鄭儷媛 錢 超 寧聰琴 孫 健

（1.上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院口腔修復(fù)科，上海交通大學口腔醫(yī)學院，國家口腔醫(yī)學中心，國家口腔疾病臨床醫(yī)學研究中心，上海市口腔醫(yī)學重點實驗室，上海 200011；2.中國科學院上海硅酸鹽研究所，高性能陶瓷和超微結(jié)構(gòu)國家重點實驗室，上海 200050）

復(fù)合樹脂充填后邊緣繼發(fā)齲問題常常導(dǎo)致修復(fù)體頻繁更換甚至充填修復(fù)失敗，減少繼發(fā)齲的發(fā)生已經(jīng)成為復(fù)合樹脂性能優(yōu)化的重要研究方向[1]。近年來氟化物的應(yīng)用受到廣泛關(guān)注，大量研究嘗試將氟化物引入復(fù)合樹脂以達到抑菌防齲的目的，這些氟化物包括低分子有機氟化物或載氟的可聚合單體，及物理摻雜水溶性或微溶性無機氟化物[2]。目前，無機填料摻氟仍是研制含氟樹脂的主要方法。然而，研究表明目前這些新型含氟復(fù)合樹脂材料的釋氟性能并不理想，且其釋放氟離子的過程往往引起材料結(jié)構(gòu)的破壞，降低其機械強度。隨著納米技術(shù)的發(fā)展和新材料的研發(fā)，納米氧化鋯已被應(yīng)用于復(fù)合樹脂填料優(yōu)化中。一方面，納米尺寸的無機填料可有效提升材料機械性能、改善美觀性能及具備抗菌潛力[3]；另一方面，氧化鋯作為一種廣泛應(yīng)用的增強材料，擁有優(yōu)越的強度和韌性，有利于保持復(fù)合樹脂的強度[4]。開發(fā)可同時發(fā)揮氟化物及納米氧化鋯優(yōu)勢的新填料成為一個重要研究方向。

過渡族金屬鋯在溶液中很難以離子形式簡單存在，可表現(xiàn)出很強的形成螯合物的特性，且一個鋯離子可與多個氟離子形成配位鍵，形成高效的“氟庫”，這是鋯鹽被用于飲用水除氟的原因[5]。本研究利用鋯離子在溶液中表現(xiàn)出很強的與氟離子形成螯合物的趨勢，以氟鋯酸銨為氟源，采用化學沉淀法與高溫煅燒工藝合成一種高純度的氟摻雜納米氧化鋯粉體，并對其進行抗菌性能評價，以期獲得一種新型抗菌性復(fù)合樹脂填料，為新型釋氟性復(fù)合樹脂的研究提供新思路。

1 材料和方法

1.1 粉體制備

以氟鋯酸銨（ZrF6NH4）為氟源，利用化學沉淀與高溫煅燒，制備摻氟量分別為10 mol%和20 mol%的氟摻雜納米氧化鋯粉體。首先，將氯氧化鋯（ZrOCl2·8H2O）溶解于無水乙醇中，配制濃度為0.5 mol/L 的鋯鹽溶液，然后依次加入3 mol%的硝酸釔（Y（NO3）3·6H2O）及上述比例的氟鋯酸銨，全程將混合溶液置于磁力攪拌器（B11-3，上海司樂儀器有限公司）上持續(xù)攪拌充分反應(yīng)。用氨水緩慢滴定調(diào)節(jié)pH 至10 得到白色沉淀。抽濾洗滌后，置于100 ℃烘箱干燥處理，得到白色塊狀前驅(qū)體。將前驅(qū)體在700 ℃條件下煅燒2 h，自然冷卻至室溫，即可得到氟摻雜納米氧化鋯粉體。按上述方法制備不含氟納米氧化鋯粉體，最終得到3組不同摻氟量的粉體：0%F-ZrO2，10%F-ZrO2和20%F-ZrO2。

1.2 晶相分析與形貌表征

運用X 射線衍射分析儀（XRD，D/MAXRBX，Rigaku，大版，日本）以Cu-Kα 作為發(fā)射源（波長為0.15418 nm），用于分析3組粉體的晶相結(jié)構(gòu)，分析角度范圍：25°～ 65°。采用掃描電子顯微鏡（SEM，S-4800N，Hitachi，日本）觀察樣品表面形貌，通過Nano Measurer 軟件進行粒徑測定。

