突變體，phyB2本身表型正常，與tri/phyB1共同缺失會(huì)表現(xiàn)出更長的節(jié)間；cry1為隱花色素突變體，具有伸長的下胚軸和莖干，且花青素減少.a、al、aw、ag為花青素突變體，hp-1為色素相關(guān)突變體.其中，a的莖干和葉片中不含有花青素；al只在幼苗階段出現(xiàn)中等水平的花青素累積，隨后消失；aw完全不含有花青素；ag除了葉片下部外均不含有花青素，hp-1在果實(shí)中具有高水平的類胡蘿卜素等色素.番茄品種信息來源于https：∥tgrc.ucdavis.edu，全部番茄種子購買于C.M. Rick Tomato Genetics Resource Center.

1.2 培養(yǎng)種植方法

將番茄種子在75%乙醇中旋轉(zhuǎn)清洗10 min，晾干.將種子放于吸飽水的濾紙上，置于持續(xù)白光下(80 μmol·m-2·s-1)發(fā)芽，7 d后轉(zhuǎn)移到蛭石土壤中進(jìn)行培養(yǎng)，使用LED三色光屏提供持續(xù)光源(紅光20 μmol·m-2·s-1，藍(lán)光20 μmol·m-2·s-1，遠(yuǎn)紅光5 μmol·m-2·s-1)，溫度22 ℃，濕度60%.

1.3 光條件處理

將21 d大的番茄幼苗置于模擬蔭影下生長，光條件為紅光20 μmol·m-2·s-1，藍(lán)光20 μmol·m-2·s-1，遠(yuǎn)紅光60 μmol·m-2·s-1，生長6 d后取樣檢測.補(bǔ)光處理方式： 對(duì)于在蔭影下生長的番茄，在盆下方增加一塊LED光屏，額外補(bǔ)充單光(20～50 μmol·m-2·s-1)處理，6 d后取樣進(jìn)行檢測.

1.4 檢測指標(biāo)及方法

1.4.1 第一節(jié)間長度

將在蔭影下生長6 d后的番茄幼苗用惠普掃描儀(Scanjet 8270)進(jìn)行掃描，使用Image J軟件對(duì)第一節(jié)間(從子葉葉柄處起始至第一真葉葉柄處終止)長度進(jìn)行測量.

1.4.2 葉綠素含量

使用手持式葉綠素測量儀器SPAD-502(Konica Minolta)測量第一對(duì)真葉中的葉綠素含量，以spad指數(shù)表征葉綠素含量.該儀器利用葉綠素只吸收紅光和藍(lán)紫光且不吸收遠(yuǎn)紅光的特性，通過測量葉子在紅光(650 nm)區(qū)域和遠(yuǎn)紅光(940 nm)區(qū)域的吸收率計(jì)算出spad值，來表示目前葉片中葉綠素含量的相對(duì)參數(shù).

1.4.3 花青素含量

取第一對(duì)真葉并稱重(m鮮葉)，放入液氮中迅速冷凍并研磨樣品，每片葉子加入600 μL 1% HCl的甲醇溶液，置于黑暗下4 ℃過夜，隨后12 000 r/min離心10 min，取上清(約500 μL)置于新的離心管中，加入500 μL水、1 mL氯仿并震蕩混勻，于4 ℃下放置30 min，再次12 000 r/min離心10 min.取上清使用721S可見分光光度計(jì)(上海儀電分析儀器有限公司)分別測量530 nm處和657 nm處的吸光度(A)，通過公式(A530-A657)/m鮮葉計(jì)算花青素含量.

