賴鈺婷，原江鋒，陳卓瑤，龔明貴

(河南科技大學 食品與生物工程學院，河南 洛陽 471023)

0 引言

葡萄酒中含有多種人體正常生理代謝所必需的營養(yǎng)物質，使葡萄酒在中國消費量呈直線上升趨勢[1]。年輕的葡萄酒，酒液渾濁、穩(wěn)定性差、口感粗糙、酸澀、香氣不協(xié)調、淡薄、飲用質量差，優(yōu)質葡萄酒需要幾個月甚至幾年的陳釀期來改善葡萄酒的口感，提高酒體的穩(wěn)定性[2]。陳釀過程使葡萄酒中的活性成分發(fā)生進一步的氧化、聚合等反應，從而改善葡萄酒的口感和風味，提高葡萄酒的品質[3]。酚類物質作為葡萄酒的“骨架”成分，是葡萄中重要的次級代謝產(chǎn)物，影響葡萄酒的顏色、香氣和口感[4]，在葡萄酒中起著十分重要的作用。葡萄酒在陳釀過程中總酚的含量隨著陳釀時間的延長而下降[5]。有機酸類的種類、濃度及構成會影響葡萄酒的酸性特性，進而影響葡萄酒的色、香、味。在陳釀過程中有機酸和醇易發(fā)生酯化反應，從而增加葡萄酒的香氣，使有機酸總量逐漸下降并趨于穩(wěn)定[6]。

傳統(tǒng)的陳釀技術具有耗時長、成本高、勞動密集以及潛在的微生物污染等缺點[7]，為了克服上述缺點，在較短的陳釀時間內生產(chǎn)出高質量的葡萄酒，可以使用一些人工催陳技術加速葡萄酒的老化，這些技術包括微氧、超聲波、微波、高壓、電場、伽馬射線和納米金光催化等[8]。微波技術作為一種比較溫和的、有前途的人工催陳技術，在葡萄酒、白酒、果酒和米酒等的催陳方面已經(jīng)受到關注[9]，處理的酒吸收微波能后，酒體系在微波場下存在熱效應和非熱效應。熱效應使酒體系溫度升高，推動自發(fā)化學平衡反應，加速酒中活性成分的反應速度[10]。非熱微波效應使活性極性分子發(fā)生能級躍遷而誘導某些聚合反應進行[11]。文獻[12]研究發(fā)現(xiàn)：微波工藝可以縮短酒的陳釀期、提升酒品質、增加和平衡香氣成分、加速酒體酯化。在應用過程中經(jīng)常被研究者忽略的問題是：微波儀中控溫系統(tǒng)是一種負反饋控制，當實際溫度達到設定溫度時，微波磁控管的輸出功率和工作頻率都大大降低。在實際操作中，將微波儀上標識的電功率誤認為是微波的實際輸出功率而進行討論分析，從而導致試驗結果、數(shù)據(jù)很難重復，且不同研究之間的實驗數(shù)據(jù)很難相互比較。因此，本文建立了密閉微波磁力攪拌溫度控制體系(closed magnetic-stirrer and controlled-temperature cooling microwave irradiation, CMCC-MI)[13]，保持連續(xù)的微波能輸出，保證試驗的重復性和試驗結果的準確性。

