吳 瑕，劉秀菊，楊秀嶺，馬穎超，吳 迪（.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院藥學(xué)部，河北 石家莊 050000；.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院檢驗科，河北 石家莊 050000）

達(dá)托霉素是從發(fā)酵的鏈霉菌屬玫瑰色孢子中提取的具有獨特環(huán)狀結(jié)構(gòu)的新型環(huán)脂肽類抗生素[1]，主要通過干擾細(xì)胞膜對氨基酸的轉(zhuǎn)運、阻礙細(xì)菌細(xì)胞壁的生物合成、改變細(xì)胞膜電位等多種機(jī)制破壞細(xì)菌細(xì)胞膜功能，從而對耐甲氧西林和甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌、化膿性鏈球菌、無乳鏈球菌和耐萬古霉素腸球菌等革蘭陽性菌起到殺菌作用，治療成人復(fù)雜性皮膚及軟組織感染、菌血癥和心內(nèi)膜炎[2]，是萬古霉素治療失敗的右心感染性心內(nèi)膜炎的替代藥物[3]。

達(dá)托霉素主要以原型通過腎臟排泄，腎損傷時消除半衰期明顯延長，腎功能異?；颊咝枵{(diào)整給藥劑量[4]。達(dá)托霉素治療不同感染的給藥劑量存在差異，用于皮膚軟組織感染的劑量為4 mg·kg-1·d-1，治療菌血癥及感染性心內(nèi)膜炎劑量為 6 mg·kg-1·d-1，《桑福德抗微生物治療指南》[5]推薦治療耐萬古霉素腸球菌感染劑量為8 ～ 12 mg·kg-1·d-1，不同給藥劑量導(dǎo)致穩(wěn)態(tài)血藥濃度差異較大，且該藥具有潛在的肌肉毒性和腎毒性[6]，因此開展治療藥物監(jiān)測（therapeutic drug monitoring，TDM）可以為臨床安全用藥提供數(shù)據(jù)支持。國內(nèi)外文獻(xiàn)報道中主要采用HPLC法測定發(fā)酵液、原料藥、制劑中的達(dá)托霉素濃度[7-11]，但檢測人血漿中藥物濃度的報道較少，本研究擬建立一種簡單快捷、經(jīng)濟(jì)實用的HPLC法檢測患者血漿中達(dá)托霉素的濃度，旨為臨床患者進(jìn)行TDM提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695高效液相色譜儀（配2489型紫外檢測器），Diamonsil C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；低溫冷藏箱（MDF-U2086S，日本三洋公司）；渦旋混合器（XW-80A，上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）；高速離心機(jī)（離心半徑50 mm，美國ABBOTT）；冷藏柜（YC-180，澳柯瑪公司）；電子分析天平（CPA225D，德國Sartorius公司）；臺式酸度測定儀（pH 213，意大利HANNA公司）

1.2 試藥

達(dá)托霉素對照品（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號：683190401RS，含量93.9%）；卡馬西平對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100142-201706，含量100.0%）；人血漿由河北省血液中心提供；乙腈（賽默飛世爾科技有限公司，批號：25962，分析純）；其他試劑均為分析純；水為蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Diamonsil C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-100 mmoL·L-1磷酸二氫銨溶液（38∶62，v/v，pH = 3.5）；流速1.0 mL·min-1；柱溫30 ℃；檢測波長214 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 溶液配制

2.2.1 達(dá)托霉素對照品儲備液取達(dá)托霉素2.13 mg精密稱定，置于5 mL容量瓶中，用50%甲醇溶解定容，配制成含達(dá)托霉素400 μg·mL-1的儲備液，置于4 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 卡馬西平對照品儲備液取卡馬西平1.25 mg精密稱定，置于25 mL容量瓶中，用50%甲醇溶解定容，配制成含卡馬西平50 μg·mL-1的儲備液，于4 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 血樣處理

