戴意強，吳 寒，單成俊，劉小莉，王 英，程先玲，周劍忠，夏秀東

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇南京210014；2.江蘇惠田農(nóng)業(yè)科技開發(fā)有限公司，江蘇揚州211400)

黑莓屬于多年生木本植物，黑莓果成熟時為紫黑色，柔軟多汁，味道酸中帶甜[1]。黑莓含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，如維生素E和維生素K[2]，多種礦物質(zhì)元素[3]，大量具有高生物活性的酚類化合物(包括花色苷、黃酮醇、鞣花酸、綠原酸、沒食子酸、單寧和槲皮素等)。這些物質(zhì)使得黑莓具有多種生物活性功能，如抗氧化、調(diào)節(jié)代謝、提高免疫、消除疲勞和延緩衰老等，特別是在防治心臟疾病、降低膽固醇含量和抗癌等方面具有獨特的功效[4]。黑莓的采收季節(jié)(夏季)溫度高，且黑莓果實水分含量高、質(zhì)地較軟，使得黑莓的儲藏和運輸非常困難，因此，除極少部分鮮食外，大部分黑莓都用于深加工。目前市場上主要的黑莓產(chǎn)品為黑莓果汁、黑莓酒和黑莓果干等，但是與其相關的發(fā)酵飲料較少。

紅茶菌也被稱為海寶或胃寶，以糖茶水為原料，經(jīng)一種或多種酵母菌和醋酸菌、少部分含有乳酸菌混合發(fā)酵而成[5]。紅茶菌發(fā)酵受共生微生物驅(qū)動，在發(fā)酵過程中會發(fā)生許多生物化學反應，主要包括醇、醛的形成，以及醇、醛向酸、酯的轉(zhuǎn)化[6]，其主要代謝產(chǎn)物包括醋酸、乳酸、乙醇、葡萄糖醛酸、游離氨基酸和維生素等[7]。因此，紅茶菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物及底物構成了發(fā)酵產(chǎn)品中主要的風味物質(zhì)[8]。此外，紅茶菌對人體健康有許多有益的作用，如抗氧化、降血脂、抗高血糖、抗菌、降糖和抗癌等[9]。

為解決黑莓難以儲藏的問題，豐富黑莓產(chǎn)品種類，本研究以黑莓汁為原料，通過紅茶菌發(fā)酵以改善黑莓汁風味和口感，提高黑莓汁功能特性。本文研究在不同發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間下，紅茶菌發(fā)酵黑莓汁中微生物數(shù)量、pH、色差以及多糖、蔗糖、葡萄糖、果糖、有機酸和花色苷含量的影響，以期開發(fā)一種全新的紅茶菌發(fā)酵黑莓汁飲料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅茶菌來自于江蘇省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所實驗室，保藏于紅茶水中，主要的微生物菌系為醋酸菌、酵母菌和乳酸菌；黑莓來源于南京市溧水區(qū)白馬種植基地。

蔗糖、葡萄糖、果糖、草酸、L-蘋果酸、乙酸和乳酸標準品，上海源葉生物科技有限公司；苯酚、濃H2SO4、KH2PO4、無水乙醇、KCl和NaAc，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

FiveEasy Plus pH計，梅特勒-托利多有限公司；3nH臺式色差儀，深圳市三恩時科技有限公司；Agilent 1290型高效液相色譜，安捷倫科技有限公司；3K15型離心機，美國Sigma公司。

1.3 紅茶菌發(fā)酵黑莓汁工藝

參照文獻[10]的方法，紅茶菌種子液是由紅茶菌在含糖紅茶水中培養(yǎng)得到。將紅茶菌種子液3 000 r/min離心5 min，去上清液后，用無菌水清洗沉淀后再次離心，重復3次，得到紅茶菌接種液(微生物數(shù)量為107～108CFU/mL)。將黑莓清洗、瀝干后破碎打漿，離心后得到黑莓汁。將1 L黑莓汁放入2 L的圓柱形發(fā)酵罐中(直徑為12 cm，高為19.5 cm)，并于85 ℃下殺菌20 min。待冷卻后，接入體積分數(shù)5%的紅茶菌接種液，并分別在28和37 ℃下靜置發(fā)酵20 d。

1.4 發(fā)酵黑莓汁中微生物數(shù)量的測定

將紅茶菌接入黑莓汁中后，每隔2 d取一次樣，并通過文獻[11]的方法測定發(fā)酵過程中醋酸菌、酵母菌和乳酸菌數(shù)量的變化。微生物熒光定量PCR反應中引物及序列如表1所示。