1.3 釋氟量檢測

各組稱量0.5 g 粉體至離心管中，每管加入10 mL 去離子水，每組設(shè)置3 個平行樣，超聲震蕩10 min 使粉體充分分散，將小管放置在37 ℃恒溫搖床中24 h。離心后取各管內(nèi)上層清液，利用離子色譜儀（ICS-1100，DIONEX，美國）測量溶液中氟離子含量。

1.4 抗菌性能研究

1.4.1 細菌培養(yǎng) 實驗選用變形鏈球菌（UA159）菌株進行抗菌實驗，標準菌株由上海交通大學附屬第九人民醫(yī)院口腔微生態(tài)與系統(tǒng)性疾病實驗室提供。實驗菌種培養(yǎng)條件為37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱（Whitley DG250，Don whitley scientific，英國）?？咕鷮嶒炃埃旧R檢為純培養(yǎng)物后，利用酶標儀（Elx800，BioTek，美國）調(diào)節(jié)菌液濃度。

1.4.2 瓊脂擴散實驗（Agar-diffusion）將各組粉體壓制為10 mm×1 mm 的樣品片（0.2 g/片，n=3），紫外燈照射2 h 滅菌備用。瓊脂擴散實驗前，將菌液濃度調(diào)節(jié)為1×107CFUs/mL。每次取50 μL菌液用玻璃推棒均勻涂抹在BHI 瓊脂板上，然后將一個滅菌樣品片置于瓊脂板表面中心，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察樣品片周圍是否出現(xiàn)抑菌環(huán)，若有，則用游標卡尺測量抑菌環(huán)直徑。抑菌環(huán)直徑＞10 mm 則認為該樣品片具有離子釋放抗菌效果，實驗重復(fù)3次。

1.4.3 最低抑菌/殺菌濃度（MIC/MBC）測試 將各組粉體分散于BHI 培養(yǎng)基中制成懸濁液，超聲震蕩使其充分分散均勻，高溫滅菌后利用二倍稀釋法將其稀釋至10 個濃度梯度（80 mg/mL～156 μg/mL），然后每組每濃度取200 μL懸濁液至滅菌96 孔細胞培養(yǎng)板與20 μL 菌液（1×106CFUs/mL）共培養(yǎng)24 h，然后將各微孔中菌懸液吹打混勻，用接種環(huán)取出在BHI 瓊脂板上劃線，再將該瓊脂板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察細菌生長情況。實驗設(shè)置陰性對照組和未處理組，陰性對照組中為等體積粉體懸濁液，未處理組中為等體積同濃度菌懸液。每組設(shè)置3 個副孔，實驗重復(fù)3次。

1.4.4 菌落計數(shù)實驗（CFUs） 各組稱量（0.02±0.002）g 粉體至細菌培養(yǎng)管，紫外照射2 h滅菌，實驗前將菌液濃度調(diào)節(jié)為1×106CFUs/mL。向每個培養(yǎng)管中加入2 mL 滅菌BHI 培養(yǎng)基，再加入20 μL 菌液，充分震蕩使粉體與細菌充分接觸。培養(yǎng)24 h 后，充分震蕩混勻菌懸液，稀釋涂板，繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后進行菌落計數(shù)。實驗設(shè)置陰性對照組和未處理組，陰性對照組為等量未接種細菌的粉體懸濁液，未處理組為等體積同濃度菌懸液。每組設(shè)置3 個平行樣，實驗重復(fù)3次。抑菌率可通過以下公式計算：

抑菌率=（未處理組菌落數(shù)-實驗組菌落數(shù)）/未處理組菌落數(shù)×100%

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 25 統(tǒng)計軟件對上述實驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析和事后分析比較多樣本之間差異。數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差（），P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 晶相分析及形貌表征