1.5 基因表達(dá)水平檢測

1.5.1 RNA提取

將在白光(WL)生長21 d大的幼苗一半樣品轉(zhuǎn)入蔭影(SH)處理，一半繼續(xù)在白光下生長，6 d后分別取第一節(jié)間和第一對(duì)真葉樣品，迅速放入液氮中冷凍并研磨.加入500 μL TRIzol，震蕩15 s，室溫靜置5 min.隨后加入100 μL氯仿，震蕩15 s，室溫靜置3 min，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min.取300 μL上清液加入新的離心管內(nèi)，并加入300 μL異丙醇，顛倒混勻，室溫放置10 min.隨后再次4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，去掉上清，加入1 mL 75%乙醇吹洗幾次，4 ℃ 10 000 r/min離心5 min，去除上清.室溫晾2～3 min，加入50 μL RNase-Free H2O溶解RNA，進(jìn)行濃度測定，于-80 ℃冰箱保存或直接反轉(zhuǎn)錄.

1.5.2 反轉(zhuǎn)錄

使用天根公司FastKing一步法除基因組-cDNA第一鏈合成預(yù)混試劑，配制20 μL反轉(zhuǎn)錄體系(5×FastKing-RT SuperMix 4 μL，RNA 0.05～2 μg，RNase-Free H2O補(bǔ)至20 μL)，42 ℃ 15 min去除基因組并反轉(zhuǎn)錄，95 ℃ 3 min酶滅活，得到的cDNA于-80 ℃冰箱保存或直接進(jìn)行qRT-PCR.

1.5.3 實(shí)時(shí)定量PCR

使用圣爾公司2×Qpcr SYBR Green Master Mix試劑，配制20 μL PCR體系(2×SYBR Green Mix 10 μL，引物F 1 μL，引物R 1 μL，cDNA 1 μL，RNase-Free H2O 8 μL).將配好的體系加入96孔板中并低速離心，隨后放入熒光定量PCR儀(Bio-rad CFX Connect)中，設(shè)定程序(95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s；57 ℃ 10 s；72 ℃ 30 s；進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 10 s；65～95 ℃讀取溶解曲線).每個(gè)樣品進(jìn)行3個(gè)技術(shù)重復(fù)，引物詳細(xì)信息見表2.PCR完成后，獲取Cq值，并計(jì)算相關(guān)表達(dá)水平(=2Cq內(nèi)參-Cq基因).

1.6 數(shù)據(jù)分析

使用Microsoft Excel(版本16.39)、Graphpad Prism7.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理、分析、作圖，通過t-test檢驗(yàn)分析顯著性差異.Gene Ontology(GO)分析使用在線網(wǎng)站http：∥bioinfo.sibs.ac.cn/plant-regulomics/.

2 結(jié)果與分析

2.1 蔭影誘導(dǎo)番茄幼苗節(jié)間伸長，并抑制葉片中葉綠素和花青素含量

多數(shù)喜陽植物在蔭影來臨時(shí)會(huì)快速促進(jìn)莖干和節(jié)間伸長，從而與臨近植物競爭更多陽光[33]；同時(shí)，植物葉片中的葉綠素含量能夠體現(xiàn)植物對(duì)光能的吸收，葉綠素含量降低會(huì)影響光合作用進(jìn)而抑制生長發(fā)育[34]；植物色素花青素作為一種類黃酮物質(zhì)，具有較強(qiáng)的抗氧化活性[35]，而高溫或干旱等環(huán)境變化都會(huì)改變作物中的花青素含量[36-37].因此，在本研究中我們選擇節(jié)間長度、葉片葉綠素含量、花青素含量這3個(gè)表型作為番茄響應(yīng)蔭影的檢測指標(biāo).由于MM和AC的表型穩(wěn)定，生長周期較短，且不具有抗蟲抗病等特征，因此常被用作番茄表型研究中的對(duì)照品種，多數(shù)突變體都是在MM和AC背景下構(gòu)建.我們對(duì)生長在模擬白光(R/FR=4)和蔭影(R/FR=0.4)下的番茄MM和AC的表型進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比于在白光下生長的幼苗，蔭影下生長的幼苗展現(xiàn)出更長的第一節(jié)間(圖1(a、b)，見第744頁).同時(shí)蔭影可以顯著降低第一對(duì)真葉中葉綠素(圖1(c)，見第744頁)和花青素(圖1(d)，見第744頁)的含量.這些結(jié)果表明，蔭影對(duì)于MM和AC這兩種栽培品種幼苗的節(jié)間長度和葉片葉綠素、花青素的含量有顯著的影響.