表1 醋酸菌、酵母菌和乳酸菌特異性引物的名稱及序列

1.5 pH和色差的測定

將發(fā)酵黑莓汁混勻后，用pH計直接測定發(fā)酵黑莓汁pH。發(fā)酵黑莓汁的L*、a*和b*值用臺式色差儀直接測定：L*為亮度，正值時表示色澤明亮，負值時表示色澤較暗；a*為紅綠色，正值時表示紅度，負值時表示綠度；b*為黃藍度，正值時表示黃度，負值時表示藍度。

1.6 發(fā)酵黑莓汁中多糖含量的測定

吸取1 mL發(fā)酵黑莓汁，置于50 mL具塞離心管中，加入20 mL無水乙醇，渦旋振蕩，于4 ℃提取1 h后，4 000 r/min離心10 min，棄上清液；不溶物用80%乙醇溶液洗滌后再次離心，將沉淀用去離子水溶解后離心，取上清液，殘渣洗滌2次；將所有上清液轉(zhuǎn)入50 mL容量瓶中并加水定容。1 mL試樣中加入1.0 mL 5%苯酚和5.0 mL濃H2SO4，混勻后30 ℃水浴20 min，490 nm處測定吸光值，根據(jù)葡萄糖溶液標準曲線計算出多糖含量。

1.7 發(fā)酵黑莓汁中蔗糖、葡萄糖和果糖含量的測定

發(fā)酵黑莓汁經(jīng)11 000 r/min離心后過0.45 μm濾膜，樣品稀釋10倍后測定。將標準品蔗糖、葡萄糖和果糖用超純水制備成10 mg/mL的母液待用。流動相為水，流速為0.5 mL/min，色譜柱為Agilen Hi-Plex Ca糖分析柱(7.7 mm×300 mm，8 μm)，檢測器為示差折光檢測器，柱溫為80 ℃，進樣量為25 μL。以質(zhì)量濃度(1.0、0.8、0.4、0.2和0.1 mg/mL)為橫坐標、峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，由標準曲線得到發(fā)酵黑莓汁中蔗糖、葡萄糖和果糖含量。

1.8 發(fā)酵黑莓汁中有機酸的測定

根據(jù)參照文獻[10]的方法測定發(fā)酵黑莓汁中有機酸含量。發(fā)酵黑莓汁經(jīng)11 000 r/min離心，上清液用0.45 μm濾膜過濾。HPLC條件：色譜柱為Phenomenex Luna C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相為20 mmol/L KH2PO4(pH 2.4)，含體積分數(shù)3%甲醇；流速0.6 mL/min；柱溫28 ℃；檢測波長220 nm。

1.9 發(fā)酵黑莓汁中花色苷含量的測定

參照文獻[14]的測定方法。取2份0.1 mL的發(fā)酵黑莓汁，分別加入0.2 mol/L的KCl(pH 1.0)和0.2 mol/L的醋酸鈉(pH 4.5)0.9 mL，反應1 h后，分別測定樣品在510和700 nm處的吸光值。利用下式計算花色苷含量。

花色苷含量=ΔAWmD×1 000/ε

(1)

式中：ΔA為[(A510-A700)pH1.0-(A510-A700)pH4.5]，mg/L；Wm為矢車菊素-3-葡萄糖苷分子質(zhì)量449.2；D為稀釋倍數(shù)；ε為矢車菊素-3-葡萄糖苷的消光系數(shù)(26 900)。

1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有數(shù)據(jù)均來自3個重復的試驗，結果以“平均值±標準差”表示。采用SPSS 16.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，采用Duncan’s法進行多重比較。

