呂 娟，陳莉娜，劉偉華，郭未艷（.西安市第一醫(yī)院藥劑科，陜西 西安 7000；.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，陜西 西安7006；.西安市第一醫(yī)院兒科，陜西 西安 7000）

糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）是胰島素分泌和（或）作用缺陷所引起的一種慢性代謝性疾病[1]。中國是世界上糖尿病發(fā)病率上升最快的國家之一，目前我國糖尿病的發(fā)病率已高達(dá)10.9%[2]。肥胖和血脂代謝紊亂是糖尿病常見的并發(fā)癥，也是多種疾病發(fā)病的重要危險(xiǎn)因素[2-3]。因此，肥胖和血脂代謝紊亂防治對于延緩糖尿病進(jìn)展及其并發(fā)癥的發(fā)生具有重要意義。

利拉魯肽是胰高血糖素樣肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）類似物的一種，與人GLP-1具有97%的序列同源性[3]。文獻(xiàn)[3-4]報(bào)道，GLP-1及其類似物除了具有降糖作用外，還具有減輕體重和改善血脂紊亂的作用，但其分子作用機(jī)制目前仍不明確。本研究以自發(fā)性糖尿病KKAy小鼠為動物模型，探討利拉魯肽對KKAy小鼠脂代謝及肝臟PI3K蛋白表達(dá)的影響，以期為探討利拉魯肽調(diào)節(jié)脂代謝的作用機(jī)制提供藥理學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級雄性KKAy小鼠12只，體重30 ～ 35 g；雄性C57BL/6J小鼠6只，體重20 ～ 25 g，兩種小鼠均購自北京華阜康生物科技股份有限公司，動物合格證號：SCXK（京）2014-0004。KKAy小鼠給予高脂飼料，C57BL/6J小鼠給予普通小鼠維持飼料。所有小鼠均可自由進(jìn)食、飲水；室溫控制在20 ～ 25 ℃，相對濕度維持在45% ～ 55%。

1.2 主要試劑與儀器

利拉魯肽注射液（丹麥諾和諾德公司，規(guī)格：3 mL∶18 mg，批號EP51548-1）；總膽固醇、甘油三脂試劑盒（南京建成生物工程研究所）；PI3K抗體（英國Abcam公司）；免疫組化試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；羅氏卓越型血糖儀及血糖試紙（德國Roche Diagnostics GmbH有限公司）；Multiskan FC酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分組及給藥所有小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，稱量體重，剪尾采血測定隨機(jī)血糖。KKAy小鼠隨機(jī)血糖> 16.7 mmol·L-1認(rèn)為模型成功。12只KKAy小鼠按體重、血糖隨機(jī)分為利拉魯肽組、模型組，每組6只，給予高脂飼料喂養(yǎng)；C57BL/6J小鼠6只作為對照組，給予普通飼料喂養(yǎng)。分組時小鼠體重和血糖情況見表1。利拉魯肽組予利拉魯肽注射液（250 μg·kg-1，ih），對照組和模型組小鼠皮下注射等量的生理鹽水，各組小鼠每天給藥1次，持續(xù)給藥6周。末次給藥后稱重小鼠并放入代謝籠，測定進(jìn)食及飲水量。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，稱重小鼠，眼眶采血，離心（3000 r·min-1，10 min）取上清液，血清保存至-80 ℃冰箱備測。采血完畢后，分離肝臟，將所取肝臟組織稱重后固定在10%甲醛溶液中保存?zhèn)錅y。

1.3.2 指標(biāo)檢測①代謝籠實(shí)驗(yàn)：小鼠給藥后稱重放入代謝籠，給予定量的飼料和水，24 h后從代謝籠中取出小鼠，測定剩余飼料和水的量，計(jì)算小鼠24 h進(jìn)食量及飲水量。②肝臟指數(shù)[5]：肝臟指數(shù)=肝臟重量/小鼠體重×100%。③總膽固醇（total cholesterol，TC）及甘油三酯（triglyceride，TG）檢測：按照試劑盒說明書檢測。④HE染色切片：從甲醛固定液中取出肝臟組織，石蠟包埋后常規(guī)切片，HE染色、封片，光鏡下觀察肝臟組織病理變化。⑤肝臟組織中PI3K的表達(dá)：肝臟組織石蠟包埋后切片，山羊血清封閉，一抗、二抗孵育，DAB顯色，中型樹膠封片，光鏡下觀察，拍照，對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，P< 0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 利拉魯肽對KKAy小鼠進(jìn)食、飲水量的影響

給藥后，與對照組相比，模型組和利拉魯肽組小鼠的進(jìn)食及飲水量明顯增加（P< 0.05）；與模型組相比，利拉魯肽組小鼠的飲水量明顯減少（P< 0.05），進(jìn)食量雖有減少但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P> 0.05）。見表2。

2.2 利拉魯肽對KKAy小鼠肝臟重量及肝臟指數(shù)的影響

給藥后，與對照組相比，模型組和利拉魯肽組小鼠的肝臟重量及肝臟指數(shù)顯著增加（P< 0.05）；與模型組相比，利拉魯肽組小鼠的肝臟重量及肝臟指數(shù)明顯下降，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05）。結(jié)果表明利拉魯肽可減少KKAy小鼠肝臟脂肪沉積。見表3。