圖1 番茄栽培品種幼苗MM和AC在白光和蔭影下的表型Fig.1 Phenotypes of tomato MM and AC under white light(WL) and shade(SH) (a) 白光或蔭影下MM和AC番茄幼苗表型照片;(b) 第一節(jié)間長度;(c) 第一對(duì)真葉葉綠素含量;(d) 第一對(duì)真葉花青素含量；通過t-test檢驗(yàn)分析顯著性差異，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；將白光(WL)下生長21 d的番茄幼苗轉(zhuǎn)入蔭影(SH)處理6 d或在白光下繼續(xù)生長6 d后取樣檢測;光條件WL： 紅光20 μmol·m-2·s-1，藍(lán)光20 μmol·m-2·s-1，遠(yuǎn)紅光5 μmol·m-2·s-1，SH： 紅光20 μmol·m-2·s-1，藍(lán)光20 μmol·m-2·s-1，遠(yuǎn)紅光60 μmol·m-2·s-1.每種處理?xiàng)l件的n>16，進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù).葉綠素含量為spad值，花青素含量=(A530-A657)/m鮮葉.

2.2 番茄伸長相關(guān)基因及花青素合成基因的表達(dá)水平受蔭影的調(diào)控

為了解釋蔭影下番茄出現(xiàn)一系列表型變化的原因，我們對(duì)在低R/FR比例(R/FR=0.05)下生長4 d的番茄幼苗的Microarray數(shù)據(jù)[19]進(jìn)行了Gene Ontology(GO)分析，發(fā)現(xiàn)不論是在莖干還是葉片中均有大量基因響應(yīng)蔭影而發(fā)生表達(dá)水平的改變.其中，在莖中檢測到1 583個(gè)基因在蔭影處理后顯著上調(diào)，并在GO分析中富集到與細(xì)胞壁合成有關(guān)的GO條目(圖2(a))，符合莖在蔭影下伸長的表型數(shù)據(jù)；在葉中檢測到1 307個(gè)基因在蔭影處理后顯著下調(diào)，并在GO分析中富集到與光合作用及葉綠素有關(guān)的GO條目(圖2(b))，這也符合蔭影下葉片中葉綠素減少的變化.進(jìn)一步地，我們根據(jù)GO分析的結(jié)果以及番茄在蔭影下出現(xiàn)的表型，針對(duì)相關(guān)基因的表達(dá)水平進(jìn)行了實(shí)時(shí)定量PCR分析.由于植物激素生長素在促進(jìn)植物伸長生長中發(fā)揮重要的功能[5,38]，而細(xì)胞壁松弛和伸展相關(guān)的木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)糖苷酶/水解酶XTH基因家族能通過調(diào)控細(xì)胞壁的形成來影響植物的伸長生長[39]，因此我們對(duì)MM中生長素響應(yīng)基因IAA4/IAA7/IAA17和伸長相關(guān)基因XTH9的表達(dá)水平進(jìn)行分析.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蔭影下這4個(gè)基因在番茄第一節(jié)間中的表達(dá)水平顯著提升(圖2(c))，但是它們在真葉中受到蔭影調(diào)控的變化不顯著(圖2(d))，說明蔭影下生長素響應(yīng)和細(xì)胞壁合成相關(guān)基因主要影響了節(jié)間的伸長情況.同時(shí)我們也對(duì)花青素合成基因DFR/ANS的表達(dá)水平進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，不論在葉片和還是節(jié)間中，這2個(gè)基因的表達(dá)水平都被蔭影大幅度抑制(圖2(c～d))，從而導(dǎo)致蔭影下花青素含量減少的表型.這6個(gè)基因的表達(dá)變化趨勢與Microarray數(shù)據(jù)相符.通過上述結(jié)果可知，在蔭影下番茄促進(jìn)伸長的基因大量表達(dá)，而葉綠素相關(guān)基因和調(diào)控花青素合成的基因表達(dá)被抑制，從而導(dǎo)致其表現(xiàn)出蔭影下節(jié)間快速伸長而葉綠素、花青素含量降低的表型.

