吳麗娜，程 功，焦思明，馮 翠，李建軍，杜昱光

(中國(guó)科學(xué)院過(guò)程工程研究所生化工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100190)

幾丁質(zhì)是一種由β-1，4糖苷鍵連接N-乙酰氨基葡萄糖的聚合物，它主要從蝦、蟹殼和昆蟲的外骨骼中分離純化獲得；幾丁寡糖是幾丁質(zhì)的降解產(chǎn)物，基于幾丁寡糖的抗氧化性、生物相容性、生物可降解性及無(wú)毒性質(zhì)，其常被應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)、食品工程和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域[1]。在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，幾丁寡糖可作為傷口敷料成分、抗菌藥物、防御細(xì)胞凋亡及糖尿病藥物等[2]。目前，幾丁寡糖可以通過(guò)物理法、化學(xué)法、酶水解及微生物水解法獲得[3-5]。相比之下，酶水解和微生物水解法可以在溫和的條件下進(jìn)行，更具有可控性和可預(yù)測(cè)性，并且綠色環(huán)保，成了研究的熱點(diǎn)。但是目前主要使用的是非特異性酶，包括纖維素酶、果膠酶和淀粉酶等[6]。幾丁質(zhì)酶廣泛存在于植物、真菌和昆蟲等生物中，能夠特異性地水解幾丁質(zhì)的β-1,4-糖苷鍵，又可分為內(nèi)切幾丁質(zhì)酶和外切幾丁質(zhì)酶。幾丁質(zhì)酶主要采用提取法獲得，所以大批量獲取受限。為了解決這問(wèn)題，科學(xué)家已經(jīng)成功在雙態(tài)真菌、巴斯德畢赤酵母、大腸桿菌和芽孢桿菌等宿主中表達(dá)幾丁質(zhì)酶[7-10]。通過(guò)幾丁質(zhì)酶的異源表達(dá)可以提高幾丁質(zhì)酶的產(chǎn)量，同時(shí)降低酶的獲取成本，還可以制備組分豐富、新穎結(jié)構(gòu)幾丁寡糖，進(jìn)一步提升產(chǎn)物的生物活性。

木瓜蛋白酶(papain)，主要存在于番木瓜(Caricapapaya)的果實(shí)與莖葉中。在木瓜蛋白酶中存在能降解幾丁質(zhì)的幾丁質(zhì)酶，野生型番木瓜的幾丁質(zhì)酶活性均高于大豆、甜菜和馬尾松等多種植物的幾丁質(zhì)酶活性[11]，降解底物的最適pH為4.0～5.0，最適反應(yīng)溫度為40～45 ℃，表現(xiàn)出比較好的穩(wěn)定性，具有進(jìn)一步應(yīng)用開發(fā)的潛力[12-13]。但是，在木瓜蛋白酶中能有效降解幾丁質(zhì)的幾丁質(zhì)酶類含量很低，增加了幾丁質(zhì)酶獲取所需的成本[14]。因此，為了降低番木瓜幾丁質(zhì)酶的獲取成本，將其在異源宿主中高效表達(dá)就可解決上述問(wèn)題[15-16]。巴斯德畢赤酵母是甲醇酵母的一種，由于后續(xù)的純化加工便利，畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)越來(lái)越受到歡迎，目前已經(jīng)有400多種外源蛋白在這個(gè)系統(tǒng)中成功表達(dá)[17]。

在本研究中，筆者利用巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)對(duì)來(lái)源于番木瓜的幾丁質(zhì)酶基因進(jìn)行分泌表達(dá)并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，同時(shí)利用該酶水解低脫乙酰度殼聚糖，并對(duì)水解產(chǎn)物進(jìn)行分析，以期為進(jìn)一步的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