從3組粉體XRD 圖譜（圖1）可以看出，經(jīng)700 ℃煅燒的納米氧化鋯粉體同時存在兩種晶相：四方相（t 相，PDF＃79-1765）和單斜相（m 相，PDF＃86-1449）。隨著氟摻雜量的增加，t 相逐漸被抑制，m 相峰值逐漸變強。與此同時，SEM圖像可見各組粉體均為粒徑較均勻的納米級粉體，通過Nano Measurer 軟件進行粒徑測定，3組粉體顆粒粒徑均在15～ 70 nm 范圍，平均粒徑依次為29.79 nm，44.25 nm 和46.64 nm（圖2～3）。

圖1 氟摻雜納米氧化鋯粉體晶相XRD 圖譜

圖2 氟摻雜納米氧化鋯粉體粒徑分布

2.2 釋氟量檢測

圖3 氟摻雜納米氧化鋯粉體SEM 表面形貌

氟摻雜納米氧化鋯粉體24 h 內(nèi)釋氟量檢測結(jié)果見表1，10%F-ZrO2和20%F-ZrO2粉體樣品均有氟離子釋放，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表1 氟摻雜納米氧化鋯粉體釋氟量（x±s）

2.3 抗菌性評價

圖4和表2顯示瓊脂擴散實驗結(jié)果圖及抑菌環(huán)測量結(jié)果，10%F-ZrO2和20%F-ZrO2樣品片周圍均出現(xiàn)明顯抑菌環(huán)，兩組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖4 氟摻雜納米氧化鋯粉體樣品片瓊脂擴散實驗的結(jié)果

表2 抑菌環(huán)直徑測量結(jié)果（x±s）

最小抑菌/殺菌實驗結(jié)果（圖5）顯示當粉體濃度達10 mg/mL 時，10%F-ZrO2和20%F-ZrO2兩組粉體相應(yīng)培養(yǎng)皿中菌落數(shù)明顯變少，具有抑菌效果；當濃度增大達到20 mg/mL 時，不見菌落生長，達到殺菌效果。以上兩組摻氟粉體抑菌/殺菌效果相當（圖5 B 和C）且均明顯優(yōu)于0%F-ZrO2組（圖5 A）。

圖5 氟摻雜納米氧化鋯粉體最小抑菌/殺菌實驗的結(jié)果

圖6 為氟摻雜納米氧化鋯粉體與變形鏈球菌共培養(yǎng)后涂板結(jié)果圖，與未處理組及0%F-ZrO2組相比，摻氟粉體的加入使變形鏈球菌的數(shù)量明顯減少，且在實驗研究范圍內(nèi)抗菌效果隨氟含量增加而愈加明顯。進行菌落計數(shù)并計算各組材料抑菌率（表3），各組間菌落數(shù)差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表3 菌落計數(shù)結(jié)果

圖6 氟摻雜納米氧化鋯粉體與變形鏈球菌共培養(yǎng)后涂板的結(jié)果

3 討論

3.1 含氟口腔復(fù)合樹脂材料研究現(xiàn)狀

自20 世紀70 年代以來，大量研究致力于含氟復(fù)合樹脂材料的研發(fā)工作，有學者將氟化鈉、氟化鉀等可溶性氟鹽摻入無機填料，這種方法簡單易行，但由于其高水溶性，氟離子釋放僅持續(xù)1～ 2 天，此后釋氟量驟減，且釋氟導(dǎo)致材料產(chǎn)生多孔結(jié)構(gòu)，機械性能變差[6-8]。相比之下，可緩釋氟的玻璃離子填料及微溶性氟鹽如氟化鈣、生物活性玻璃等，因溶解度小，釋氟進程更加緩慢和持續(xù)，復(fù)合樹脂機械性能得以保存[9，10]。目前對含氟復(fù)合樹脂材料的研究仍存在抗菌有效性和影響材料本身理化性能等問題。主要是物理摻雜的氟化物無法與無機填料形成良好的化學結(jié)合，氟離子的釋放往往表現(xiàn)為短暫的突釋，且會明顯損害材料的致密結(jié)構(gòu)。因此，要獲得更高效的含氟復(fù)合樹脂材料，必須從材料的微觀結(jié)構(gòu)入手。近年來，納米氧化鋯填料在提升材料機械性能、改善美觀性能及良好的抗菌潛力方面，比之大尺寸填料表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢[11]。如今，摻雜納米氧化鋯填料的復(fù)合樹脂產(chǎn)品如3M 公司的Filtek Z350 和Ketac Nano 已經(jīng)在臨床上廣泛應(yīng)用[12]。因此，將氟化物與納米氧化鋯填料有效結(jié)合成為了一種全新的思路。

