黃寶麗，黃雪瀅，許秋芳，徐慧麗，王永珍，杜建鋼

先兆子癇（preeclampsia，PE）是初產(chǎn)婦最常見的一種妊娠期疾病，常伴機體多系統(tǒng)功能損害，導致母體易出現(xiàn)嚴重心腦血管并發(fā)癥，并使新生兒出現(xiàn)低出生體重、發(fā)育不成熟等方面的不足，是造成產(chǎn)婦以及圍產(chǎn)兒死亡的重要原因之一［1］。腦源性神經(jīng)細胞營養(yǎng)因子（BDNF）是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族中的重要成員，研究表明，BDNF不僅能促進神經(jīng)元的發(fā)育和分化、細胞存活及突觸可塑性，同時具有抗凋亡、抗氧化、抑制自噬等神經(jīng)保護作用［2-4］。除此之外，還可以在妊娠期期間調(diào)節(jié)胎盤中的血管變化，促進血管生成，胎盤發(fā)育和胎兒生長［5］。BDNF的表達受氧化應激和炎癥反應的調(diào)節(jié)，同時又調(diào)節(jié)炎癥反應，其濃度的改變可能參與了PE的發(fā)病機制［6］。本研究通過檢測PE患者及健康孕產(chǎn)婦血清中BDNF水平及其單個核細胞mRNA的表達，評估BDNF在先兆子癇患者診斷中的價值。

1 對象與方法

1.1 對象 選取2018年11月～2019年4月蘇州市立醫(yī)院本部入院的PE患者及健康孕婦各45例為研究對象。其中，PE組年齡21～43歲，平均年齡（29.89±5.02）歲，孕周25～40周，平均孕周（33.71±4.04）周。納入標準：采用《婦產(chǎn)科學》診斷標準，妊娠20周后出現(xiàn)收縮壓≥140 mmHg和（或）舒張壓≥90 mmHg伴蛋白尿≥0.3 g/24 h，或隨機尿蛋白（+）［7］。排除標準：合并慢性高血壓病、糖尿病、肝腎等臟器功能障礙、感染性疾病等并發(fā)癥。健康孕婦45例為對照組，年齡20～38歲，平均年齡（30.02±4.40）歲，孕周24～40周，平均孕周（35.31±4.13）周。PE期組與對照組年齡及孕周差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。兩組基本資料比較見表1。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準同意。

表1 PE組與對照組基本資料比較（±s）

表1 PE組與對照組基本資料比較（±s）

項目 收縮壓（mmPE組 對照組 t值 P值Hg） 149.56±13.85 121.76±12.48 10.002 0.000舒張壓（mmHg） 94.53±12.30 72.30±7.30 10.518 0.000 BMI（kg/m2） 28.51±3.20 26.31±3.77 2.990 0.004

1.2 主要儀器及試劑KDC-2046低速冷凍離心機（合肥中科中佳），SC-3610臺式低速離心機（合肥中科中佳）,eppendorf-centrifuge 5430R低溫高速離心機（德國eppendorf公司），酶標儀Magellan for F50（奧地利TECAN公司），GeneAmp PCR System擴增儀（美國ABI公司），Step One實時熒光定量PCR擴增儀（美國ABI公司），eppendorf-centrifuge 5430R低溫高速離心機（德國eppendorf公司）；人BDNF ELISA試劑盒（武漢博士德公司），F(xiàn)icoll淋巴細胞分離液（上海恒信化學試劑有限公司），TRNzol Universal總RNA提取試劑 （北京天根公司），F(xiàn)astKing RT SuperMix cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京天根公司），SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）試劑盒（北京天根公司）。

1.3 樣本采集及保存 于患者入院時抽取空腹靜脈血，EDTA-K2抗凝血（紫色管）2.0 ml和黃色分離膠真空促凝管4 ml。黃色促凝管常溫靜置30 min后，以離心半徑17.0 cm、3 500 r/min離心10 min，取上清分裝保存于-80℃冰箱備用。操作于標本采集2 h內(nèi)完成。

1.4 檢測方法

1.4.1 血清BDNF的檢測 依照BDNF ELISA試劑盒說明書操作測定血清BDNF含量。

1.4.2 BDNF mRNA的檢測

1.4.2.1 外周血單個核細胞的分離 將稀釋好的外周血用一次性滴管吸取后，沿管壁緩慢加入準備好的3 ml Ficoll淋巴細胞分離液。水平離心機（離心半徑16.0 cm）500×g離心20 min。吸取中間云霧狀白膜層單個核細胞，加入1.5 ml離心管中，以離心半徑11.0 cm、10 000 r/min離心1.5 min，棄上清。加入1 ml生理鹽水，混勻后10 000 r/min，離心1.5 min，棄上清。加入1 ml TRNzol Universal試劑。

1.4.2.2 RNA抽提 依照TRNzol Universal總RNA提取試劑操作說明書進行。應用紫外分光光度計測定RNA在波長260 nm、280 nm的吸光度，A260/A280比值在1.8～2.0之間。

1.4.2.3 cDNA第一鏈合成 利用FastKing RT SuperMix cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈：在50 μL的PCR反應管中加入4 μL 5×FastKing-RT SuperMix，4 μL Total RNA，12 μL RNase-free ddH2O。充分混勻并低速（1 200×g）離心1 min，于PCR擴增儀上42℃15 min，95℃3 min進行反應。