E.coliDH5α化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞、T4連接酶、膠回收試劑盒以及質(zhì)粒提取試劑盒，寶日醫(yī)(北京)生物技術(shù)有限公司；XhoⅠ、NotⅠ、BglⅡ、畢赤酵母GS115、乙腈(色譜純)，美國(guó)Thermo Fisher公司；甲殼素、3-(三甲基甲硅烷基)丙酸-d4鈉鹽，Sigma-Aldrich公司；無(wú)氨基酸酵母氮源(YNB)，Difco公司；蛋白Marker，北京索萊寶科技有限公司；畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9，湖南科愛(ài)醫(yī)療器械有限公司。根據(jù)畢赤酵母密碼子的偏好性對(duì)pPIC9信號(hào)肽核酸序列優(yōu)化后得到載體pGBG1[18]。

YPD培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20、蛋白胨20、酵母膏10；YPD平板另加瓊脂15。

BMGY生長(zhǎng)培養(yǎng)基(g/L)：YNB 13.4、甘油 10、生物素 0.000 4、K3PO4緩沖溶液 0.1 mol/L；pH 6.0。

甲醇緩沖復(fù)合培養(yǎng)基(BMMY)誘導(dǎo)培養(yǎng)基(1 L)：YNB 13.4 g、甲醇 0.5%(體積分?jǐn)?shù))、生物素 0.000 4 g、K3PO4緩沖溶液 0.1 mol；pH 6.0。

1.2 儀器與設(shè)備

DYY-6C型核酸及蛋白電泳系統(tǒng)，北京六一儀器廠；Tanon-1600型凝膠成像系統(tǒng)，上海天能科技有限公司；L535R型低溫冷凍離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；MicroPulserTM電轉(zhuǎn)儀，Bio-Rad公司；ACQUITY UPLC BEH Amide色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)、XEVO G2-S QTOF質(zhì)譜儀(配有Lock-spray 接口)、電噴霧離子源( ESI)及質(zhì)譜工作站軟件(Masslynx 4.1)，Waters公司；AVANCE III 600 MHz型核磁共振儀，瑞士Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 番木瓜幾丁質(zhì)酶基因全合成及表達(dá)載體構(gòu)建

基于來(lái)源于番木瓜的幾丁質(zhì)酶基因序列(GenBank:3CQL_A)，人工設(shè)計(jì)畢赤酵母偏好的密碼子，并在合成前對(duì)5′及3′末端分別添加X(jué)hoⅠ及NotⅠ酶切位點(diǎn)，進(jìn)行全基因合成(委托北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司完成)。利用XhoⅠ及NotⅠ分別對(duì)含有目標(biāo)基因序列的pUC18及表達(dá)載體pGBG1進(jìn)行雙酶切，再分別回收目標(biāo)基因序列片段及線性化的pGBG1載體，然后在T4連接酶作用下連接并轉(zhuǎn)入E.coliDH5α化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞中，最后對(duì)構(gòu)建的表達(dá)盒進(jìn)行酶切及測(cè)序驗(yàn)證。

1.3.2 番木瓜幾丁質(zhì)酶畢赤酵母表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)

1)外源蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)。利用BglⅡ線性化目的基因的表達(dá)盒，對(duì)含有目的基因的片段進(jìn)行切膠回收。采用電轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化到畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞中。選擇組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷的基礎(chǔ)葡萄糖(MD)平板篩挑選重組子，接著利用含有膠體幾丁質(zhì)(0.5%)的含有甲醇的緩沖性復(fù)雜培養(yǎng)基(BMMY)瓊脂平板進(jìn)一步篩選水解圈最大的菌株。

對(duì)篩選的菌株進(jìn)行搖瓶誘導(dǎo)表達(dá)，先挑一個(gè)單菌落接入25 mL BMGY培養(yǎng)基，在 30 ℃、250 r/min條件下培養(yǎng)16～18 h，當(dāng)OD600為2～6時(shí)，室溫下1 500g離心5 min除去上清液，使沉淀懸浮在100 mL BMMY培養(yǎng)基里。添加甲醇至終體積分?jǐn)?shù)為0.5%，之后每24 h添加一次，之后分別取樣(0、24、48、72、96、120和144 h)1 mL，12 000 r/min離心3 min，上清液、沉淀分開保存，SDS-PAGE分析。

