陳麗萍，余志金，陳惠新

（惠州市中心人民醫(yī)院消化內(nèi)科，惠州 516001）

胃腸道間質(zhì)瘤（GIST）是最常見的起源于消化道的間質(zhì)瘤，每年的發(fā)病率為百萬分之7.8［1］。GIST 在所有年齡組均有報(bào)道，然而，不到10%的患者年齡小于40歲［2］。在成人胃腸道間質(zhì)瘤中，最常見的原發(fā)部位是胃和小腸；在極少數(shù)情況下，它們也發(fā)生在內(nèi)臟外的部位，如腸系膜、網(wǎng)膜、骨盆和腹膜后［3］。不幸的是，GIST具有潛在惡性，預(yù)后較差，在根治性切除后，腫瘤復(fù)發(fā)仍然很常見，特別是在高?；颊咧?，超過50%的患者在根治性切除后5 年內(nèi)復(fù)發(fā)［4］。尋找合適的方法對(duì)GIST盡早進(jìn)行有效診斷和危險(xiǎn)性分級(jí)對(duì)改善預(yù)后有積極作用。超聲內(nèi)鏡是GIST 常用的檢測(cè)手段；Ki67 是一種核蛋白，可指示細(xì)胞增殖的程度；DOG1 是GIST 中特異表達(dá)的蛋白［5］。因此，本研究探討超聲內(nèi)鏡聯(lián)合Ki-67、DOG1 表達(dá)對(duì)胃腸道間質(zhì)瘤診斷、危險(xiǎn)性分級(jí)的評(píng)估價(jià)值，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015 年1 月～2020 年12 月收治GIST 患者98 例作為GIST 組，男54 例，女44 例；年齡32～71 歲，平均（51.54±4.82）歲；腫瘤部位：胃79 例，小腸12 例，結(jié)直腸7 例；腫瘤直徑2～18cm，平均（6.25±2.34）cm；組織學(xué)類型：梭形細(xì)胞型73 例，上皮細(xì)胞型15 例，混合型10 例；核分裂數(shù)：≤5 個(gè)/50 高倍視野（Highpowerfield，HPF）66 例，6～10 個(gè)/50HPF 18 例，＞10個(gè)/50HPF 14 例；危險(xiǎn)度分級(jí)（NIH）［6］：極低危12 例，低危28 例，中危36 例，高危22 例。選取同期非GIST 患者（均為內(nèi)鏡診斷黏膜下腫物）30 例作為對(duì)照組，男18 例，女12 例；年齡36～68 歲，平均（53.61±3.78）歲；病理類型：胃腸道平滑肌瘤19 例，胃腸道神經(jīng)鞘瘤11 例。兩組患者性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：①GIST 符合《中國胃腸道間質(zhì)瘤診斷治療共識(shí)》［7］中相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)，且經(jīng)術(shù)后病理學(xué)確診；②初次確診為GIST；③均行內(nèi)鏡下或外科手術(shù)切除治療，術(shù)前未進(jìn)行輔助治療；④術(shù)前均行超聲內(nèi)鏡檢查；⑤具有完整病歷資料。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他胃腸道疾病患者；②未進(jìn)行超聲內(nèi)鏡檢查患者；③合并其他惡性腫瘤患者。

1.3 方法

1.3.1 超聲內(nèi)鏡檢查 患者于檢查前禁食禁水8h，靜脈全麻或表面麻醉，使用FUJINON -7000 超聲內(nèi)鏡配合5-20MHz 可調(diào)探頭采用充盈法和水囊法進(jìn)行檢查。觀察并記錄病變部位、大小、形狀、回聲等情況。

