王 丹 劉春勇 湛 川

(1 北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院急診醫(yī)學科，遼寧省沈陽市 110016，電子郵箱：rier63@163.com；2 中國醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院骨外科，遼寧省沈陽市 110032)

脊髓損傷是脊柱損傷最嚴重的并發(fā)癥[1]，脊髓損傷嚴重者如不進行治療則有可能會出現(xiàn)下肢功能障礙，嚴重損害患者的身心健康。導致脊髓受損的原因主要有交通事故、高處墜落、工礦事故、自然災害、體育意外、銳器傷、火器傷[2]。其中交通事故是導致脊髓損傷的主要原因，且發(fā)生率較高，其次是高處墜落[3]。臨床上，脊髓損傷主要有脊髓震蕩、脊髓休克、脊髓不全性損傷3種，其中脊髓震蕩與脊髓休克指的是脊髓在受傷后出現(xiàn)的短暫性的功能抑制狀態(tài)[4]，會嚴重威脅患者的身體健康，降低生活質量。目前，治療脊髓損傷的有效方法較少，關于自體脂肪間充質干細胞(autologous adipose-derived mesenchymal stem cell,ADMSC)治療對脊髓損傷有效性的研究更少。本文旨在探討ADMSC聯(lián)合重組人促紅細胞生成素(recombinant human erythropoietin,rhEPO)對脊髓損傷大鼠的干預效果及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 105只無特定病原體級SD大鼠，購自河南中醫(yī)藥大學[動物許可證號：SYXK(豫)2020-0004]，其中雌性大鼠53只、雄性大鼠52只，6～9月齡，體重252～317(270.3±30.9)g。每24 h內(nèi)照射12 h，在濕度為25%～35%、溫度為(28.5±4.8)℃的環(huán)境中適應性喂養(yǎng)2周。

1.2 主要試劑 神經(jīng)營養(yǎng)因子3(neurotrophin 3，NT-3)檢測試劑購自上海韻泰信息科技有限公司(貨號：YT20205)，酪氨酸激酶受體C(tyrosine kinase receptor C,TrkC)、降鈣素基因相關肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)檢測試劑均購自無錫云萃生物科技有限公司(貨號：YRX500995P、YPR108405)，頸上神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元特異性蛋白10(superior cervical ganglia neural-specific 10 protein,SCG10)檢測試劑購自上海雅吉生物科技有限公司(貨號：IHC0107092)，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)檢測試劑、胎牛血清均購自江西艾博因生物科技有限公司(貨號：IB-E10027、IB9PC-024)。二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒購自上海吉至生化科技有限公司(貨號：PC0020-500),兔抗大鼠Rho抗體購自武漢益普生物科技有限公司(貨號：ATA36858)，兔抗大鼠 Rho相關卷曲螺旋形成蛋白激酶(Rho-associated coiled-coil containing protein kinase,ROCK)抗體購自上海雅吉生物科技有限公司(貨號：YS02311B)，內(nèi)參蛋白抗體購自武漢純度生物科技有限公司(貨號：CD-G100265m)，二抗購自北京百奧萊博科技有限公司(貨號：F020218-ZRY)。rhEPO購自北京四環(huán)生物制藥有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 ADMSC的分離和培養(yǎng)：通過吸脂術采集大鼠脊髓旁脂肪5 mg，用D-Hank′s液清洗，使用0.075% Ⅰ型膠原酶37℃消化1 h后，用100目篩過濾未消化的組織，將濾出液置于離心管中，40℃、1 500 r/min離心10 min，棄上清液，再用D-Hank′s液重懸，洗滌2遍，最后40℃、1 500 r/min離心10 min得到ADMSC。調(diào)整細胞懸液濃度為1×106個/mL，將ADMSC接種并培養(yǎng)于含10% 胎牛血清的杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基中，當細胞達到70%～80%匯合時，用0.25%胰蛋白酶進行消化，取第3代生長對數(shù)期的細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.2 分組和建模：按照隨機數(shù)字表法，從105只大鼠中選取21只作為正常組，其余84只大鼠用于建立大鼠脊髓損傷模型。正常組21只大鼠不做任何處理，其他大鼠采用20 g/L戊巴比妥鈉(40 mg/kg)進行腹腔注射麻醉后，將其以俯臥位固定于手術臺上，然后在大鼠的背部膨大突出部位做一縱向2 cm切口，暴露出脊突、椎板，充分暴露出脊髓后將大鼠轉移至打擊器下；打擊器為一重10 g的鐵錘，與脊髓接觸的撞桿底端呈弧狀凹陷，直徑為2.5 mm，與脊髓表面相吻合，將鐵錘從25 mm高處自由落下(撞擊能量為25 mm×10 g，損傷直徑為2.5 mm)，操作完成后常規(guī)分層縫合、護理、消毒，待麻醉蘇醒后觀察大鼠行為動態(tài)以評估建模是否成功。建模成功的標準為大鼠尾巴痙攣性擺動，雙下肢及身體回縮樣撲動，雙下肢呈遲緩性癱瘓。84只大鼠均建模成功，其間均未死亡，采用隨機數(shù)字表法將其分為模型組、rhEPO組、ADMSC組、聯(lián)合組各21例。