接著進(jìn)行大量表達(dá)，挑一個(gè)單菌落接種到5 mL BMGY培養(yǎng)基里，在30 ℃、250 r/min條件下培養(yǎng)至OD600為2～6。將5 mL菌液全部接入200 mL BMGY培養(yǎng)基，在30 ℃、250 r/min培養(yǎng)至OD600為2～6。室溫下1 500g離心5 min，除去上清液，沉淀懸浮在400 mL BMMY培養(yǎng)基里(OD600=1.0)。每24 h添加一次甲醇終體積分?jǐn)?shù)為0.5%，總共表達(dá)5 d。室溫下5 000g離心5 min，上清液和菌體分開保存，儲(chǔ)存在4 ℃，上清液即為含有番木瓜幾丁質(zhì)酶的粗酶液。

2)酶學(xué)性質(zhì)研究。利用SDS-PAGE檢測(cè)蛋白表達(dá)情況，再由Bradford法測(cè)定粗酶液中的蛋白質(zhì)量濃度。參照文獻(xiàn)[19]制備脫乙酰度62%殼聚糖并作為反應(yīng)底物，采用 3,5-二硝基水楊酸(DNS)法測(cè)定幾丁質(zhì)酶活性[20]。室溫下將DNS溶液(1.5 mL)、粗酶(0.18 mg/mL，80 μL)、脫乙酰度62%殼聚糖(100 μL)混合反應(yīng)30 min，同時(shí)做2個(gè)平行。沸水浴煮沸5 min顯色，冷卻后用蒸餾水稀釋至5 mL，用分光光度計(jì)比色(540 nm)，以對(duì)照液調(diào)零點(diǎn)。根據(jù)N-乙酰氨基葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算還原糖的含量。

幾丁質(zhì)酶活性單位(U)定義為每分鐘生產(chǎn)1 μmol還原糖所需的酶量。

發(fā)酵酶活定義為1 mL待測(cè)酶液具有多少個(gè)酶活性單位，U/mL。

比酶活(U/mg)定義為在特定條件下單位質(zhì)量(mg)酶所具有的酶活性單位數(shù)。

①pH對(duì)表達(dá)外源蛋白的影響。在pH 3.6～5.6時(shí)使用50 mmol/L的乙酸鈉緩沖液，在pH 6.0～8.0時(shí)使用50 mmol/L的磷酸緩沖液，測(cè)定pH為 3.6～8.0時(shí)該酶活性，篩選出最適pH。把酶在最適pH時(shí)的初始比酶活作為100%，將不同pH時(shí)的比酶活和最適pH時(shí)的初始酶活進(jìn)行比較，即可得到不同pH條件下的相對(duì)酶活。

②反應(yīng)溫度對(duì)該酶酶活的影響。在最適pH、不同溫度下(30～60 ℃)，測(cè)定幾丁質(zhì)的酶活性。為了取得該酶的熱穩(wěn)定性，分別在40、50、60、70及80 ℃下處理幾丁質(zhì)酶，每隔20 min測(cè)定殘留酶活一次，總時(shí)長(zhǎng)1 h。把酶在最適pH或最優(yōu)條件下(最適pH和溫度)的初始比酶活作為100%，在不同溫度或時(shí)間點(diǎn)的殘余比酶活和最適pH或最優(yōu)條件下的初始酶活進(jìn)行比較，即得到不同溫度或時(shí)間點(diǎn)的相對(duì)比酶活。