本文以年輕蛇龍珠干紅葡萄酒為研究對象，探究不同的微波功率、溫度、處理時間和處理方式對葡萄酒中酚類和有機酸類含量的影響。采用分光光度法測定葡萄酒中總酚的變化，采用酸堿滴定法測定葡萄酒中總酸的變化，采用反相高效液相色譜法測定微波處理后葡萄酒中沒食子酸、咖啡酸、丁香酸、兒茶素、二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷、花青素-3-O-葡萄糖苷、酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸和草酸的含量變化，進而分析微波技術對葡萄酒中主要活性成分的影響。探究微波技術對葡萄酒風味變化的具體機制，為應用微波技術對葡萄酒改變酚類和有機酸類含量并改善葡萄酒感官品質提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蛇龍珠干紅葡萄酒購于山東煙臺威龍葡萄酒股份有限公司(釀造年份為2019年)，酒精含量(體積分數(shù))12.0%?？Х人?caffeic acid)、沒食子酸(gallic acid)、丁香酸(syringic acid)、兒茶素(catechin)、二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷(malvidin-3-O-glucoside，Mv-3-glu)、花青素-3-O-葡萄糖苷(cyanidin-3-O-glucoside，Cy-3-glu)均為色譜純(≥98.00%)，購于合肥博美生物科技有限責任公司；草酸(批號101097-201702，質量分數(shù)99.1%)、酒石酸(批號190243-202001，質量分數(shù)99.5%)、蘋果酸(批號190014-201302，質量分數(shù)98.5%)、乙酸(批號190079-202002，質量分數(shù)99.9%)、檸檬酸(批號111679-201602，質量分數(shù)97.0%)均為優(yōu)級純，購于中國食品藥品檢定研究院；Folin-Ciocalteu試劑、碳酸鈉、氫氧化鈉、鹽酸、無水乙醇均為分析純，購于天津市科密歐化學試劑有限公司；甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純，購于美國默克公司；純凈水購于新鄉(xiāng)娃哈哈昌盛飲料有限公司。

1.2 儀器與設備

XH-MC-1型微波合成儀，北京祥鵠科技發(fā)展有限公司；DLSB-10L型低溫冷卻液循環(huán)泵，鞏義市予華儀器有限責任公司；WT6000S型大扭矩調速型蠕動泵，保定雷弗流體科技有限公司；UV1800PC型紫外可見分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司；1260安捷倫高效液相色譜(high performance liquid chromatography, HPLC)，安捷倫科技有限公司；萬分之一天平，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；pH計，上海奧豪斯儀器有限公司。

1.3 方法

樣品微波處理過程。將50 mL處理樣品分別放置于CMCC-MI系統(tǒng)的樣品瓶中，每組重復3次。以未處理的葡萄酒作為對照組(control)，進行單因素試驗。研究功率依次為100 W、200 W和300 W，溫度為40 ℃，時間為3 min處理條件下葡萄酒中活性成分的變化；溫度依次為30 ℃、40 ℃和50 ℃，功率為100 W，時間為3 min處理條件下葡萄酒中活性成分的變化；時間依次為1 min、3 min和6 min，功率為100 W，溫度為40 ℃處理條件下葡萄酒中活性成分的變化；連續(xù)處理3 min和6 min，間歇處理3 min和6 min(每隔1 d分別處理1 min和2 min，連續(xù)3 d)，功率為100 W，溫度為40 ℃處理條件下葡萄酒中活性成分的變化。

采用Folin-酚比色法[14]測定總酚含量(以質量濃度表示，下同)，以沒食子酸為對照品。

采用酸堿滴定法測定總酸含量，參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》，以酒石酸為當量，計算總酸含量。

酚類流動相的制備。流動相A：1%(體積分數(shù))甲酸的H2O溶液；流動相B：1%(體積分數(shù))甲酸的甲醇溶液，流動相需經(jīng)過0.45 μm有機濾膜過濾，超聲脫氣20 min后使用。

酚類標準液的配制。精確稱取沒食子酸、咖啡酸、丁香酸、兒茶素、Mv-3-glu、Cy-3-glu標準品，分別為25.0 mg、2.6 mg、5.4 mg、2.5 mg、3.2 mg、2.6 mg，用甲醇溶解后于50 mL容量瓶中定容，用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得沒食子酸、咖啡酸、丁香酸、兒茶素、Mv-3-glu、Cy-3-glu的質量濃度分別為500 μg/mL、52 μg/mL、108 μg/mL、50 μg/mL、64 μg/mL、52 μg/mL的混合對照品溶液Ⅰ。