2 結果與討論

2.1 黑莓汁發(fā)酵過程中微生物數(shù)量的變化

紅茶菌發(fā)酵黑莓汁過程中主要的微生物為醋酸菌、酵母菌和乳酸菌。黑莓汁中醋酸菌、酵母菌和乳酸菌的初始數(shù)量分別為3.12，2.78和2.39(以lg(CFU/mL)計)。加入紅茶菌后，黑莓汁發(fā)酵過程中微生物數(shù)量的變化如圖1所示。由圖1可知：當發(fā)酵溫度為28 ℃時，醋酸菌和乳酸菌數(shù)量在發(fā)酵前6天呈上升趨勢，此后趨于穩(wěn)定，酵母菌數(shù)量在前4天呈上升趨勢；當發(fā)酵溫度為37 ℃時，醋酸菌和酵母菌數(shù)量在前2天呈上升趨勢，此后趨于穩(wěn)定，乳酸菌數(shù)量在發(fā)酵前6天呈上升趨勢。醋酸菌、酵母菌和乳酸菌能在黑莓汁中大量生長，但其在28和37 ℃時的數(shù)量不同，這可能是因為溫度對微生物的生長和發(fā)酵過程具有重要的影響[15]。此外，在接種相同含量的紅茶菌后，在28 ℃時發(fā)酵黑莓汁中醋酸菌的數(shù)量高于37 ℃時的數(shù)量。這可能是因為醋酸菌最適生長溫度為28～30 ℃，當條件溫度高于30 ℃時，醋酸菌的生長受到抑制[16]；而37 ℃時發(fā)酵黑莓汁中乳酸菌的數(shù)量高于28 ℃時的數(shù)量，這表明37 ℃更有利于紅茶菌中乳酸菌在黑莓汁中的生長。

圖1 紅茶菌發(fā)酵黑莓汁過程中微生物數(shù)量的變化Fig.1 Changes of microbial amount in Kombucha-fermented blackberry juice

2.2 黑莓汁發(fā)酵過程中pH的變化

未發(fā)酵的黑莓汁pH為3.22，紅茶菌在28和37 ℃時發(fā)酵黑莓汁的pH變化如圖2所示。由圖2可知：當發(fā)酵至第12天時，發(fā)酵黑莓汁在28和37 ℃時的pH分別下降至2.67和3.05，此后紅茶菌發(fā)酵黑莓汁的pH趨于穩(wěn)定。

2.3 黑莓汁發(fā)酵過程中色差的變化

顏色是評價果汁質(zhì)量的重要指標。本文中，筆者研究了不同發(fā)酵天數(shù)和發(fā)酵溫度下紅茶菌發(fā)酵黑莓汁色差的變化，結果如表2所示。由表2可知：未發(fā)酵黑莓汁的L*、a*和b*值分別為15.56、43.38和24.01；隨著發(fā)酵天數(shù)的增加，28和37 ℃時發(fā)酵黑莓汁的L*、a*和b*值增大；當發(fā)酵天數(shù)為20 d時，在28和37 ℃時發(fā)酵黑莓汁的L*、a*和b*值分別為18.90、46.32、27.77和17.92、44.44、27.63。這表明紅茶菌發(fā)酵會使黑莓汁顏色變得明亮，紅色和黃色增加。在28 ℃時黑莓汁的L*、a*和b*值均高于37 ℃時發(fā)酵黑莓汁的數(shù)值，這可能是因為受微生物菌系及其代謝產(chǎn)物影響，此外，溫度的升高也會導致L*、a*和b*值的降低[17]。

表2 紅茶菌發(fā)酵黑莓汁過程中色差的變化

28 ℃下發(fā)酵黑莓汁的pH始終低于37 ℃時發(fā)酵黑莓汁的pH，這主要與不同溫度下黑莓汁發(fā)酵過程中醋酸菌和乳酸菌的數(shù)量有關。在紅茶菌發(fā)酵黑莓汁過程中，由于溫度的不同，導致微生物在數(shù)量及產(chǎn)酸能力上出現(xiàn)差異，進而造成發(fā)酵黑莓汁pH的不同。

圖2 紅茶菌發(fā)酵黑莓汁過程中pH的變化Fig.2 Changes of pH in Kombucha-fermented blackberry juice

2.4 紅茶菌發(fā)酵黑莓汁過程中多糖含量的變化

在28和37 ℃時紅茶菌發(fā)酵黑莓汁中多糖含量變化如圖3所示。由圖3可知：發(fā)酵黑莓汁中的多糖含量隨時間延長呈現(xiàn)先增加后平穩(wěn)的趨勢，這表明黑莓汁中的營養(yǎng)物質(zhì)能夠滿足紅茶菌合成多糖的需求；此外，紅茶菌在28 ℃時所產(chǎn)多糖含量顯著高于在37 ℃時所產(chǎn)多糖含量，說明發(fā)酵溫度為28 ℃更有利于紅茶菌在黑莓汁中產(chǎn)多糖?？聵非鄣萚18]研究不同培養(yǎng)溫度對紅茶菌產(chǎn)胞外多糖的影響時發(fā)現(xiàn)，紅茶菌發(fā)酵液中胞外多糖含量隨著溫度上升呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，且28 ℃時紅茶菌發(fā)酵液中胞外多糖含量高于37 ℃時紅茶菌發(fā)酵液的胞外多糖含量。