圖2 蔭影處理下番茄轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析及節(jié)間和真葉中相關(guān)基因的表達(dá)水平Fig.2 GO analysis of transcriptome data and expression levels of related genes in tomato internode and leaf after shade treatment白光下(R/FR=4.6)生長24 d的番茄轉(zhuǎn)到蔭影下(R/FR=0.05)處理4 d后(a)莖中顯著上調(diào)基因和(b)葉中顯著下調(diào)基因的生物學(xué)過程GO分析.白光和蔭影下MM中生長素響應(yīng)基因IAA4/IAA7/IAA17、促進(jìn)伸長基因XTH9及花青素合成基因DFR/ANS在(c)節(jié)間和(d)真葉中的相對(duì)表達(dá)水平.將白光(WL)下生長21 d的番茄幼苗轉(zhuǎn)入蔭影(SH)處理6 d或在白光下繼續(xù)生長6 d后取樣檢測(通過t-test檢驗(yàn)分析顯著性差異，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)；光條件WL： 紅光20 μmol·m-2·s-1，藍(lán)光20 μmol·m-2·s-1，遠(yuǎn)紅光5 μmol·m-2·s-1，SH： 紅光20 μmol·m-2·s-1，藍(lán)光20 μmol·m-2·s-1，遠(yuǎn)紅光60 μmol·m-2·s-1.

2.3 光受體參與調(diào)控番茄幼苗的避蔭反應(yīng)

由于光受體是接收光照、感知光條件變化的重要感受器，因此在確認(rèn)了蔭影下番茄幼苗的節(jié)間長度以及葉綠素和花青素含量的相關(guān)表型后，我們對(duì)番茄紅光、遠(yuǎn)紅光、藍(lán)光光受體的突變體進(jìn)行了表型檢測(圖3(a)，見第746頁).結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)進(jìn)行6 d的蔭影處理后，friop、friself、phyB2、cry14個(gè)突變體均表現(xiàn)出了被蔭影顯著誘導(dǎo)的節(jié)間伸長的表型.tri/phyB1突變體在白光下具有更長的節(jié)間，喪失了蔭影誘導(dǎo)的進(jìn)一步伸長(圖3(c)，見第746頁)，這表明phyB1在調(diào)控蔭影下番茄的節(jié)間伸長方面發(fā)揮著一定的作用.同時(shí)，相較于對(duì)照組MM，不論在白光還是蔭影下光受體突變體中的真葉葉綠素含量均有所降低，

但依舊展現(xiàn)出對(duì)蔭影的響應(yīng)(圖3(d))，說明蔭影影響了葉片中葉綠素的合成等生理活動(dòng)，并且phyA、phyB1、phyB2、cry1這幾個(gè)光受體均參與調(diào)控這一過程.對(duì)花青素含量的檢測發(fā)現(xiàn)，friop、friself、phyB2這3種突變體具有對(duì)蔭影的響應(yīng)，并且在蔭影下含量進(jìn)一步降低，而在tri/phyB1突變體中花青素含量在蔭影下沒有顯著的改變，同樣，在cry1中花青素含量也喪失了響應(yīng)蔭影的變化(圖3(e))，這些結(jié)果說明phyB1和cry1也可能參與調(diào)控了蔭影下花青素的含量變化.