酚類HPLC運行條件。色譜柱：反向液相色譜柱(安捷倫ZORBAX SB-C18，4.6 mm×250 mm，5 μm)；流速：1.0 mL/min；進樣量：20 μL；檢測器(Agilent DAD)波長：280 nm；柱溫：25 ℃；梯度洗脫程序：0～3 min，0%～2% B；3～18 min，2%～10% B；18～28 min，10%～20% B；28～43 min，20%～30% B；43～63 min，30%～70% B；63～64 min，70%～100% B；64～69 min，100%～100% B；69～74 min，100%～2% B。

有機酸流動相的制備。精確稱取2.399 2 g NaH2PO4，加入純凈水，于1 L容量瓶中定容(濃度為0.02 mol/L)，用H3PO4調節(jié)pH至2.70，經(jīng)0.45 μm水相濾膜過濾，超聲脫氣20 min后使用。

有機酸標準液的配制。精密取酒石酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸、乙酸、草酸標準品，分別為40.0 mg、50.0 mg、160 μL、60.0 mg、880 μL、1.2 mg，用0.02 mol/L NaH2PO4(pH 2.70)溶解后，于20 mL容量瓶中定容，用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得酒石酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸、乙酸、草酸質量濃度分別為2.0 mg/mL、2.5 mg/mL、9.6 mg/mL、3.0 mg/mL、46.2 mg/mL、0.06 mg/mL的混合對照品溶液Ⅱ。

有機酸HPLC運行條件。色譜柱：反向液相色譜柱(TSKgel ODS-100 V，4.6 mm×250 mm，5 μm)；流速：0.5 mL/min；進樣量：10 μL；檢測器(Agilent DAD)波長：220 nm；柱溫：40 ℃。

1.4 數(shù)據(jù)處理

以上所有試驗均重復3次，使用SPSS 23.0、Origin 2018軟件進行數(shù)據(jù)處理和繪圖。

2 結果與分析

分別精密吸取混合對照品溶液Ⅰ0.10 mL、0.20 mL、0.50 mL、1.00 mL、2.50 mL和5.00 mL，用甲醇分別定容于10 mL容量瓶中，按酚類物質的色譜條件檢測，以對照品的峰面積為縱坐標(y)，進樣質量濃度為橫坐標(x)，得到線性回歸方程表(見表1)。分別精密吸取混合對照品溶液Ⅱ0.20 mL、0.40 mL、0.80 mL、1.60 mL和3.20 mL，用0.02 mol/L NaH2PO4(pH 2.70)分別定容于20 mL容量瓶中，按有機酸的色譜條件檢測，以對照品峰面積為縱坐標(y)，進樣質量濃度為橫坐標(x)，得到線性回歸方程表(見表1)。

表1 12種標準品的標準曲線、相關系數(shù)、線性范圍、檢出限和定量限

2.1 微波處理對葡萄酒中酚類物質含量的影響

沒食子酸、咖啡酸、丁香酸、兒茶素、Cy-3-glu、Mv-3-glu的標準品和葡萄酒的HPLC色譜圖如圖1所示，說明上述色譜條件下紅酒中主要酚類化合物的色譜峰與其他成分分離良好；標準曲線方程、相關系數(shù)、檢出限和定量限見表1，說明葡萄酒中的主要酚類化合物在線性范圍內與積分面積呈良好的線性關系。葡萄酒中總酚標準曲線回歸方程為y=13.095x+0.004，R2=0.986 3。圖2為不同微波條件對葡萄酒中酚類物質的影響。由圖2可知：在年輕葡萄酒中沒食子酸相比較其他5種酚類化合物含量最高。與未處理的葡萄酒相比，不同微波功率、溫度、時間和處理方式處理葡萄酒后，沒食子酸、咖啡酸、Mv-3-glu的含量都有升高的趨勢，總酚和兒茶素的含量呈現(xiàn)降低趨勢，Cy-3-glu、丁香酸的含量變化不大。