1.4.2.4 PCR反應 使用SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）試劑盒和Step One PCR擴增儀進行實時熒光定量。反應體系：12.5 μL 2×SuperReal PreMix Plus，0.75 μL正向引物（10 uM），0.75 μL反向 引 物（10 uM），2 μL cDNA模 板，2.5 μL 50×ROX Reference Dye△，6.5μL RNase-free ddH2O。BDNF基因的上游引物：5'-AGTGCCGAACTACCCA GTCGTA-3'，下游引物：5'-CTTATGAATCGCCAGCC AATTC-3'，擴增產(chǎn)物長度為98 bp；內(nèi)參基因β-肌動蛋白上游引物：5'-ACCGAGCGCGGCTACAG-3'，下 游 引 物：5'-CTTAATGTCACGCACGATTTCC-3'，擴增產(chǎn)物長度為261 bp［8］。引物由上海閃晶生物技術(shù)研究所合成。擴增條件如下：95℃預變性15 min；95℃10 s，60℃20 s，72℃30 s，共40個循環(huán)。每個標本做3個平行復孔，取Ct平均值。單個樣本BDNF基因表達量用相對β-肌動蛋白的Ct差值表示。差異表達的相對定量分析用2-ΔΔCt法。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，非正態(tài)分布資料兩組樣本間比較采用Mann-Whitney U秩和檢驗，結(jié)果采用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）［M（P25，P75）］表示；正態(tài)分布計量資料兩組樣本間比較采用獨立樣本t檢驗，數(shù)據(jù)采用（±s）表示。采用Pearson相關性分析BDNF與其它臨床參數(shù)間的相關性。采用logistic回歸分析PE與多個危險因素的關系，所有統(tǒng)計學均為雙側(cè)概率檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 PE組與對照組BDNF水平變化PE組與對照組血清BDNF含量及單個核細胞中mRNA相對表達含量2 360.40（1 916.02～2 804.60）pg/ml、1.71±0.76，均低于對照組2 974.67（2 296.17～3 728.67）pg/ml、2.76±0.99，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

2.2 BDNF與PE患者臨床參數(shù)的相關性分析BDNF與患者的孕周、血壓、BMI指數(shù)均無明顯相關性（P＞0.05），血清BDNF與患者年齡呈負相關（P＜0.05）。血清BDNF與單個核細胞mRNA表達正相關（r=0.424，P=0.004）。

2.3 血清BDNF在PE患者中的診斷效能評價 血清BDNF及BDNF mRNA診 斷PE的ROC曲線顯示，二者ROC下面積分別為0.685（0.578，0.779），0.800（0.703，0.877）。

2.4 影響PE的多種危險因素分析 以是否患有PE為應變量Y（有為1，沒有為0），年齡、BMI、收縮壓、舒張壓、血清BDNF含量為自變量（X1-X5），建立回歸方程，logistic回歸分析結(jié)果顯示：收縮壓、舒張壓、BDNF含量是影響PE的危險因素（P＜0.05）。見表2。

表2 PE患者危險因素logistic回歸分析

3 討論

廣義的炎癥反應激活在PE的發(fā)病機制中起重要作用。PE的發(fā)生分為兩個階段，第1階段是胎盤功能障礙，第2階段是由功能障礙的胎盤產(chǎn)生炎性因子，激活全身炎癥反應，進而導致PE的發(fā)生［9］。已有研究顯示，PE患者胎盤BDNF基因表達的下調(diào)，這可能與免疫和氧化/抗氧化機制缺陷以及內(nèi)源性ω-3脂肪酸濃度降低等原因有關［10］；另有研究顯示BDNF可通過缺氧誘導因子-1α誘導血管內(nèi)皮生長因子發(fā)揮作用，在妊娠期間調(diào)節(jié)胎盤中的血管生成［11］。本研究顯示PE患者血清BDNF含量及mRNA表達均明顯低于健康對照組，研究結(jié)果與Perucci等［6］及Cai等［8］的 結(jié) 論 一 致，原 因 可 能 與BDNF的下調(diào)影響PE患者的血管生成因子，以及與氧化應激和炎癥反應的調(diào)節(jié)等機制有關。

另外，本研究對PE患者的臨床資料與BDNF含量做了相關性分析，結(jié)果顯示血清BDNF含量與PE患者的年齡呈負相關，與患者的血壓、BMI指數(shù)均無明顯相關性。Lommatzsch等［12］的研究顯示，血漿中BDNF的水平隨著年齡的增加顯著降低，本研究結(jié)果與其一致，原因可能與年齡會影響前體BDNF向成熟BDNF的轉(zhuǎn)換有關。通過ROC曲線分析血清BDNF及BDNF mRNA診斷PE的效能，二者ROC下面積為分別為0.685，0.800，提示BDNF mRNA的診斷效能較前者高。此外，本研究采用Logistic回歸分析了PE與多個危險因素的關系，結(jié)果顯示血壓升高、BDNF含量下降可能是影響PE的危險因素。

血清BDNF檢測在PE患者的診斷中有一定的價值，其含量降低可能是PE發(fā)病的危險因素之一。BDNF與PE患者的臨床嚴重程度及相關并發(fā)癥如可復性腦損傷等的關系需擴大入組樣本量進行進一步評估，與患者預后監(jiān)測及圍產(chǎn)兒結(jié)局等的相關性需要在此基礎上開展進一步的基礎性研究以及大規(guī)模的前瞻性研究。