圖3 紅茶菌發(fā)酵黑莓汁過程中多糖含量的變化Fig.3 Changes of polysaccharide content in Kombucha-fermented blackberry juice

表3 紅茶菌發(fā)酵黑莓汁過程中糖分的變化

2.5 紅茶菌發(fā)酵黑莓汁過程中蔗糖、葡萄糖和果糖的變化

在紅茶菌發(fā)酵紅茶水過程中，蔗糖是唯一的碳源和能源，發(fā)酵過程可以使得蔗糖酶解成葡萄糖和果糖[19]。表3為紅茶菌發(fā)酵黑莓汁過程中糖分的變化。由表3可知：蔗糖、葡萄糖和果糖可以作為碳源和能源來維持紅茶菌的生長。未發(fā)酵的黑莓汁中，蔗糖、葡萄糖和果糖的質(zhì)量濃度分別0.21、23.90和32.30 mg/mL；當發(fā)酵溫度為37 ℃時，發(fā)酵黑莓汁中的葡萄糖含量隨發(fā)酵時間的延長逐漸降低，而蔗糖和果糖含量無顯著性差異(p>0.05)，這與Xia等[11]研究結果一致：紅茶菌在37 ℃時發(fā)酵豆乳過程中首先利用半乳糖和葡萄糖，其次利用蔗糖和果糖。

當發(fā)酵溫度為28 ℃時，發(fā)酵黑莓汁中的蔗糖、葡萄糖和果糖含量逐漸降低，其中蔗糖和果糖分別在發(fā)酵的第8天和第12天耗盡。紅茶菌中的酵母菌和醋酸菌處于共生狀態(tài)，醋酸菌由于缺乏相關的蔗糖水解酶和激酶無法利用蔗糖[19]，而酵母菌由于含有蔗糖水解相關的酶，可以將蔗糖水解成葡萄糖和果糖，因此醋酸菌可以利用這些糖維持生長[20]。在紅茶菌發(fā)酵黑莓汁過程中，蔗糖主要被酵母菌分解成葡萄糖和果糖，后者可以作為碳源和能源維持細菌生長所需。

2.6 黑莓汁發(fā)酵過程中有機酸的變化

紅茶菌在發(fā)酵過程中可將碳水化合物轉(zhuǎn)化為有機酸，如乙酸、乳酸、葡萄糖酸和葡萄糖醛酸等[11]。在發(fā)酵初期，紅茶菌中的酵母可以將蔗糖水解成葡萄糖和果糖，并產(chǎn)生有機酸、乙醇和CO2[21]。醋酸菌則可以將乙醇轉(zhuǎn)化成乙酸，此外還可以將單糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖酸、乙酸和乳酸等有機酸[22]。

紅茶菌發(fā)酵黑莓汁過程中有機酸含量的變化如表4所示。由表4可知：當發(fā)酵溫度為28 ℃時，乙酸是發(fā)酵黑莓汁中主要的有機酸，是導致pH降低的主要物質(zhì)，且發(fā)酵黑莓汁中乙酸和乳酸含量隨發(fā)酵時間的延長而增加，分別在發(fā)酵的第12天和第20天，其質(zhì)量濃度達到最大值，分別為19 660.55和533.44 mg/L；草酸隨發(fā)酵時間的延長呈現(xiàn)先減少后增加的趨勢，并在第16天，其質(zhì)量濃度達到最小值，為4.86 mg/L。當發(fā)酵溫度為37 ℃時，發(fā)酵黑莓汁中的L-蘋果酸含量隨發(fā)酵時間的延長呈現(xiàn)先減少后增加的趨勢，而乳酸和乙酸含量則呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，其中乳酸和乙酸質(zhì)量濃度分別在第12天和第4天達到最大，分別為807.09和27.50 mg/L。因此，28和37 ℃分別是紅茶菌在黑莓汁中產(chǎn)乙酸和乳酸的最佳溫度，這與醋酸菌和乳酸菌的最適生長溫度一致(圖1)。此外，37 ℃時發(fā)酵黑莓汁中的乳酸含量顯著高于28 ℃發(fā)酵黑莓汁中的乳酸含量，但其乙酸含量顯著低于發(fā)酵溫度為28 ℃的黑莓汁中的乙酸含量，這是因為醋酸菌的最適生長溫度一般為30 ℃，當溫度上升至37 ℃時，醋酸菌產(chǎn)酸能力受到抑制，但是該條件下卻有利于乳酸菌生長[16]。