1.2.3 干預方法： 建模成功后立即進行干預。rhEPO組采用rhEPO干預，ADMSC組采用ADMSC干預，聯(lián)合組采用ADMSC聯(lián)合rhEPO干預，模型組與正常組未給予任何干預。其中，每日定時以5 000 IU/kg的劑量腹腔注射rhEPO，1次/d。采用原位移植方法進行ADMSC干預，將大鼠仰臥位固定于腦立體定位儀上，取培養(yǎng)至第3代生長對數(shù)期的ADMSC(濃度為1×10個/μL)，用Hamilton微量注射器吸取細胞懸液1 μL，以損傷點作為中心向頭部、尾端各2 mm處將針頭慢慢插入，深度約1.2 mm，將ADMSC以0.3 μL/min的速度慢慢移植到脊髓中，移植完后針頭在體內(nèi)停留5 min，防止細胞倒流，1次/d。聯(lián)合組的ADMSC干預和rhEPO干預為連續(xù)干預，1次/d。移植后常規(guī)護理、消毒。共干預7 d。

1.2.4 脊髓損傷情況的評估：在干預后29 d，采用雙盲法，使用BBB運動功能評分法[5]評價大鼠脊髓損傷情況，滿分21分，得分越高說明脊髓損傷越輕。

1.2.5 病理組織學觀察：在干預后29 d，處死大鼠后取出脊髓組織，用4%多聚甲醛固定脊髓組織，室溫下用15%乙二胺四乙酸脫鈣、脫水后用石蠟進行包埋，制作3 μm的切片，進行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色處理，使用光學顯微鏡觀察大鼠脊髓病理變化。

1.2.6 NT-3、TrkC、SCG10、BDNF、CGRP水平檢測：取大鼠脊髓組織，剪碎后加入勻漿緩沖液，冰上勻漿后離心(1 000 r/min,4℃，10 min)，取上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗法檢測NT-3、TrkC、SCG10、BDNF、CGRP，使用自動酶標儀(瑞士哈美頓公司，型號：F.A.M.E.16/20)在450 nm波長處測定吸光度，顏色反應深淺與脂蛋白磷脂酶A2、同型半胱氨酸成正比，經(jīng)繪制標準曲線計算NT-3、TrkC、SCG10、BDNF、CGRP的水平。所有步驟均按照說明書進行操作。

1.2.7 蛋白免疫印跡法檢測Rho和ROCK蛋白的表達： 取大鼠脊髓組織，剪碎后加入勻漿緩沖液，冰上勻漿后離心(1 000 r/min、4℃，8 min)，提取上清液，采用二喹啉甲酸法進行蛋白定量。在2×十二烷基硫酸鈉凝膠緩沖液中加入50 μg蛋白，在85℃的環(huán)境中加熱6 min，在4℃的環(huán)境下，經(jīng)6%脫脂牛奶固定封閉60 min，使用0.05%～0.1% TBST按1 ∶500的比例稀釋一抗，在5℃下孵育過夜，之后使用0.05%～0.1% TBST洗膜2次，7 min/次，使用0.05%～0.1% TBST按1 ∶500的比例稀釋二抗，搖動孵育60 min，再次采用TBST連續(xù)洗膜2次，7 min/次。采用二氨基聯(lián)苯胺顯色，多功能顯影儀快速顯影，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)為內(nèi)參，定量分析ROCK蛋白的表達情況。顯影儀購自徐州康福爾電子科技有限公司(型號：kfr-jm1型)。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以(x±s)表示，多組間比較采用方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠BBB運動功能評分的比較 模型組、rhEPO組、ADMSC組、聯(lián)合組的BBB運動功能評分均低于正常組(均P<0.05)，模型組、rhEPO組、ADMSC組、聯(lián)合組的評分依次升高(均P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠BBB運動功能評分的比較(x±s，分)