此外，由于花青素的含量受到了蔭影的調(diào)控，我們也對(duì)花青素及色素相關(guān)突變體在蔭影下的表型進(jìn)行了檢測(圖3(b)).結(jié)果發(fā)現(xiàn)： 它們的第一節(jié)間長度在蔭影下的變化趨勢和對(duì)照組AC類似，各類色素相關(guān)突變體均表現(xiàn)出了響應(yīng)蔭影處理的節(jié)間伸長，且除a外，其他4個(gè)突變體的節(jié)間長度均被蔭影顯著誘導(dǎo)(圖3(f)).葉綠素的含量在a、al、aw、ag中的水平與對(duì)照組AC類似，而在hp-1突變體中明顯減少，但它們?nèi)匀痪哂许憫?yīng)蔭影降低的表型(圖3(g)).在花青素突變體中花青素的水平極低，且除了hp-1突變體外均喪失了對(duì)蔭影的響應(yīng)(圖3(h)).由于花青素突變體的節(jié)間長度和葉綠素含量依舊有響應(yīng)蔭影的顯著改變，說明調(diào)控花青素和葉綠素的途徑并不互相影響.以上的結(jié)果表明，光受體在番茄幼苗對(duì)蔭影的響應(yīng)中發(fā)揮一定的功能，并且phyB1可能起主要作用.

圖3 光敏色素突變體和花青素突變體在蔭影下的表型Fig.3 Phenotypes of phytochrome mutants and anthocyanin mutantsunder white light(WL) and shade(SH)(a) 光敏色素突變體在白光或蔭影下的表型圖;(b) 花青素突變體在白光或蔭影下的表型圖；(c) 光敏色素突變體第一節(jié)間長度、(d) 第一對(duì)真葉中的葉綠素含量、(e) 花青素含量；(f) 花青素突變體第一節(jié)間長度、(g) 第一對(duì)真葉中的葉綠素含量、(h) 花青素含量；數(shù)據(jù)通過t-test檢驗(yàn)分析顯著性差異，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；將白光(WL)下生長21 d的番茄幼苗轉(zhuǎn)入蔭影(SH)處理6 d或在白光下繼續(xù)生長6 d后取樣檢測；光條件WL： 紅光20 μmol·m-2·s-1，藍(lán)光20 μmol·m-2·s-1，遠(yuǎn)紅光5 μmol·m-2·s-1，SH： 紅光20 μmol·m-2·s-1，藍(lán)光20 μmol·m-2·s-1，遠(yuǎn)紅光60 μmol·m-2·s-1.每種處理?xiàng)l件的n>16，進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù).葉綠素含量為spad值，花青素含量=(A530-A657)/m鮮葉).

2.4 底部補(bǔ)光可以減弱番茄幼苗的避蔭反應(yīng)

為了探尋減弱番茄避蔭反應(yīng)的方法，我們對(duì)處于蔭影環(huán)境下的番茄在底部補(bǔ)充額外的LED光源，檢測該方法是否可以恢復(fù)番茄幼苗在蔭影下表現(xiàn)出的過度伸長的節(jié)間和降低的葉綠素、花青素含量的表型.由于紅光對(duì)于番茄的生長十分重要，并且phyB1作為一種紅光光受體可能參與了番茄幼苗對(duì)于蔭影的響應(yīng)，因此我們首先選擇紅光作為底部補(bǔ)光的光源，在對(duì)白光下生長21 d的番茄進(jìn)行蔭影處理的同時(shí)進(jìn)行底部補(bǔ)光，并通過梯度改變光強(qiáng)來尋找最佳的補(bǔ)光條件.對(duì)第一節(jié)間長度、葉綠素和花青素含量的檢測(圖4(a～c))發(fā)現(xiàn)，對(duì)蔭影下的番茄使用20～50 μmol·m-2·s-1的紅光進(jìn)行底部補(bǔ)光后，MM和AC兩種品種的番茄避蔭反應(yīng)均被一定程度地減弱.其中葉綠素含量的恢復(fù)最為明顯，當(dāng)補(bǔ)充的紅光強(qiáng)度在40 μmol·m-2·s-1及以上時(shí)，可以將蔭影下生長的番茄幼苗真葉中的葉綠素含量恢復(fù)到白光下的水平(圖4(b)).其次，第一節(jié)間長度(圖4(a))和花青素含量(圖4(c))在底部補(bǔ)光后的表型也得到了部分恢復(fù)，雖然在光強(qiáng)提高到