1.3.3 低脫乙酰殼寡糖制備及組成與結(jié)構(gòu)分析

對(duì)脫乙酰度為62%的殼聚糖用表達(dá)的幾丁質(zhì)酶制備部分乙?；瘹す烟荹19]。先稱取50 g脫乙酰度為62%的殼聚糖，用水定容至1 000 mL，選用乙酸調(diào)節(jié)pH到6.0。將100 mL幾丁質(zhì)酶粗酶液緩緩加入，事先設(shè)置好溫度為40 ℃，攪拌反應(yīng)48 h。反應(yīng)結(jié)束后，為了對(duì)幾丁質(zhì)酶進(jìn)行滅活，升溫到90 ℃并保持10 min。接著離心去除不溶物，對(duì)于溶液進(jìn)行回收凍干，備用后續(xù)分析。

超高壓液相分析條件：使用Waters ACQUITY UPLC BEH Amide色譜柱，流動(dòng)相為0.1%甲酸水(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～2 min 15% A；2～32 min 15%～50% A；32～33 min 50%～80% A；33～36 min 80% A；36～37 min 80%～15% A；37～44 min 15% A)，柱溫35 ℃，流速0.3 mL/min，進(jìn)樣量1 μL。

質(zhì)譜檢測(cè)條件：ESI 源、正離子掃描模式，毛細(xì)管電壓3 kV、錐孔電壓60 V、離子源溫度150 ℃、脫溶劑氣溫度500 ℃、錐孔氣流量50 L/h、脫溶劑氣流量為800 L/h、碰撞能量30～60 V、離子能量3 V、每0.25 s采集1次圖譜。質(zhì)量掃描范圍150～2 000m/z。使用Masslynx 4.1質(zhì)譜工作站軟件對(duì)獲取的液質(zhì)結(jié)果進(jìn)行分析，事先用超純水配制1.0 mg/mL殼寡糖溶液，用于液質(zhì)檢測(cè)。

利用1H NMR及13C NMR對(duì)制備的殼寡糖的還原端及非還原端單糖組成分別進(jìn)行分析，主要操作包括：第一步，稱取25 mg制備好的殼寡糖凍干樣品，加入0.50 mL D2O，充分溶解后加樣檢測(cè)。第二步，內(nèi)標(biāo)是 3-(三甲基甲硅烷基)丙酸-d4鈉鹽，樣品檢測(cè)儀器選用 AVANCE Ⅲ 600 MHz型核磁共振儀，其中，1H NMR檢測(cè)時(shí)對(duì)水峰進(jìn)行抑制減低干擾。最后，將獲得的原始數(shù)據(jù)運(yùn)用分析軟件MestReNova進(jìn)行分析，使用內(nèi)標(biāo)校正位移值后，對(duì)特定部位單糖進(jìn)行標(biāo)記(參照文獻(xiàn)[21]的方法)，具體的參考位化學(xué)移包括1H NMR中的還原端N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)(-A，δ5.19)、還原端(氨基葡萄糖)GlcN(-D，δ5.43)以及13C NMR中5位碳(C5)的非還原端GlcNAc(A-，δ78.5)及非還原端GlcN(D-，δ79.0)。

2 結(jié)果與討論

2.1 番木瓜幾丁質(zhì)酶基因的克隆及畢赤酵母表達(dá)

番木瓜幾丁質(zhì)酶含243個(gè)氨基酸，對(duì)畢赤酵母偏好的密碼子設(shè)計(jì)了該酶的基因序列，同時(shí)重新命名新的基因序列為cpchi19(GenBank: MG595780)。將合成后獲得的基因構(gòu)建到畢赤酵母表達(dá)載體pGBG1中[22]。采用瓊脂糖電泳對(duì)酶切結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知：具有目的基因的表達(dá)載體經(jīng)XhoⅠ及NotⅠ雙酶切后，在750～1 000 bp附近出現(xiàn)了1個(gè)條帶(E1)，與目的基因(765 bp)大小相一致；2個(gè)片段(E2)由BglⅡ?qū)|(zhì)粒線性化后獲得，其中cpchi19的片段出現(xiàn)在10 kb附近，而抗性基因片段在3 kb附近(圖1(a))。雙末端測(cè)序結(jié)果也表明，目的基因被正確連接至表達(dá)載體中。