2.2 各組大鼠脊髓組織的病理組織學變化 干預后29 d，正常組大鼠脊髓細胞神經(jīng)元結構正常，無壞死，無炎癥細胞浸潤；模型組大鼠脊髓細胞神經(jīng)元腫脹壞死，可見較多炎癥細胞浸潤及嚴重的脫髓鞘樣改變；rhEPO組大鼠脊髓組織損傷情況較模型組減輕，但可見較多壞死細胞，并且出現(xiàn)了細胞腫脹現(xiàn)象；ADMSC組壞死細胞較少，未出現(xiàn)細胞腫脹現(xiàn)象；聯(lián)合組與正常組無明顯區(qū)別，未見明顯的脫髓鞘樣改變，相比于模型組、rhEPO組及ADMSC組，聯(lián)合組的炎癥細胞也顯著減少。見圖1。

圖1 干預后29 d 5組大鼠脊髓組織的病理學改變(HE染色，×200)

2.3 各組大鼠脊髓組織中NT-3、TrkC、SCG10、BDNF、CGRP水平的比較 模型組、rhEPO組、ADMSC組、聯(lián)合組大鼠的NT-3、TrkC、SCG10、BDNF、CGRP水平均高于正常組(均P<0.05)，模型組、rhEPO組、ADMSC組、聯(lián)合組大鼠的NT-3、TrkC、SCG10、BDNF、CGRP水平依次降低(均P<0.05)。見表2。

表2 5組大鼠脊髓組織中NT-3、TrkC、SCG10、BDNF、CGRP水平的比較(x±s)

2.3 各組大鼠脊髓組織中Rho/ROCK信號通路相關蛋白的表達情況 模型組、rhEPO組、ADMSC組大鼠Rho和ROCK蛋白的相對表達量及聯(lián)合組大鼠Rho蛋白的相對表達量均高于正常組(均P<0.05)；模型組、rhEPO組、ADMSC組、聯(lián)合組大鼠的Rho、ROCK蛋白表達量均依次降低(均P<0.05)。 見表3及圖2。

表3 5組大鼠脊髓組織中Rho和ROCK蛋白相對表達量的比較(x±s)

圖2 5組大鼠脊髓組織中Rho和ROCK蛋白的電泳圖

3 討 論

脊髓損傷后可通過藥物進行治療，嚴重者須手術治療[6]，但以上治療方法并不能完全根治此病，且副作用較大。 干細胞是具有多種多向分化能力的細胞，可以分化為胚胎干細胞、成體干細胞，其中胚胎干細胞是胚胎囊胚期的內(nèi)細胞團，可以發(fā)育成全能細胞，而成體干細胞存在機體的各種組織器官中，負責組織的更新及修復[7]。間充質干細胞是一種成體干細胞，可以分化為脂肪細胞、成軟骨細胞、骨細胞、成肌細胞，除了骨髓外，關節(jié)滑膜、臍帶血、脂肪組織、皮膚的結締組織、外周血、骨骼肌等組織也存在間充質干細胞[8]。ADMSC作為一種具有多向分化能力的細胞，可以修復損傷組織，因此將其用于治療神經(jīng)、骨、肌肉、軟骨等部位的疾病可獲得較好效果，其還可以用于免疫缺陷性疾病和同種異體移植的治療[9]。rhEPO是由腎臟腎間質細胞分泌的一種活性糖蛋白，可以作用于骨髓中紅系造血祖細胞以促進細胞的分化、增殖等[10]。有研究表明，rhEPO可用于多種疾病的治療，如圍手術期應用rhEPO可以減輕患者在手術中的貧血現(xiàn)象，還可以減少對異體輸血的需求，但是有部分患者會出現(xiàn)乏力、低熱的現(xiàn)象[11]。有學者指出，雖然有關rhEPO對脊髓損傷的治療作用的研究尚處于起步階段，但rhEPO對脊髓有著明顯的神經(jīng)保護作用，良好的單次劑量反應性不存在“時間窗”效應，加之在治療過程中安全性較高，且給藥方法簡便可行，更易被接受[12]。因此，本研究采用ADMSC輔以rhEPO干預脊髓損傷模型大鼠，觀察其對神經(jīng)系統(tǒng)的修復作用，并探討其可能機制。結果顯示，模型組、rhEPO組、ADMSC組、聯(lián)合組BBB運動功能評分依次升高(均P<0.05)；此外，rhEPO組大鼠脊髓組織損傷減輕，但可見較多壞死細胞，并出現(xiàn)細胞腫脹現(xiàn)象，ADMSC組壞死細胞較少，未出現(xiàn)細胞腫脹現(xiàn)象，而聯(lián)合組與正常組無明顯區(qū)別，未見明顯的脫髓鞘樣改變，炎癥細胞也較模型組、rhEPO組及ADMSC組顯著減少。這表明，rhEPO和ADMSC均可不同程度地減輕大鼠脊髓損傷，改善其神經(jīng)功能，且聯(lián)合應用ADMSC和rhEPO時上述治療作用更為明顯。