在1.5 mL離心管中加入100 μL血漿及10 μL內(nèi)標(biāo)卡馬西平溶液，加入300 μL乙腈沉淀蛋白，13 000 r·min-1離心10 min，取上清液進(jìn)行分析。

2.4 方法專屬性考察

取人空白血漿、人空白血漿+達(dá)托霉素對照品、人空白血漿+達(dá)托霉素對照品+內(nèi)標(biāo)馬卡西平，渦旋混勻，分別按“2.3”項下方法處理后分析并記錄色譜圖。結(jié)果顯示達(dá)托霉素及內(nèi)標(biāo)卡馬西平峰形良好，與人空白血漿中內(nèi)源物質(zhì)分離良好，保留時間分別為10.19、15.84 min。見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A - 人空白血漿，B - 人空白血漿+達(dá)托霉素，C - 人空白血漿+達(dá)托霉素+卡馬西平；1 - 達(dá)托霉素，2 - 卡馬西平Fig 1 HPLC chromatogramA - human blank plasma, B - human blank plasma + daptomycin, C -human blank plasma + daptomycin + carbamazepine; 1 - daptomycin,2 - carbamazepine

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢測限、定量下限

用50%甲醇溶液將達(dá)托霉素儲備液稀釋至不同濃度，分別取20 μL置于1.5 mL離心管中氮氣吹干，加入200 μL空白血漿及25 μg·mL-1內(nèi)標(biāo)卡馬西平溶液20 μL，制成80、40、20、10、5、2 μg·mL-1達(dá)托霉素血漿樣品，加入600 μL乙腈沉淀蛋白，渦旋混合2 min，13 000 r·min-1離心10 min，取上清液常溫氮氣揮干，加流動相200 μL復(fù)溶，取10 μL進(jìn)行HPLC測定，記錄色譜圖。以待測物濃度（X）為橫坐標(biāo)，待測物與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值（Y）為縱坐標(biāo)，用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行回歸運算，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y= 0.025 4X+ 0.059 9，r= 0.999 8，表明達(dá)托霉素在2 ～ 80 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢測限（S/N = 3）為0.5 μg·mL-1，定量下限（S/N = 10）為1 μg·mL-1。

2.6 精密度試驗

取人空白血漿，制備低、中、高（5、20、60 μg·mL-1）濃度達(dá)托霉素血漿樣品各5份，在同一天內(nèi)處理并分析，計算日內(nèi)精密度；連續(xù)3 d處理并分析，計算日間精密度。結(jié)果顯示日內(nèi)精密度RSD分別為3.58%、2.46%、5.37%，日間精密度RSD分別為4.16%、3.28%、6.50%。

2.7 回收率試驗

2.7.1 提取回收率取人空白血漿，制備低、中、高（5、20、60 μg·mL-1）濃度達(dá)托霉素血漿樣品各5份，按“2.3”項下方法處理后分析，測得的峰面積與相應(yīng)濃度達(dá)托霉素對照品溶液直接進(jìn)樣所得的峰面積之比為提取回收率，分別為96.4%、102.3%、99.9%，RSD分別為3.6%、6.1%、5.2%。制備卡馬西平血漿樣品，按“2.3”項下方法處理后分析，內(nèi)標(biāo)峰面積與相應(yīng)濃度的內(nèi)標(biāo)溶液直接進(jìn)樣所得峰面積之比為內(nèi)標(biāo)的提取回收率，為94.7%，RSD為8.1%。

2.7.2 方法回收率取人空白血漿，制備低、中、高（5、20、60 μg·mL-1）濃度達(dá)托霉素血漿樣品各5份，分別按“2.3”項下方法處理后分析，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計算真實濃度，真實濃度與理論濃度之比為方法回收率，分別為89.4%、82.2%、87.6%，RSD分別為2.6%、4.2%、5.1%。