表4 紅茶菌發(fā)酵黑莓汁過程中有機酸含量的變化

2.7 黑莓汁發(fā)酵過程中花色苷的變化

花色苷是由花色苷元和糖分子通過糖苷鍵相連構成的，是一類顏色獨特的酚類物質(zhì)，含有該物質(zhì)的食品在加工中具有強烈色彩(主要是對紅色、藍色和紫色有貢獻)[23]。花色苷易受溫度、pH和有機酸等因素的影響[24]，因此在黑莓加工和儲藏過程中，與其相關的色變成影響產(chǎn)品質(zhì)量的重要因素。

紅茶菌發(fā)酵黑莓汁過程中花色苷含量的變化如圖4所示。由圖4可知：未發(fā)酵黑莓汁中花色苷質(zhì)量濃度為6.24 mg/L，隨著時間的延長，未發(fā)酵和發(fā)酵的黑莓汁中花色苷的含量顯著降低，且37 ℃時黑莓汁中花色苷的含量顯著低于28 ℃時黑莓汁中花色苷的含量。有研究表明溫度會影響花色苷的穩(wěn)定性，隨著溫度的升高，花色苷降解速度加快，并且在儲藏過程中花色苷的降解遵循一級化學反應動力學[15]。在pH為2～4時，溫度升高可以誘導花色苷的糖苷鍵水解，形成查爾酮形式[24]。

當發(fā)酵溫度為28 ℃、發(fā)酵20 d時，紅茶菌發(fā)酵黑莓汁和未發(fā)酵黑莓汁中花色苷質(zhì)量濃度分別為4.53和1.86 mg/L；當發(fā)酵溫度為37 ℃、發(fā)酵20 d后，紅茶菌發(fā)酵黑莓汁和未發(fā)酵黑莓汁中花色苷質(zhì)量濃度分別為2.53和0.79 mg/L；相同發(fā)酵溫度和發(fā)酵天數(shù)下，紅茶菌發(fā)酵黑莓汁中花色苷含量顯著高于未發(fā)酵黑莓汁中花色苷含量。花色苷結構隨溶液的pH變化會發(fā)生改變，同時，溶液的顏色也隨結構的改變而改變[22]。徐金瑞等[25]發(fā)現(xiàn)：當溶液pH<3時，花色苷主要以烊鹽形式存在；當pH升高，花色苷烊鹽受到水分子親和攻擊并且花色苷上的酸性羥基會發(fā)生質(zhì)子轉(zhuǎn)移，因此低pH對防止花色苷降解具有重要作用。同時由圖2可知：未發(fā)酵的黑莓汁pH為3.20左右，高于發(fā)酵黑莓汁的pH，由此可見，低pH發(fā)酵能有效防止黑莓汁中花色苷降解。

有機酸可以與花色苷相互作用起到增色效應[26]。Tsukui等[27]研究發(fā)現(xiàn)醋酸含量的增加會引起花青素吸光度的增加。Kwaw等[28]也發(fā)現(xiàn)乳酸發(fā)酵能夠提高桑葚汁中花青素的含量。與未發(fā)酵的黑莓汁相比，發(fā)酵黑莓汁乙酸和乳酸含量增加(表4)，由此可知，在紅茶菌發(fā)酵黑莓汁過程中，有機酸含量的增加能夠在一定程度上防止花色苷的降解。

圖4 紅茶菌發(fā)酵黑莓汁過程中花色苷含量的變化Fig.4 Changes of anthocyanin content in Kombucha-fermented blackberry juice

3 結論

本文研究了紅茶菌發(fā)酵黑莓汁過程中理化指標的變化。與未發(fā)酵黑莓汁相比，紅茶菌發(fā)酵能夠使黑莓汁pH、蔗糖、葡萄糖、果糖、草酸、L-蘋果酸及花色苷含量降低，而使L*、a*和b*值及多糖、乳酸和乙酸含量增加。在28 ℃時發(fā)酵黑莓汁中醋酸菌是優(yōu)勢菌，而37 ℃時乳酸菌為優(yōu)勢菌。相同發(fā)酵時間下，在28 ℃時發(fā)酵黑莓汁的pH及蔗糖、果糖和乳酸含量低于37 ℃時的發(fā)酵黑莓汁，但L*、a*和b*值及多糖、乙酸和花色苷含量高于37 ℃時發(fā)酵的黑莓汁。

本研究選用容易腐爛、鮮食貨架期較短的黑莓為原料，通過紅茶菌發(fā)酵的方式賦予黑莓汁獨特的風味，提高了其功能價值，為該產(chǎn)品后續(xù)深入開發(fā)提供一定的理論基礎，并能在一定程度上促進黑莓加工產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。