圖1 6種酚類標準品和葡萄酒的HPLC色譜圖

(a) 不同微波功率處理

葡萄酒中酚類物質是一大類復雜的具有抗氧化能力的化合物，影響葡萄酒的味道、骨架、結構和顏色等特性，對葡萄酒品質具有重要影響[15]。一般情況下，隨著葡萄酒酒齡的增大，由于其氧化程度升高，導致葡萄酒中總酚含量下降[5]。從不同微波條件處理葡萄酒中總酚的結果來看，隨著微波溫度的升高和微波時間的延長，葡萄酒中的總酚有降低的趨勢，這與自然陳釀的條件下總酚含量變化趨勢一致。由于較高的溫度可能會引起葡萄酒口感較大的改變，因此適宜采用溫和的溫度來催陳葡萄酒。低微波功率使葡萄酒中的總酚含量降低，但是300 W處理的葡萄酒中總酚有增高的趨勢，可能的原因是高微波功率產(chǎn)生較強的高頻電磁場，導致葡萄酒中的極性分子產(chǎn)生運動并相互摩擦增強，從而導致分子間化學鍵斷裂，可能造成含酚基團的數(shù)目增多，由于Folin-酚比色法測定的原理是氧化還原反應，從而測定的總酚含量有增高趨勢，因此采用較低的微波功率產(chǎn)生的高頻電磁場更能與自然陳釀的葡萄酒總酚變化趨勢一致。從微波處理方式來看，長時間比短時間處理葡萄酒中總酚含量要低，并且間歇處理與連續(xù)處理在長時間處理條件下總酚含量差異不大。因此，從葡萄酒總酚含量的變化來看，微波技術采用低功率、較長時間、溫和溫度來處理年輕葡萄酒，可使葡萄酒中總酚含量變化趨勢快速與自然陳釀葡萄酒中總酚含量變化趨勢一致。

沒食子酸屬于水解單寧，沒食子酸的濃度和聚合度影響葡萄酒的澀味和苦味，苦澀味對于葡萄酒的獨特口感起到關鍵作用。葡萄酒的澀味與沒食子酸的濃度呈正相關，葡萄酒在貯存期間沒食子酸的含量有上升趨勢[16]，這可能是由于沒食子酸是很多酚類物質的組成基礎，葡萄酒在貯存過程中一些聚合酚類化合物由于發(fā)生水解導致其含量上升。由圖2可知：在不同的微波功率、時間、溫度和處理方式條件下，葡萄酒中沒食子酸的含量均高于未處理的葡萄酒中沒食子酸的含量。從整體上來看，功率為100 W、溫度為40 ℃、處理1 min后，葡萄酒中沒食子酸的含量最高，也就是說在此條件下微波技術能達到較好的催陳效果，并且葡萄酒的口感更好。

兒茶素是一種無色的黃烷-3-醇類化合物，是葡萄酒中含量較豐富的單體化合物，被認為是紅葡萄酒中重要的澀感物質。在自然陳釀過程中，葡萄酒中的無色兒茶素發(fā)生氧化、聚合，或者兒茶素作為輔色物質，因此造成兒茶素含量呈現(xiàn)下降趨勢[17]。兒茶素含量的降低，說明陳釀過程中葡萄酒澀感改變和色澤趨于穩(wěn)定。從圖2可以看出：不同的微波功率、溫度、時間和處理方式下的葡萄酒與未處理葡萄酒相比，兒茶素含量呈現(xiàn)出降低趨勢，從兒茶素的含量變化來看，微波技術具有與自然陳釀過程相同的變化趨勢，說明微波技術具有快速催陳的能力。在100 W、40 ℃、間歇處理6 min條件下，兒茶素含量最低，說明低功率、較低溫度和間歇處理方式有利于葡萄酒的催陳。