1.3.2 Ki-67、DOG1 表達(dá)檢測(cè) 取患者腫瘤組織標(biāo)本，甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，厚度4μm。使用Ki67、DOG1 免疫組化試劑盒（上海谷研實(shí)業(yè)有限公司）采用過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素（SP）法檢測(cè)Ki-67、DOG1 表達(dá)情況。切片常規(guī)脫蠟水化，細(xì)胞通透液浸潤玻片30min，PBS 清洗3 次；將玻片放入0.01M 檸檬酸鈉緩沖液（PH6.0）中微波修復(fù)抗原，PBS 清洗3 次；加入3%H2O2溶液孵育30min 以阻斷內(nèi)源性過氧化酶，PBS 清洗3 次；加入50μL 適當(dāng)比例稀釋Ki67、DOG1 一抗，4℃孵育過夜，PBS 清洗5 次；加入二抗室溫孵育30min～1h，PBS 清洗5 次；滴加過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素（SP）室溫孵育30min～1h，PBS 清洗5 次；濾紙吸干水分，加入50～100μL DAB，室溫反應(yīng)10min，PBS 清洗3 次；加入蘇木素復(fù)染，幾秒后流水充分沖洗，脫水、透明、封片。

1.4 結(jié)果判定

1.4.1 超聲內(nèi)鏡量化標(biāo)準(zhǔn)［8］在同一頻率下（9 Hz）采集兩組患者超聲圖像，并以JPEG 格式保存。由同一人（不知病理結(jié)果）對(duì)選取的超聲圖像利用 Photoshop CS6 13.0 軟件中沿病灶輪廓選定測(cè)定區(qū)間，測(cè)定其灰度平均值（回聲強(qiáng)度）及灰度標(biāo)準(zhǔn)偏差（回聲均勻度）。每張選定圖片各測(cè)定5 次，取平均值。

1.4.2 Ki-67、DOG1 陽性表達(dá)判讀 Ki-67 陽性為細(xì)胞核有棕黃色顆粒，DOG1 陽性為細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜著色，每切片隨機(jī)取400 倍顯微鏡視野5 個(gè)，分別對(duì)陽性細(xì)胞及總細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算陽性細(xì)胞率。陽性細(xì)胞率=（陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)）×100%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。計(jì)量資料以mean±SD 表示，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)，多組間比較采用F 檢驗(yàn)。繪制受試者工作特征曲線（Receiver Operating Characteristic，ROC），計(jì)算曲線下面積（Area Under the Cure，AUC），評(píng)估超聲內(nèi)鏡、Ki-67 和DOG1 表達(dá)水平對(duì)診斷GIST 和危險(xiǎn)度分級(jí)的效能，AUC 比較采用Z 檢驗(yàn)。P<0.05 則認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者超聲內(nèi)鏡、Ki-67、DOG1 表達(dá)比較GIST 組超聲內(nèi)鏡圖像的灰度平均值及灰度標(biāo)準(zhǔn)偏差、Ki-67 和DOG1 表達(dá)陽性細(xì)胞率均高于對(duì)照組（P>0.05），見表1。

表1 兩組患者超聲內(nèi)鏡、Ki-67、DOG1表達(dá)比較

2.2 超聲內(nèi)鏡、Ki-67、DOG1 表達(dá)對(duì)GIST 的診斷價(jià)值 分別繪制超聲內(nèi)鏡（灰度平均值、灰度標(biāo)準(zhǔn)偏差）、Ki-67、DOG1 表達(dá)及其聯(lián)合診斷GIST 的ROC 曲線，將GIST 作為陽性結(jié)果，對(duì)照組作為陰性結(jié)果。超聲內(nèi)鏡圖像的灰度平均值診斷GIST 截點(diǎn)為62.83，AUC 為0.841；超聲內(nèi)鏡圖像的灰度標(biāo)準(zhǔn)偏差診斷GIST 截點(diǎn)為11.56，AUC 為0.743；Ki-67 表達(dá)陽性細(xì)胞率診斷GIST截點(diǎn)為7.34%，AUC 為0.785；DOG1 表達(dá)陽性細(xì)胞率診斷GIST 截點(diǎn)為10.69%，AUC 為0.835；聯(lián)合診斷GIST的AUC 為0.954，高于單獨(dú)診斷AUC 值（P<0.05）。見圖1，見表2。