將含有目的基因的表達(dá)盒cpchi19-pGBG1線性化片段轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115中，選用甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物(Cpchi19)進(jìn)行SDS-PAGE分析(圖1(b))。由圖1(b)可知，在(2.5～3.5)×104附近出現(xiàn)的蛋白條帶(P1)與該蛋白的預(yù)測(cè)值(2.77×104)一致，其中Bradford法測(cè)定粗酶液中的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為0.18 mg/mL。

E1—Xho I和Not I雙酶切產(chǎn)物；E2—BglⅡ酶切產(chǎn)物；M1—標(biāo)準(zhǔn)DNA；M2—標(biāo)準(zhǔn)蛋白；P1—誘導(dǎo)5 d表達(dá)的粗蛋白(離心后的上清液)圖1 幾丁質(zhì)酶基因cpchi19重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)物(a)及其蛋白表達(dá)產(chǎn)物(b)電泳圖譜Fig.1 Electrophoresis analysis of recombinant chitinase gene cpchi19 digestion by restriction enzymes (a) and overexpressed crude protein after induced for five days (supernatants after centrifuged) (b)

當(dāng)前，木瓜蛋白酶中幾丁質(zhì)降解酶類的研究主要集中在其分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定方面，確定了發(fā)揮幾丁質(zhì)降解活性的主要為糖苷水解酶19家族幾丁質(zhì)酶[16]。目前，多種來(lái)源的幾丁質(zhì)酶已在異源宿主系統(tǒng)中成功重組表達(dá)，例如大腸桿菌和枯草芽孢桿菌[23]。真菌對(duì)甲殼質(zhì)的環(huán)境降解作用比細(xì)菌要強(qiáng)，但對(duì)真菌的了解比細(xì)菌的卻少得多[24]。由于幾丁質(zhì)酶的多樣性和復(fù)雜性，通過(guò)天然或異源表達(dá)獲得的酶產(chǎn)率是影響整個(gè)過(guò)程生產(chǎn)率的關(guān)鍵因素。在本研究中，首次實(shí)現(xiàn)了番木瓜幾丁質(zhì)酶在畢赤酵母中的分泌表達(dá)。

2.2 幾丁質(zhì)酶Cpchi19的酶學(xué)性質(zhì)研究

使用DNS法測(cè)定Cpchi19的酶學(xué)性質(zhì)，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知：該酶的最適pH為5.6，最適反應(yīng)溫度為75 ℃，在上述最適反應(yīng)條件下的發(fā)酵酶活為0.32 U/mL。該酶在70 ℃及以下時(shí)較穩(wěn)定，熱處理1 h后酶活變化不大，但當(dāng)溫度升高至80 ℃時(shí)，該酶很快失活(圖2(c))，并在處理20 min后不再具備活性。與文獻(xiàn)[14]的最適pH為4.0～5.0及最適溫度為40～45 ℃的結(jié)果有差異，主要原因可能是部分研究者使用的粗木瓜蛋白酶有差異，還可能酶不純，存在其他水解酶類，而本研究使用的為過(guò)表達(dá)的幾丁質(zhì)酶。本研究中，表達(dá)的幾丁質(zhì)酶熱穩(wěn)定性較好，在70 ℃及以下時(shí)處理1 h，酶活未見(jiàn)明顯降低，這對(duì)于后期基于畢赤酵母高密度發(fā)酵及噴霧干燥規(guī)模制備寡糖工藝具有很大的優(yōu)勢(shì)，可以很大程度降低酶制劑的制備成本。從最適溫度測(cè)定結(jié)果來(lái)看，該酶在60 ℃時(shí)即可呈現(xiàn)約90%的酶活，這是利用該酶規(guī)模化制備幾丁寡糖和部分乙?；瘹す烟禽^適合的溫度。但是，當(dāng)水解幾丁質(zhì)和部分乙?；瘹ぞ厶堑臏囟冗M(jìn)一步升高時(shí)，副反應(yīng)如Millard反應(yīng)可能增強(qiáng)，將會(huì)影響產(chǎn)物寡糖的純度。