咖啡酸作為重要的輔色素因子，在葡萄酒陳釀過中，咖啡酸可與花色苷結合形成結構更加穩(wěn)定的花色苷聚合物，從而提高花色苷的色度。葡萄酒在自然陳釀過程中，咖啡酸的濃度有升高的趨勢[16]，這是由于葡萄酒陳釀期間相應咖啡酸聚合物的水解作用造成的。由圖2可知：與未處理的葡萄酒相比，在不同的微波條件下其含量均高于未處理葡萄酒，可能是由于微波產(chǎn)生的能量加速了葡萄酒陳釀期間相應聚合物的水解作用。隨著微波功率增高、溫度升高和處理時間延長，咖啡酸含量趨于穩(wěn)定，說明不同微波處理條件不會引起咖啡酸含量的較大變化。咖啡酸含量的升高與自然陳釀過程中咖啡酸含量變化趨勢一致，由于咖啡酸具有極強的輔色效應[18]，因此可以間接反映微波處理葡萄酒使葡萄酒的顏色趨于穩(wěn)定，從而證明微波技術可以快速催陳葡萄酒。

花色苷是葡萄酒的呈色物質，其種類、狀態(tài)和含量在一定程度上決定了葡萄酒的色澤特征和陳釀潛能。由圖2可知：Cy-3-glu的含量受微波條件變化影響不大，說明微波技術對于Cy-3-glu結構的穩(wěn)定不會造成較大影響。不同的微波功率、溫度、時間和處理方式條件下，極性的活性組分在微波場中旋轉并相互摩擦，在可逆加成斷裂鏈轉移聚合(reversible addition fragmentation chain-transfer polymerization, RAFT)過程中，極性的活性成分發(fā)生氫鍵斷裂；由于微波輻射也具有合成功能，可能在斷裂的氫鍵上重新合成活性成分[13]。葡萄酒中Mv-3-glu的含量略有升高的趨勢，這可能是由于在微波場的作用下葡萄酒中Mv-3-glu聚合物降解作用大于聚合作用，因此造成單體Mv-3-glu形成，從而使Mv-3-glu含量略微升高；并且Mv-3-glu含量在連續(xù)處理方式下高于間歇處理方式，可能是由于連續(xù)微波處理使Mv-3-glu聚合物降解作用更強，從而引起Mv-3-glu含量的積累。今后進一步探究微波技術對花色苷穩(wěn)定性的影響，可為微波技術對葡萄酒顏色穩(wěn)定性提供一定的理論依據(jù)。

丁香酸是葡萄酒中較有效的輔色素物質，對于提高葡萄酒顏色的穩(wěn)定性具有一定的作用[19]。在葡萄酒的自然陳釀過程中，丁香酸是Mv-3-glu的一種降解產(chǎn)物。由圖2可知：不同的微波條件下，丁香酸含量變化不大。在葡萄酒貯存過程中Mv-3-glu主要以結合態(tài)及聚合態(tài)形式存在，由丁香酸穩(wěn)定的含量說明微波技術沒有引起丁香酸-Mv-3-glu聚合物的降解，這樣葡萄酒具有更加穩(wěn)定的顏色，說明微波技術有利于葡萄酒的熟化物質。

2.2 微波處理對葡萄酒中有機酸類物質含量的影響

總酸是評定葡萄酒感官質量的重要指標，適當?shù)目偹岷坑兄谄咸丫频拈L期貯存。葡萄酒的酸度主要由有機酸決定，有機酸含量過高會使葡萄酒有酸澀感、酒味粗硬、品質下降[20]。采用酸堿滴定法測定葡萄酒中的總酸含量，結果發(fā)現(xiàn)不同微波條件下葡萄酒的總酸含量呈下降的趨勢，尤其是在微波功率為100 W、溫度為40 ℃、間歇處理6 min的條件下，總酸含量降低了13.72%?？偹岷康慕档涂赡苁怯捎谄咸丫莆瘴⒉芎螅肿拥膬饶茉黾?，化學反應過程加速，加速了醇→醛→酸→酯的轉化，從而加速了葡萄酒內部的氧化和酯化反應，因此加速了葡萄酒的陳釀過程。從葡萄酒中總酸的含量來看，低功率、低溫、間歇處理有利于控制有機酸的生成。

