謝明杰， 趙龍昊

(遼寧師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 大連 116081)

隨著經(jīng)濟發(fā)展和人們生活水平的提高，2型糖尿病(T2DM)的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，已成為威脅全球人類健康的慢性非傳染性疾病[1].已有的研究表明，T2DM的發(fā)病機制十分復(fù)雜，與基因調(diào)控、腸道菌群和代謝水平等多因素影響有關(guān)[2].葛根為我國傳統(tǒng)的中藥材，將其用于治療糖尿病在我國有著悠久的歷史[3].本文以葛根的主要功效成分葛根素為實驗材料，采用多組學(xué)策略，通過測定并分析葛根素對T2DM小鼠腸道菌群、代謝物和腸道基因表達(dá)水平的影響，探討其調(diào)節(jié)T2DM小鼠糖代謝的作用機制.旨在為將葛根素開發(fā)為治療糖尿病的臨床藥物或保健藥物提供理論依據(jù).

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

6周齡SPF級雄性昆明小鼠，體質(zhì)量(20±2) g，購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司.

1.1.2 實驗藥品

葛根素：純度>98%，購自成都曼斯特生物科技有限公司；鏈脲佐菌素(streptozocin, STZ)購自上海生工生物工程有限公司；小鼠胰島素(insulin, INS)酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，購自南京建成生物工程研究所.

1.1.3 實驗儀器

Illumina MiSeq DNA測序儀，美國Illumina公司；酶標(biāo)儀，美國Thermo公司；PCR擴增儀，美國ABI公司；血糖儀，江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司.

1.2 方法

1.2.1 T2DM小鼠模型的建立及分組

將小鼠隨機分為正常組(NM)和造模組，分別喂飼基礎(chǔ)飼料和高糖高脂飼料.5周后禁食但不禁水12 h，造模組連續(xù)5 d腹腔注射1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))STZ溶液40 mg/kg，NM組注射等體積檸檬酸緩沖液.最后一次注射72 h后，尾靜脈采血所測得的血糖值>11.1 mol/L視為造模成功.將造模成功的小鼠再分為模型組(DM)和葛根組(Pue)，每組各6只.其中，Pue組小鼠按50 mg/kg/d灌胃葛根素藥液0.2 mL，連續(xù)5周，NM組及DM組小鼠灌胃等體積蒸餾水.

1.2.2 小鼠血液相關(guān)指標(biāo)的檢測

待灌胃5周后取小鼠眼底靜脈血，按照試劑盒說明收集血清，分別檢測小鼠空腹血糖(fasting blood glucose, FBG)、空腹胰島素(fasting insulin, FINS)水平，并按下列公式計算胰島素抵抗指數(shù)(homeostasis model assessment of insulin resistance, HOMA-IR)和胰島素敏感指數(shù)(insulin sensitivity index, ISI)：

HOMA-IR=(FINS×FBG)/22.5，

ISI=ln[1/(FINS×FBG)].

1.2.3 小鼠胰腺組織切片的制備與觀察

將小鼠胰腺組織先放于Bouin液中固定，然后通過脫水、透明、浸蠟、包埋、脫蠟、染色、封片等步驟制作石蠟切片，于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察.

1.2.4 小鼠糞便和腸道組織的收集與保存

收集各組小鼠的新鮮糞便和小腸組織，將其在液氮速凍后于-80 ℃保存.采用Illumina MiSeq平臺和LC-MS技術(shù)對樣品進(jìn)行腸道菌群測序、轉(zhuǎn)錄組測序和非靶向代謝物測定.樣品的檢測委托上海派森諾生物科技有限公司完成.

1.2.5 生物信息學(xué)分析

腸道菌群測序采用QIIME2軟件、R腳本進(jìn)行分析；轉(zhuǎn)錄組測序采用HTSeq、Sringtie等軟件進(jìn)行分析；代謝物測定采用Proteowizard、R腳本等軟件進(jìn)行分析.使用R軟件計算各組學(xué)數(shù)據(jù)之間的等級相關(guān)系數(shù).

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析.組內(nèi)比較采用單因素方差分析，組間采用t檢驗.P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著.