圖2 pH、溫度對(duì)幾丁質(zhì)酶Cpchi19的影響及其熱穩(wěn)定性Fig.2 Effects of pH (a) and temperature (b) on the activity of chitinase Cpchi19 and its thermostability (c)

2.3 幾丁質(zhì)酶Cpchi19水解部分乙酰化殼聚糖產(chǎn)物的組成及末端結(jié)構(gòu)特征分析

對(duì)部分乙?；瘹ぞ厶?脫乙酰度62%)的水解產(chǎn)物利用UPLC-QTOF MS進(jìn)行檢測(cè)及分析，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知：水解產(chǎn)物在一定程度上分離。對(duì)利用16個(gè)典型峰(A～P)的質(zhì)譜信息，在這些峰中共計(jì)找到38個(gè)較為明顯的潛在部分乙酰化殼寡糖組分。根據(jù)一級(jí)質(zhì)譜信息，對(duì)這些不同質(zhì)荷比(m/z)潛在部分乙酰化殼寡糖組分的組成進(jìn)行推測(cè)，發(fā)現(xiàn)它們?yōu)榫酆隙?～20的不同脫乙酰度的殼寡糖(表1)。對(duì)照液相的總離子流圖譜與質(zhì)譜信息結(jié)果，發(fā)現(xiàn)部分乙?；瘹す烟歉鶕?jù)其中含有的氨基葡萄糖(GlcN)的數(shù)量由少至多出峰。不過(guò)該色譜柱難以有效分離含有相同數(shù)量GlcN但不同數(shù)量的N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)的寡糖組分。綜合上述或分析，低脫乙酰度殼聚糖在該酶水解下可以獲得多種部分乙?；瘹す烟墙M分，這與使用傳統(tǒng)的高脫乙酰度殼聚糖底物相比，改用低脫乙酰度殼聚糖獲得的部分乙?；瘹す烟钱a(chǎn)物的組分更加多樣。

圖3 Cpchi19酶解產(chǎn)物總離子流圖(a)及質(zhì)譜圖(b)Fig.3 TIC (a) and mass spectrogram (b) ofhydrolysis productsbyCpchi19

該研究結(jié)果與我們前期研究結(jié)論類似，所有殼寡糖組分中均含有GlcNAc[25]。將此結(jié)果與來(lái)源于糖苷水解酶18家族的里氏木霉幾丁質(zhì)酶水解產(chǎn)物進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)在獲得的寡糖組分中除了GlcNAc的含量明顯偏高，還含有全乙酰化的幾丁三糖及幾丁四糖產(chǎn)物，而部分乙酰化殼寡糖組分中的N-乙酰氨基葡萄糖含量均不小于氨基葡萄糖的含量[26]。另外，上述結(jié)果表示來(lái)源于糖苷水解酶19家族的木瓜幾丁質(zhì)酶在水解部分乙酰化的殼聚糖時(shí)，對(duì)糖鏈中GlcNAc的豐度有一定的要求。研究證實(shí)，殼寡糖發(fā)揮生理功能的主要方式可能為與動(dòng)植物特定受體結(jié)合。目前已知的絕大部分殼寡糖受體，如甘露糖受體[27]、植物幾丁質(zhì)受體[28]及幾丁質(zhì)酶樣結(jié)合蛋白YKL39[29]和YKL40[30]等，均可識(shí)別部分乙?；瘹す烟擎溨械腉lcNAc。利用本研究獲得的幾丁質(zhì)酶制備部分乙?；臍す烟牵梢垣@得相對(duì)富集的GlcNAc含量較高的殼寡糖并且可能具有更高的生物活性。