葡萄酒中有機酸的種類和濃度調節(jié)著葡萄酒的酸堿平衡，其中酒石酸、蘋果酸、檸檬酸和草酸來自用于釀酒的葡萄漿果、乳酸和乙酸，是釀酒過程中的主要副產(chǎn)品[21]。6種有機酸的標準品和葡萄酒的HPLC色譜圖如圖3所示。由圖3可知：上述色譜條件下紅酒中主要有機酸化合物的色譜峰與其他成分分離良好。標準曲線方程、相關系數(shù)、檢出限、定量限如表1所示，說明葡萄酒中的主要有機酸化合物在線性范圍內與積分面積成良好的線性關系。不同微波條件下葡萄酒中酒石酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸、乙酸、草酸的含量變化如圖4所示，微波處理葡萄酒中酒石酸、乳酸、草酸的含量基本沒有發(fā)生變化，而乙酸和檸檬酸含量有降低趨勢。蘋果酸對于鑒定葡萄酒是否優(yōu)良有著十分重要的作用，在陳釀過程中蘋果酸的含量都比較穩(wěn)定，但由于部分蘋果酸轉化成琥珀酸造成含量降低[22]，隨著微波功率和時間的增加蘋果酸含量呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢。根據(jù)蘋果酸自然陳釀過程中降低的趨勢，微波試驗參數(shù)建議選擇200 W、40 ℃、間歇處理6 min，該條件下葡萄酒中蘋果酸的含量最低。乙酸是葡萄酒釀造過程的“晴雨表”，其含量的高低直接影響到葡萄酒的品質，而高濃度的乙酸會對葡萄酒的風味產(chǎn)生較大影響，陳釀過程中乙酸和乙醇生成乙酸乙酯，賦予葡萄酒一定的果香味[23]。由圖4可知：葡萄酒中乙酸在100 W、40 ℃、處理3 min條件下含量較低，可能是由于微波場下乙酸與乙醇快速合成酯類造成乙酸含量的降低。在葡萄酒的生產(chǎn)中，適量的檸檬酸能改善葡萄酒口感，而檸檬酸的過量使用，卻會導致口感不協(xié)調，甚至會對人體產(chǎn)生危害。在葡萄酒的釀造過程中，由于檸檬酸發(fā)生脫羧反應，因此檸檬酸的含量呈下降趨勢。在200 W、40 ℃，間歇處理會較大程度地引起檸檬酸含量的降低，處理符合檸檬酸的自然陳化規(guī)律。

圖3 6種有機酸類標準品和葡萄酒的HPLC色譜圖

(a) 不同微波功率處理

3 結論

(1)通過不同微波功率、時間、溫度和處理方式對年輕葡萄酒進行處理，可以看出微波技術可以改變葡萄酒中總酚、酚類化合物、總酸和有機酸化合物的含量，說明微波技術可以改善葡萄酒的理化特性，尤其是風味特性。

(2)通過對微波技術下葡萄酒中總酚和6種酚類化合物含量的影響可知，低功率、40 ℃和間歇處理6 min的條件可以較大程度的增加咖啡酸的濃度，略微升高沒食子酸、Mv-3-glu的濃度，降低總酚、兒茶素的濃度，對Cy-3-glu影響不大，而這些物質的變化趨勢與自然陳釀葡萄酒中酚類化合物變化趨勢基本一致。

(3)通過對不同微波條件下葡萄酒中總酸和6種有機酸類化含物的含量變化來看，微波技術可以改變葡萄酒的酸度，其中對總酸、乙酸、檸檬酸和蘋果酸有降低趨勢，對酒石酸、乳酸、草酸含量影響不大。這可能是因為微波場加速了有機酸的酯化反應，從而降低了部分有機酸的含量，進而改變葡萄酒的酸性特性。

(4)試驗結果有助于了解微波技術改善葡萄酒感官特性的原因，微波技術在一定程度上改善葡萄酒的風味品質，為應用微波技術生產(chǎn)高品質葡萄酒發(fā)揮積極作用。至于微波技術對葡萄酒風味品質的影響效果是否具有“返生”現(xiàn)象及是否具有良好的穩(wěn)定性有待于進一步研究。