2 結(jié)果與分析

2.1 葛根素對小鼠血糖水平的影響

實驗結(jié)果顯示(表1)，葛根素能顯著降低T2DM小鼠的血糖水平.其中，與DM組相比，Pue組小鼠的FBG和FINS分別下降了41.35%和29.66% (P<0.01).

表1 葛根素對小鼠血糖水平的影響

2.2 葛根素對小鼠胰腺組織的影響

小鼠胰腺組織切片結(jié)果顯示(圖1)，NM組小鼠的胰島結(jié)構(gòu)完整且規(guī)則，而DM組小鼠的胰島結(jié)構(gòu)被破壞，形狀不規(guī)則，與周圍組織混合難以識別.但用葛根素灌胃5周后，T2DM小鼠損傷的胰腺組織得到了很好的修復(fù).

圖1 小鼠胰腺組織切片(×400)Fig.1 Sections of mice pancreas tissues (×400)

2.3 葛根素對小鼠腸道菌群的影響

Illumina檢測結(jié)果顯示，葛根素能顯著改變小鼠腸道菌群的物種組成.與DM組相比，Pue組小鼠腸道菌群的物種組成在門、目、屬水平上均發(fā)生了顯著的變化.但當(dāng)利用葛根素灌胃T2DM小鼠5周后，可使DM組小鼠腸道菌群的物種組成基本恢復(fù)至正常水平(圖2a).圖2b為選取豐度變化位列前50的菌屬所做的熱圖.紅色表示豐度高，藍(lán)色表示豐度低，顏色的深淺表示變化的強弱.由圖可知，與NM組相比，DM組小鼠中的脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)、螺桿菌屬(Helicobacter)、Dorea、Mucispirillum、Prevotella、厭氧棍狀菌屬(Anaerotruncus)、帕拉普氏菌屬(Paraprevotella)等的豐度明顯升高.當(dāng)用葛根素灌胃T2DM小鼠5周后，Pue組小鼠腸道菌群的物種組成基本恢復(fù)至正常水平.其中，脫硫弧菌屬、螺桿菌屬、Dorea的豐度明顯降低，而乳球菌屬(Lactococcus)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、Alistipes、丁酸弧菌屬(Butyricimonas)等益生菌的豐度明顯升高.

2.4 葛根素對小鼠代謝物的影響

按照P≤0.05且VIP≥1的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，與DM組相比，Pue組共篩選出505 個差異顯著代謝物，包括193個上調(diào)代謝物，312個下調(diào)代謝物.按照分子量與數(shù)據(jù)庫中的代謝物進(jìn)行匹配，共鑒定出5-羥基-L-色氨酸等19種差異顯著代謝物.其中，與DM組相比，Pue組中的5-羥基-L-色氨酸和褪黑素等代謝物的含量顯著升高，苯乙酰谷氨酰胺等代謝物的含量顯著降低.

2.5 葛根素對小鼠腸道基因表達(dá)水平的影響

按照表達(dá)差異倍數(shù)|lb FoldChange|>1和P<0.05的條件進(jìn)行篩選，與DM組相比，Pue組共篩選出308個差異顯著基因,包括204個上調(diào)基因，104個下調(diào)基因.其中，與DM組相比，Pue組中的Slc2a2、Haao、Foxa2、Slco4c1、Mbl2等基因的表達(dá)水平顯著增加，Srebf1等表達(dá)水平顯著降低.

3 討 論

已有的研究結(jié)果表明，腸道菌群結(jié)構(gòu)功能的紊亂與T2DM等多種疾病密切相關(guān)[4].如糖尿病患者常伴有腸道菌群比例的失衡，表現(xiàn)為擬桿菌門和厚壁菌門的豐度比值明顯降低，梭菌與厚壁菌的比值明顯升高等[5-6].本研究結(jié)果顯示，葛根素可通過改變擬桿菌門與厚壁菌門的比例，降低脫硫弧菌屬、螺桿菌屬等有害菌群的豐度，提高雙歧桿菌屬、乳球菌屬、乳桿菌屬等益生菌群的豐度，使T2DM小鼠腸道菌群的物種組成基本恢復(fù)至正常水平.