NT-3、BDNF都屬于神經(jīng)生長因子，可以促進神經(jīng)元的生長、存活、分化，并刺激神經(jīng)突觸的形成[13]。TrkC是一種酪氨酸特異性蛋白激酶，分為非受體型和受體型兩種，主要分布在細胞質膜的表面[14]，其可對神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生一定的影響，有助于神經(jīng)環(huán)路重建及軸突髓鞘的再次形成等，可較為明顯地促進脊髓半切損傷部位功能的恢復[15]。SCG10是一種在神經(jīng)系統(tǒng)中特異表達的神經(jīng)生長相關蛋白，對神經(jīng)系統(tǒng)正常的分化和成熟起到至關重要的作用[16]。 CGRP廣泛分布于中樞、周圍神經(jīng)系統(tǒng)及一些非神經(jīng)組織，其對神經(jīng)細胞有明顯的營養(yǎng)作用，在促進神經(jīng)再生、感覺及運動的可塑性中發(fā)揮著重要作用[17]。本研究結果顯示，模型組、rhEPO組、ADMSC組、聯(lián)合組大鼠的NT-3、BDNF、TrkC、SCG10、CGRP水平均高于正常組(均P<0.05)，這可能是因為脊髓損傷反饋性刺激機體生成NT-3、BDNF、TrkC、SCG10、CGRP等神經(jīng)營養(yǎng)因子，以修復損傷的神經(jīng)系統(tǒng)。而給予rhEPO、ADMSC或ADMSC聯(lián)合rhEPO干預后，脊髓損傷大鼠脊髓組織中的NT-3、TrkC、SCG10、BDNF、CGRP水平降低，其中ADMSC聯(lián)合rhEPO干預時上述指標水平降低最為明顯(均P<0.05)，這可能是因為上述干預緩解了脊髓損傷，并改善神經(jīng)功能，控制病情進展，因此上述神經(jīng)營養(yǎng)因子水平相應地降低。

Rho蛋白是小G蛋白超家族的亞家族成員，其分為Cdc42、RhoA、缺乏GTP酶活性、Racl四大類[18]。Rho蛋白對胞外基質黏附、細胞骨架重組都具有重要的調(diào)控作用，并參與脊髓損傷的炎癥反應[19]。在脊髓損傷的大鼠體內(nèi)Rho、ROCK異常表達，提示Rho/ROCK信號通路與脊髓損傷的發(fā)展有著密切的關系[20]。有研究表明，可以通過藥物等方法來抑制Rho/ROCK信號通路[19,21]。因此，我們推測或可通過抑制Rho/ROCK信號通路的激活來修復脊髓損傷。本研究結果顯示，模型組大鼠脊髓組織中Rho和ROCK蛋白的相對表達量均高于正常組(均P<0.05)；而給予ADMSC或rhEPO干預后Rho、ROCK蛋白表達量均降低，且給予ADMSC聯(lián)合rhEPO干預時兩種蛋白的表達量最低(均P<0.05)。這表明，ADMSC可抑制Rho/ROCK信號通路相關蛋白，其聯(lián)合rhEPO使用時的抑制作用更為明顯，這或許是其發(fā)揮治療脊髓損傷作用的可能機制。

綜上所述，ADMSC原位移植輔以rhEPO腹腔注射可促進脊髓損傷大鼠的脊髓神經(jīng)組織重建，改善神經(jīng)功能，干預效果優(yōu)于二者單獨使用，這可能與其抑制Rho/ROCK信號通路有關。該療法或可為臨床治療脊髓損傷提供參考依據(jù)。