3.2 新型氟摻雜納米氧化鋯填料的合成與表征

為實現(xiàn)上述想法，以何種方式將氟化物結(jié)合到納米氧化鋯微粒中是要解決的首要問題?？紤]到金屬鋯離子在溶液中可以高效結(jié)合氟離子，從而實現(xiàn)兩者的化學結(jié)合。且此前Burgess 團隊首次合成一種含有三氟化鋯螯合物的新型復(fù)合樹脂單體，利用這種單體創(chuàng)建高效的“氟庫”[13]，這也證明了金屬鋯離子的螯合作用可被應(yīng)用于口腔材料中。因此，本實驗中采用化學沉淀法使氯氧化鋯和氟鋯酸銨在溶液中充分反應(yīng)，并通過高溫煅燒的方法獲得高純度的氟摻雜納米氧化鋯粉體。通過粉體釋氟量檢測，結(jié)果證明粉體有氟離子有效釋放（表1）。此外，晶相分析和表面形貌表征結(jié)果（圖1）顯示氟離子的添加不改變氧化鋯粉體的微觀形貌，但可引起氧化鋯晶相變化，四方相峰值減弱而單斜相峰值增高，且變化程度與摻氟量成正相關(guān)。這些都直接或間接說明了本實驗氟化物與納米氧化鋯微粒的有效結(jié)合。但單純通過以上表征手段尚無法準確判斷氟離子在氧化鋯晶格中的鍵合形式，仍需后續(xù)實驗進一步研究其結(jié)合機理。

3.3 新型氟摻雜納米氧化鋯填料的抗菌性能評價

眾所周知，齲病的發(fā)生不是因為缺乏氟化物，但氟化物已被證實確能起到有效的抑菌抗齲作用。氟離子可作用于以變形鏈球菌為主的產(chǎn)酸口腔菌群，抑制細菌中與糖酵解和細胞氧化有關(guān)的酶，也可抑制細菌攝入葡萄糖，影響細菌產(chǎn)酸。Marquis R.E.等人進行體外實驗認為：低濃度的氟離子時即可發(fā)揮抑制變形鏈球菌生長的效果[14]。為驗證粉體釋氟對變形鏈球菌的抗菌效果，本實驗采用瓊脂擴散實驗，最小抑菌/殺菌濃度測定和細菌涂板計數(shù)3 種經(jīng)典定性和定量實驗方法進行材料抗菌性能評價[15]。瓊脂擴散實驗是評價釋出型抗菌材料抗菌性的重要方法，通過這種方法可驗證本實驗粉體通過氟離子釋出達到抑菌作用，且此結(jié)果（圖2 及表2）與粉體釋氟量測定結(jié)果（表1）相一致。由于氟離子的抗菌作用受實驗細菌濃度及周圍環(huán)境pH 值等因素影響[16]，利用最小抑菌/抗菌濃度測試可確定本實驗條件下，10%F-ZrO2組和20%F-ZrO2組粉體在20 mg/mL 濃度時可達到顯著的殺菌作用。綜合菌落計數(shù)結(jié)果計算各組粉體的抑菌率可知，本實驗制備的這種新型氟摻雜納米氧化鋯填料可有效抑制口腔變形鏈球菌的生長繁殖，在本實驗研究范圍內(nèi)，20%F-ZrO2組粉體表現(xiàn)出最佳的抑菌效果。未來我們將對粉體進行優(yōu)化篩選，進一步研制兼具抑菌抗齲功能且滿足臨床性能要求的新型材料。

4 結(jié)論

綜上所述，本實驗成功制備氟摻雜納米氧化鋯粉體，具備優(yōu)異的抗菌效果，為此后進行新型含氟復(fù)合樹脂材料的研究打下基礎(chǔ)，在口腔充填修復(fù)領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。