圖4 底部補(bǔ)光后蔭影下的番茄表型Fig.4 Phenotypes under the shade with the supplemental light at the bottom 底部補(bǔ)充額外紅光下番茄(a) 第一節(jié)間長度、(b) 真葉葉綠素含量、(c) 花青素含量；(d) 底部補(bǔ)充額外藍(lán)光時(shí)MM第一節(jié)間長度、真葉葉綠素、花青素含量，通過t-test檢驗(yàn)分析各組間的顯著性差異；將白光(WL)下生長21 d的番茄幼苗轉(zhuǎn)入蔭影(SH)處理6 d同時(shí)底部補(bǔ)充紅光或藍(lán)光(SH-R/SH-B)，或在白光下繼續(xù)生長6 d后取樣檢測；光條件WL： 紅光20 μmol·m-2·s-1，藍(lán)光20 μmol·m-2·s-1，遠(yuǎn)紅光5 μmol·m-2·s-1，SH： 紅光20 μmol·m-2·s-1，藍(lán)光20 μmol·m-2·s-1，遠(yuǎn)紅光60 μmol·m-2·s-1.每種處理?xiàng)l件的n>10，進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù).葉綠素含量為spad值，花青素含量=(A530-A657)/m鮮葉.

50 μmol·m-2·s-1時(shí)也不能完全達(dá)到白光下的生長水平，但是相較于生長在蔭影下的番茄，表型已有了明顯的改善.此外，由于植物也可以吸收藍(lán)光進(jìn)行光合作用為自身生長提供能量，因此我們也選用了30～40 μmol·m-2·s-1強(qiáng)度的藍(lán)光作為底部補(bǔ)光光源，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)MM補(bǔ)充藍(lán)光同樣可以減弱番茄對(duì)蔭影的響應(yīng)(圖4(d))，但是同等強(qiáng)度下紅光的作用更為明顯.因此，使用一定強(qiáng)度的紅光進(jìn)行底部補(bǔ)光可以作為改善高密度種植下番茄生長情況的一種方法.

3 討 論

隨著世界人口的增長和農(nóng)耕土地面積的減少，提高單位面積作物的產(chǎn)量成為當(dāng)前亟待解決的難題，而高密度種植導(dǎo)致的避蔭反應(yīng)則是限制農(nóng)業(yè)單位產(chǎn)量的重要因素之一，例如玉米[6]、小麥[7]、水稻[8]等糧食作物，當(dāng)種植密度過高時(shí)它們的單位產(chǎn)量都明顯降低.番茄是一種重要的農(nóng)作物，它的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)環(huán)境對(duì)于其作物產(chǎn)量和果實(shí)品質(zhì)等方面都有著重要的影響，過高的種植密度會(huì)影響它的生長和產(chǎn)量[16].和模式植物擬南芥類似，番茄也會(huì)通過光敏色素感知蔭影，并產(chǎn)生顯著的表型變化，但與擬南芥不同的是，番茄的葉片形態(tài)為羽狀復(fù)葉，在感受到蔭影來臨時(shí)，番茄的葉面積會(huì)增大.此外番茄具有果實(shí)，在成熟階段番茄果實(shí)中的色素含量也會(huì)受到光條件的影響.同時(shí)，由于番茄植株具有節(jié)間，當(dāng)R/FR發(fā)生變化時(shí)，節(jié)間的快速伸長可以很好地表征番茄的避蔭反應(yīng)情況.針對(duì)番茄在蔭影下的蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，與日光生長相比，有47個(gè)蛋白的表達(dá)水平在蔭影下顯著下調(diào)，其中包括決定光合作用中碳同化速率的關(guān)鍵酶Rubisco、一些ATP酶及與代謝及呼吸相關(guān)的蛋白，這說明當(dāng)植物感受到蔭影后會(huì)將所有可利用的能量投入到節(jié)間和莖干的伸長中[40].