圖1 超聲內(nèi)鏡、Ki-67、DOG1表達(dá)對(duì)診斷GIST的ROC曲線

表2 超聲內(nèi)鏡、Ki-67、DOG1表達(dá)對(duì)診斷GIST的ROC曲線分析各數(shù)值

2.3 超聲內(nèi)鏡、Ki-67、DOG1 表達(dá)與GIST 患者臨床特征的關(guān)系 GIST 患者腫瘤直徑、核分裂數(shù)、危險(xiǎn)度分級(jí)與超聲內(nèi)鏡（灰度平均值、灰度標(biāo)準(zhǔn)偏差）、Ki-67 表達(dá)陽性細(xì)胞率有關(guān)（P<0.05），與DOG1 表達(dá)陽性細(xì)胞率無關(guān)（P>0.05）；GIST 患者性別、年齡、腫瘤部位、組織學(xué)類型與超聲內(nèi)鏡（灰度平均值、灰度標(biāo)準(zhǔn)偏差）、Ki-67、DOG1 表達(dá)陽性細(xì)胞率無關(guān)（P>0.05）。見表3。

表3 超聲內(nèi)鏡、Ki-67、DOG1表達(dá)與GIST患者臨床特征的關(guān)系

2.4 超聲內(nèi)鏡、Ki-67、DOG1 表達(dá)對(duì)GIST 危險(xiǎn)度分級(jí)的診斷價(jià)值 分別繪制超聲內(nèi)鏡（灰度平均值、灰度標(biāo)準(zhǔn)偏差）、Ki-67、DOG1 表達(dá)及其聯(lián)合診斷GIST 的ROC 曲線，將中危和高危GIST 作為陽性結(jié)果，低危和極低危GIST 作為陰性結(jié)果。超聲內(nèi)鏡圖像的灰度平均值診斷GIST 危險(xiǎn)度分級(jí)截點(diǎn)為67.34，AUC 為0.822；超聲內(nèi)鏡圖像的灰度標(biāo)準(zhǔn)偏差診斷GIST 危險(xiǎn)度分級(jí)截點(diǎn)為13.05，AUC 為0.746；Ki-67 表達(dá)陽性細(xì)胞率診斷GIST 危險(xiǎn)度分級(jí)截點(diǎn)為8.90%，AUC 為0.794；DOG1表達(dá)陽性細(xì)胞率診斷GIST 危險(xiǎn)度分級(jí)截點(diǎn)為14.85%，AUC 為0.687；聯(lián)合診斷GIST 危險(xiǎn)度分級(jí)的AUC 為0.900，高于單獨(dú)診斷AUC 值（P>0.05）。見圖2，見表4。