為了了解酶解產(chǎn)物部分乙酰化殼寡糖的還原端及非還原末端結(jié)構(gòu)特征，使用1H NMR及13C NMR進(jìn)行鑒定，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知：產(chǎn)物的還原末端主要為GlcNAc，同時(shí)還含有少量GlcN；非還原末端則同時(shí)包含GlcNAc及GlcN?？偟膩?lái)說(shuō)，該幾丁質(zhì)酶優(yōu)先水解糖苷鍵GlcNAc-GlcNAc和GlcNAc-GlcN，GlcN-GlcNAc在一定程度上被水解。幾丁質(zhì)酶主要分布在糖苷水解酶18及19家族中，而植物幾丁質(zhì)酶根據(jù)序列同源性又可以分為5類：第Ⅰ、Ⅱ及Ⅳ類屬于19家族糖苷水解酶；第Ⅲ及第Ⅴ類屬于18家族。本研究表達(dá)的幾丁質(zhì)酶在氨基酸序列上與第Ⅰ家族植物幾丁質(zhì)酶同源性較高，被糖活性酶數(shù)據(jù)庫(kù)(www.cazy.org)歸屬為Ⅰ類幾丁質(zhì)酶，而Subroto等[15]考慮到該酶沒(méi)有Ⅰ類幾丁質(zhì)酶典型的幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，將其歸類至Ⅱ類幾丁質(zhì)酶。目前，針對(duì)該酶對(duì)部分乙?；瘹ぞ厶堑孜锏淖R(shí)別特異性尚缺乏研究。Sasaki等[21]對(duì)水稻來(lái)源的第Ⅰ及

表1 Cpchi19水解產(chǎn)物組分鑒定

圖4 Cpchi19酶解產(chǎn)物1H NMR及13C NMR分析Fig.4 1H NMR and 13C NMR spectra of hydrolysis products by Cpchi19

第Ⅲ類幾丁質(zhì)酶水解不同脫乙酰度殼聚糖的產(chǎn)物結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)水稻Ⅰ類幾丁質(zhì)酶水解產(chǎn)物部分乙酰化殼寡糖的非還原末端主要為GlcNAc，同時(shí)含有少量的GlcN。這與本研究表達(dá)的幾丁質(zhì)酶性質(zhì)類似，還原端則大部分為GlcNAc，而本研究表達(dá)的幾丁質(zhì)酶水解產(chǎn)物的非還原端則同時(shí)包含GlcNAc及GlcN。因此，本研究表達(dá)的幾丁質(zhì)酶在識(shí)別部分乙?；瘹ぞ厶堑孜锷吓c水稻Ⅰ類幾丁質(zhì)酶存在一定的差異，具有獨(dú)特的水解特征。

3 結(jié) 論

對(duì)于來(lái)源于番木瓜的幾丁質(zhì)酶基因在畢赤酵母中成功分泌表達(dá)，搖瓶條件下的蛋白質(zhì)表達(dá)量為0.18 mg/mL，酶活為0.32 U/mL。通過(guò)酶學(xué)性質(zhì)研究表明該酶的最適pH和溫度分別為5.6和75 ℃，在70 ℃及以下較穩(wěn)定，證明了該幾丁質(zhì)酶具有良好的熱穩(wěn)定性，具備很好的工業(yè)應(yīng)用潛力。為了進(jìn)一步研究該酶的水解特性，對(duì)低脫乙酰度殼寡糖進(jìn)行了酶解研究，隨后對(duì)其組成及結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行了分析鑒定,結(jié)果發(fā)現(xiàn),酶解產(chǎn)物中含有聚合度2～20、不同脫乙酰度的38個(gè)殼寡糖組分，可得到還原端及非還原端均同時(shí)含有N-乙酰氨基葡萄糖及氨基葡萄糖?？偟膩?lái)說(shuō)，與傳統(tǒng)殼寡糖相比，番木瓜幾丁質(zhì)酶水解制備的低脫乙酰度殼寡糖組分更加多樣，可能具有更高的生物活性，為商業(yè)應(yīng)用性奠定基礎(chǔ)。