代謝物的變化可從一定程度上反映內(nèi)外源物質(zhì)在生物體內(nèi)的作用機制[7-9].5-羥基-L-色氨酸為血清素的前體物質(zhì)，血清素能促進(jìn)棕色脂肪組織攝取葡萄糖并將其轉(zhuǎn)化為熱能.有研究報道，5-羥基-L-色氨酸和褪黑素具有促進(jìn)胰島素分泌、糖原合成和糖酵解等作用，能顯著改善高脂小鼠的葡萄糖耐受性，增強胰島素敏感性，對T2DM的發(fā)生和發(fā)展具有很好的調(diào)節(jié)作用[10-11].苯乙酰谷氨酰胺是腸道菌群分解苯丙氨酸時產(chǎn)生的副產(chǎn)物，有研究結(jié)果顯示，在患有T2DM的受試者血漿中檢測出較高濃度的苯乙酰谷氨酰胺，其過高的含量可作為發(fā)生心肌梗死等風(fēng)險的獨立預(yù)測因子[12].本研究結(jié)果表明，葛根素可通過影響5-羥基-L-色氨酸、褪黑素和苯乙酰谷氨酰胺等代謝物的含量改善小鼠的T2DM.

給藥前后小鼠基因組mRNA表達(dá)水平的變化，可為探討葛根素治療T2DM的機制以及尋找藥物作用的靶點提供有力的支持[13].Slc2a2是青少年成熟型糖尿病代謝通路中的調(diào)控基因，主要參與編碼葡萄糖轉(zhuǎn)運體蛋白2.該蛋白缺失會使葡萄糖攝取受損、胰島素分泌不足，最終導(dǎo)致高血糖的發(fā)生[14].Haao是調(diào)控NAD合成的關(guān)鍵基因，而NAD是三羧酸循環(huán)的重要輔酶，在促進(jìn)機體的糖脂代謝中發(fā)揮重要作用[15].有研究報道:在胰島素抵抗和肥胖小鼠中，增加由Foxa2編碼的Foxa2活性，可使其對胰島素的敏感性增強，降低血漿胰島素和甘油三酯的含量[16-17]；由Slco4c1編碼的Slco4c1蛋白可減輕糖尿病大鼠腎小球足細(xì)胞線粒體功能障礙，對糖尿病腎病的改善起著關(guān)鍵作用[18]；由Mbl2編碼的甘露糖結(jié)合蛋白(mannose-binding lectin, MBL)可控制高脂血癥患者的血糖和血脂水平，有利于緩解機體的炎癥反應(yīng)[19-20].Srebf1為胰島素抵抗通路中的調(diào)控基因，其轉(zhuǎn)錄活性的降低可抑制小鼠脂肪細(xì)胞的脂質(zhì)異常堆積，增強小鼠對胰島素的敏感性[21].本研究結(jié)果表明，葛根素可通過影響Slc2a2、Haao和Cyp1a1等基因表達(dá)量改善小鼠的T2DM.

為了弄清基因-代謝物-腸道菌群對改善的T2DM的作用，對葛根素作用T2DM模型小鼠后的差異顯著的基因、代謝物和腸道菌群進(jìn)行了整合分析.結(jié)果顯示，代謝物5-羥基-L-色氨酸和褪黑素含量的增加與unclassified_Rikenellaceae的豐度和Haao的表達(dá)量變化呈顯著正相關(guān).Slc2a2、Haao和Cyp1a1的表達(dá)量與Parabacteroides的豐度變化呈顯著正相關(guān)，與Anaerotruncus的豐度變化呈顯著負(fù)相關(guān).上述結(jié)果表明，基因、腸道菌群和代謝物之間密切關(guān)聯(lián)，葛根素可通過影響Slc2a2、Haao和Cyp1a1等基因表達(dá)量，改變unclassified_Rikenellaceae、Anaerotruncus和Parabacteroides等腸道菌群的豐度，調(diào)節(jié)5-羥基-L-色氨酸和褪黑素等代謝物的含量來改善小鼠T2DM.