2.3 利拉魯肽對KKAy小鼠血清中TC及TG的影響

給藥后，與對照組相比，模型組和利拉魯肽組小鼠的血清TC和TG含量顯著增加（P< 0.05）；與模型組相比，利拉魯肽組TC和TG含量雖有下降趨勢但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P> 0.05）。見表4。

2.4 利拉魯肽對KKAy小鼠肝臟組織形態(tài)的影響

HE結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組肝細(xì)胞腫脹、空泡樣變（主要為脂肪變性），以小葉周邊部最明顯。與模型組相比，利拉魯肽組肝細(xì)胞腫脹程度減輕，空泡樣變減少，細(xì)胞核增多，炎癥減輕。結(jié)果表明，利拉魯肽可以減輕KKAy小鼠肝臟損傷。

2.5 利拉魯肽對KKAy小鼠肝臟PI3K蛋白表達(dá)的影響

免疫組化結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組和利拉魯肽組小鼠肝臟PI3K蛋白表達(dá)明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05）；與模型組相比，利拉魯肽組PI3K蛋白表達(dá)顯著增加（P< 0.05）。結(jié)果表明利拉魯肽可提高KKAy小鼠肝臟組織PI3K蛋白的表達(dá)。見表5。

表5 利拉魯肽對KKAy小鼠肝臟PI3K蛋白表達(dá)的影響. n = 6Tab 5 Effects of liraglutide on the expression of PI3K protein in liver tissue of KKAy mice. n = 6

3 討論

利拉魯肽注射液于2009年在歐盟首次上市，以濃度依賴形式促進(jìn)胰島素分泌，并可通過調(diào)節(jié)機(jī)體分泌胃泌素及胰高血糖素來發(fā)揮降糖作用[4,6]。有研究[7]表明，GLP-1可通過增加飽腹感和減少饑餓感來減少能量攝入，從而達(dá)到減重的目的。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，利拉魯肽可減輕KKAy小鼠體重，改善其胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)[8]。在本研究中，研究者運(yùn)用代謝籠實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了利拉魯肽對KKAy小鼠進(jìn)食及飲水情況的影響，結(jié)果提示利拉魯肽可減少KKAy小鼠的進(jìn)食及飲水量。

肝臟是糖脂代謝的重要器官，脂代謝紊亂可導(dǎo)致脂肪在肝細(xì)胞內(nèi)異常沉積從而誘發(fā)肝臟損傷[9-10]。肝臟重量和肝臟指數(shù)是衡量脂肪在肝臟沉積的重要指標(biāo)[11]。本研究結(jié)果顯示，KKAy小鼠的肝臟重量與肝臟指數(shù)較對照組明顯增加，但經(jīng)過利拉魯肽干預(yù)后，KKAy小鼠的肝臟重量和肝臟指數(shù)顯著下降。肝臟組織病理形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示，干預(yù)后小鼠肝臟細(xì)胞腫脹和脂肪變性有所減輕。結(jié)果證實(shí)利拉魯肽可減少脂肪在肝臟的沉積，減輕肝臟損傷。

TC和TG含量異常變化是脂代謝紊亂的重要標(biāo)志，也是多種心腦血管疾病的危險(xiǎn)因素[12]。在胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，外周組織對葡萄糖的利用能力下降，脂肪分解加速產(chǎn)生大量的游離脂肪酸，過量的游離脂肪酸經(jīng)循環(huán)系統(tǒng)進(jìn)入肝臟合成膽固醇和甘油三酯[13]。本研究結(jié)果顯示，KKAy小鼠血清TC和TG水平明顯升高，證明存在脂代謝紊亂，使用利拉魯肽干預(yù)后，KKAy小鼠血清TC和TG水平雖有下降趨勢但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示利拉魯肽可在一定程度上緩解糖尿病脂代謝紊亂。

PI3K家族屬于原癌基因，由Ⅰ類、Ⅱ類和Ⅲ類PI3K三個家族成員組成，其中主要起作用的是Ⅰ類PI3K，它是由一個p110（110 kd）催化亞基和一個p85（85 kd）調(diào)節(jié)亞基組成的異源二聚體，具有脂類激酶活性和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性，磷酸化后的PI3K可激活其下游的eNOS、GSK、GLUT4等多種底物受體，產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)[14-17]。有研究指出脂代謝紊亂和PI3K蛋白表達(dá)異常有著密切的關(guān)系[18]。本研究中，模型組KKAy小鼠肝臟組織PI3K蛋白的表達(dá)較對照組小鼠明顯減少，經(jīng)過利拉魯肽干預(yù)后，肝臟組織PI3K蛋白表達(dá)量顯著增加，表明利拉魯肽可通過上調(diào)PI3K蛋白的表達(dá)來調(diào)節(jié)KKAy小鼠脂代謝紊亂狀況。

綜上，利拉魯肽可在一定程度上降低KKAy小鼠進(jìn)食量、TC及TG水平；顯著減少KKAy小鼠飲水量；上調(diào)肝臟PI3K蛋白的表達(dá)；改善KKAy小鼠肝臟損傷狀況。結(jié)果表明，利拉魯肽可以改善脂代謝紊亂狀況，其機(jī)制可能與肝臟組織PI3K蛋白的表達(dá)增加有關(guān)，但更明確的作用機(jī)制仍需要深入研究來探討，為利拉魯肽在糖尿病伴發(fā)脂代謝紊亂的臨床應(yīng)用提供藥理學(xué)依據(jù)。