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在蔭影下生長的番茄幼苗表現(xiàn)出了明顯的節(jié)間伸長以及葉片花青素、葉綠素減少的表型，并且轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平的檢測結(jié)果表明，促進(jìn)伸長的相關(guān)基因在節(jié)間中的表達(dá)水平顯著上調(diào)，尤其是一些生長素響應(yīng)基因；而不論在節(jié)間中還是葉片中，調(diào)控花青素合成的基因表達(dá)都在蔭影下被顯著抑制，這些基因表達(dá)水平的變化與表型變化相吻合.不同突變體在蔭影下的表型顯示光受體在番茄幼苗對(duì)蔭影的響應(yīng)中發(fā)揮重要的功能，phyB1可能起主要作用.同時(shí)，對(duì)處于蔭影下的番茄進(jìn)行底部補(bǔ)光處理，結(jié)果表明，在底部提供額外的光源可以使番茄的避蔭表型減緩，葉綠素含量能夠恢復(fù)到白光下的水平，節(jié)間長度和花青素含量也得到了部分的恢復(fù).因此該方法可以為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中高密度種植的番茄改善光照條件.通過梯度實(shí)驗(yàn)對(duì)比，我們認(rèn)為補(bǔ)充紅光的效果比藍(lán)光更好，且最適宜的底部補(bǔ)光光強(qiáng)為40 μmol·m-2·s-1.

相較于底部補(bǔ)光，頂部補(bǔ)光的方法在種植密度高時(shí)收效甚微，由于上層葉片的遮擋，下層葉片依舊處于蔭影中，其接收到光強(qiáng)增長并不明顯，而底部補(bǔ)光則可以保證位于下方的葉片接收到充足的光照，葉片背部具有少量的葉綠素，能夠?qū)φw的光合作用作出貢獻(xiàn).同時(shí)我們觀察到，生長于蔭影加底部補(bǔ)光條件下的番茄與生長于白光下的番茄相比，雖然節(jié)間更長，但同時(shí)它的莖干也更粗壯、葉面積更大，整體生長狀態(tài)優(yōu)于僅有上方光源的番茄.這可能是由于底部補(bǔ)光導(dǎo)致植物接收到的總光強(qiáng)變高，植物對(duì)光能的吸收和光合效率有所提高導(dǎo)致的，該表型也和之前的研究結(jié)果[32]一致.同時(shí)，已有報(bào)道稱番茄的葉形與葉面積同樣會(huì)影響其光合作用及果實(shí)產(chǎn)量與品質(zhì)[15]，更寬大的葉子不僅可以提高產(chǎn)量，還可以促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)和糖分的積累，從而提高口感[41]，因此，底部補(bǔ)光的方法不僅能夠優(yōu)化番茄生長狀態(tài)，還可能提高果實(shí)的品質(zhì).此外，頂部補(bǔ)光的方法僅能應(yīng)用于大棚種植培養(yǎng)，而不適用于大田作物，底部補(bǔ)光的操作則更為簡便易行.對(duì)于在大棚溫室中生長的作物，可以在底部鋪上不同顏色的反光膜，并在溫室兩側(cè)予以光照，利用反光膜將光源照射到作物底部，從而達(dá)到補(bǔ)光效果；在大田中種植時(shí)可以將LED光源直接架設(shè)于作物下方進(jìn)行補(bǔ)光，或者在田間鋪設(shè)反光膜，對(duì)陽光進(jìn)行反射，從而達(dá)到底部補(bǔ)光的目的.

The Characteristics of Tomato Seedlings in Shade and thePreliminary Study of the Effect on Seedlings withSupplemental Light at the Bottom