表4 超聲內(nèi)鏡、Ki-67、DOG1表達(dá)對(duì)GIST危險(xiǎn)度分級(jí)的ROC曲線分析各數(shù)值

圖2 超聲內(nèi)鏡、Ki-67、DOG1表達(dá)對(duì)GIST危險(xiǎn)度分級(jí)的ROC曲線

3 討論

GIST 是臨床中最常見的胃腸道惡性上皮下病變（SEL）［9］。GIST 被認(rèn)為起源于Cajal 的間質(zhì)細(xì)胞［10］，Cajal 是胃腸道運(yùn)動(dòng)的起搏器細(xì)胞。GIST 主要是由酪氨酸激酶受體KIT 和血小板來源的生長因子受體-α的致癌突變引起的［11］。約10% ～ 30%的GIST 具有惡性臨床病程［12］。此外，有報(bào)道稱不僅具有高核分裂指數(shù)的大型GIST 經(jīng)常表現(xiàn)出惡性臨床病程，具有低核分裂指數(shù)的小型GIST 也會(huì)表現(xiàn)出惡性轉(zhuǎn)移病程［13］。因此，GIST 被認(rèn)為是一種潛在的惡性腫瘤。GIST 不分為良性或惡性，而是根據(jù)其惡性腫瘤的臨床風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行分層：極低、低、中或高。外科切除是治療局限性GIST 的主要方法。然而即使腫瘤完全切除，仍有至少一半的胃腸道間質(zhì)瘤患者術(shù)后會(huì)復(fù)發(fā)。盡管已證明酪氨酸激酶抑制劑可為轉(zhuǎn)移患者提供持續(xù)的疾病管理［14］，但無轉(zhuǎn)移的小GIST 外科切除術(shù)是永久治愈的唯一有希望的治療方法。早期診斷、早期切除是治療GIST 的最佳策略。然而，在內(nèi)窺鏡檢查中，GIST 經(jīng)常被檢測(cè)為SEL。SEL 的鑒別診斷范圍很廣，可以包括胃腸道外壓迫、靜脈曲張、異位胰腺和各種腫瘤，包括GIST、SEL 樣癌、平滑肌瘤、神經(jīng)鞘瘤和脂肪瘤［15］。因此，探尋可用于診斷GIST 及危險(xiǎn)性分級(jí)的有效指標(biāo)具有重要意義。

超聲內(nèi)鏡是評(píng)估GIST 的有價(jià)值的成像工具，因?yàn)樗梢燥@示與正常胃壁的第四低回聲層（固有肌層）相鄰的低回聲病變。目前已經(jīng)有一些關(guān)于使用EUS 鑒別GIST 和良性間質(zhì)腫瘤的研究［16］，但是，由于主觀解釋EUS 圖像是觀察者之間的一致性較差，在分析此類腫瘤的特征方面存在局限性。數(shù)字圖像由像素組成，像素是構(gòu)成二維圖片的基本元素。在數(shù)字圖像分析中，使用紋理分析來計(jì)算像素的分布和空間變化以提取有用的數(shù)據(jù)，因此，數(shù)字圖像分析可提供有關(guān)EUS 圖像的客觀信息，從而可以減少在觀察者之間和觀察者內(nèi)部主觀性誤差。本研究通過Photoshop 將超聲內(nèi)鏡圖像量化，以灰度平均值表示回聲強(qiáng)度，灰度標(biāo)準(zhǔn)偏差表示回聲均勻度，結(jié)果表明，GIST 組灰度平均值和灰度標(biāo)準(zhǔn)偏差顯著高于對(duì)照組，并且與患者腫瘤直徑、核分裂數(shù)、危險(xiǎn)度分級(jí)相關(guān)，同時(shí)灰度平均值和灰度標(biāo)準(zhǔn)偏差對(duì)GIST 診斷和危險(xiǎn)性分級(jí)的AUC 值分別為0.841、0.743和0.822、0.746，提示灰度平均值和灰度標(biāo)準(zhǔn)偏差能有效代表超聲內(nèi)鏡結(jié)果，且能較好的對(duì)GIST 進(jìn)行診斷和分級(jí)，與前人研究結(jié)果相似［8］。