2.8 穩(wěn)定性試驗

取人空白血漿，制備低、中、高（5、20、60 μg·mL-1）濃度達(dá)托霉素血漿樣品各5份，按“2.3”項下方法處理后室溫放置0、1、2、4、12 h后進(jìn)行分析，考察室溫放置穩(wěn)定性。于-40 ℃冰箱低溫保存5 d，按相應(yīng)方法處理后分析，考察低溫保存穩(wěn)定性。反復(fù)凍融3次，按相應(yīng)方法處理后分析，考察反復(fù)凍融穩(wěn)定性。結(jié)果表明上述條件下樣品均穩(wěn)定，RSD均< 10%。

2.9 方法學(xué)應(yīng)用

選取6例使用了達(dá)托霉素的臨床患者（男性2例，女性4例），在血藥濃度達(dá)到穩(wěn)態(tài)后，于次日給藥前30 min抽取靜脈血3 mL測定血藥濃度，濃度范圍為8.25 ～42.27 μg·mL-1，所建方法能夠滿足患者血漿中達(dá)托霉素濃度檢測要求。見表1。

表1 達(dá)托霉素血藥濃度測定結(jié)果Tab 1 Results of daptomycin blood concentration

3 討論

目前國內(nèi)外已有LC-MS/MS法測定達(dá)托霉素血藥濃度的報道[12-14]，可以快速測定更低的藥物濃度。該藥屬于濃度依賴性抗生素，血藥峰濃度58 μg·mL-1[4]，血藥濃度決定抗菌療效，藥物濃度過低無法有效殺菌，因此低濃度的檢測價值有待考量；且LC-MS/MS成本昂貴，很多醫(yī)療機(jī)構(gòu)未配備質(zhì)譜儀，不利于TDM和臨床藥學(xué)服務(wù)的開展。本文建立了一種簡單、經(jīng)濟(jì)的HPLC測定法，更適用于達(dá)托霉素的血藥濃度檢測和藥代動力學(xué)研究。

實驗過程中對比了乙腈-水、乙腈-醋酸銨、乙腈-磷酸鹽緩沖液等多種系統(tǒng)，參考相關(guān)研究[15]報道的乙腈-200 mmoL·L-1磷酸鹽緩沖液，但鹽溶液濃度過高容易堵塞色譜柱，最終選擇乙腈-100 mmoL·L-1磷酸二氫銨（pH = 3.5）作為流動相。實驗采用50%甲醇溶液配制達(dá)托霉素工作液，防止玻璃器皿和聚丙烯試管對藥物的吸附[16]，降低實驗誤差。

達(dá)托霉素具有水溶性、分子量大、表觀分布容積?。s0.1 L·kg-1）等藥代動力學(xué)特點，主要分布于血漿和間質(zhì)液中，與血漿白蛋白廣泛可逆性結(jié)合（血漿蛋白結(jié)合率90% ～ 93%），當(dāng)患者處于重癥感染、低蛋白血癥、循環(huán)血量變化等特殊病理生理狀態(tài)下，表觀分布容積明顯增加[4]，易造成血藥濃度波動大。一項在重癥患者中進(jìn)行的PK/PD研究證實，治療MIC≥1 mg·L-1的細(xì)菌感染，當(dāng)肌酐清除率> 60 mL·min-1或肌酐清除率較低但接受連續(xù)腎臟替代治療時，給予4 mg·kg-1·d-1和6 mg·kg-1·d-1標(biāo)準(zhǔn)劑量有效達(dá)標(biāo)率較低，需增加給藥劑量，TDM可協(xié)助臨床優(yōu)化給藥劑量，提高抗感染療效[17]。本研究采用所建方法測定了6例臨床患者的達(dá)托霉素血藥濃度，檢測結(jié)果在研究線性范圍內(nèi)，方法準(zhǔn)確精密、操作簡便，滿足TDM的要求，可為臨床安全、有效用藥提供參考。