Ki67 是一種核增殖相關(guān)抗原，存在于活躍增殖的細(xì)胞中。它在細(xì)胞周期的生長和合成階段表達(dá)，但不在G0 階段（靜止階段）表達(dá)。Ki67 的預(yù)后價(jià)值已經(jīng)在許多研究中被研究，它作為一個(gè)可靠的標(biāo)志物已經(jīng)在乳腺癌、肺癌、前列腺癌、宮頸癌和結(jié)直腸癌中被證實(shí)［17-19］。因此，腫瘤細(xì)胞增殖標(biāo)志物Ki67 可能是GIST 中有用的預(yù)后因素。到目前為止，已有多項(xiàng)研究報(bào)道了Ki67表達(dá)與GIST 惡性風(fēng)險(xiǎn)之間的相關(guān)性。LiH 等［20］報(bào)道Ki67 指數(shù)與GIST 危險(xiǎn)分層和核分裂數(shù)呈正相關(guān)，并與CT 成像的腫瘤大小、輪廓、邊緣相關(guān)；Zhou Y 等［21］報(bào)道中、高危GIST 患者中Ki67 高表達(dá)率多于低危GIST患者，Ki67 高表達(dá)可能是惡性GIST 轉(zhuǎn)化風(fēng)險(xiǎn)的有用標(biāo)志；Segales-Rojas P 等［22］報(bào)道Ki67 指數(shù)與GIST 復(fù)發(fā)無關(guān)。由于研究結(jié)果相互矛盾，樣本量有限，Ki67 在預(yù)測(cè)GIST 惡性腫瘤風(fēng)險(xiǎn)方面的意義仍有爭(zhēng)議。在本研究中，GIST 組Ki-67 陽性細(xì)胞率顯著高于對(duì)照組，并且與患者腫瘤直徑、核分裂數(shù)、危險(xiǎn)度分級(jí)相關(guān)，對(duì)GIST診斷和危險(xiǎn)性分級(jí)的AUC 值分別為0.785、0.794，表明GIST 患者腫瘤惡化程度高于對(duì)照組，與現(xiàn)有認(rèn)知一致，Ki-67 表達(dá)情況可作為對(duì)GIST 進(jìn)行診斷和分級(jí)的有效指標(biāo)。

DOG1 屬于鈣離子激活的氯離子通道（CaCC）蛋白，由于其在大部分GIST 中表達(dá)而被證明是重要的診斷標(biāo)記。CaCCs 在多種組織中表達(dá)，并且是正常生理功能的必要調(diào)節(jié)劑，包括神經(jīng)元興奮性、平滑肌細(xì)胞收縮、上皮液分泌和胃腸蠕動(dòng)［23］。具體而言，DOG1 已顯示為電壓敏感且被配體激活的離子通道，可被增加的細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+激活［24］。越來越多的證據(jù)表明，DOG1 與腫瘤發(fā)生、癌癥進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和細(xì)胞存活［25-27］。在GIST 中，DOG1 高表達(dá)與預(yù)后不良有關(guān)，其在循環(huán)腫瘤細(xì)胞中的高水平可預(yù)示復(fù)發(fā)［28］。在本研究中，GIST 組DOG1 陽性細(xì)胞率顯著高于對(duì)照組，但與患者腫瘤直徑、核分裂數(shù)、危險(xiǎn)度分級(jí)無關(guān)，對(duì)GIST 診斷和危險(xiǎn)性分級(jí)的AUC 值分別為0.835、0.687，表明DOG1 表達(dá)檢測(cè)在診斷GIST 的效能高于診斷GIST 危險(xiǎn)性分級(jí)，與艾力·賽丁等［29］研究一致。

在本研究中，ROC 曲線分析表明，超聲內(nèi)鏡聯(lián)合Ki-67、DOG1 表達(dá)對(duì)GIST 診斷和危險(xiǎn)性分級(jí)的AUC值高于單獨(dú)診斷，效能更高。提示臨床中可檢測(cè)三者指標(biāo)以綜合評(píng)估患者病情，盡早進(jìn)行干預(yù)。本研究也存在一定的局限性，研究樣本量較少，需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本進(jìn)行研究分析；同時(shí)本研究缺乏長期隨訪，未對(duì)患者預(yù)后進(jìn)行分析。

綜上所述，GIST 患者超聲圖像顯示回升強(qiáng)、不均勻程度高，Ki-67、DOG1 表達(dá)陽性細(xì)胞率高，對(duì)患者進(jìn)行超聲內(nèi)鏡、Ki-67 和DOG1 表達(dá)檢測(cè)有助于預(yù)測(cè)病情嚴(yán)重程度。