鄭煜凱 黃燦霞 李偉超 李方義 鄒子俊 何志捷

膿毒癥導致危及生命的器官功能障礙，這是由宿主對感染的失衡反應引起的。每年有超過1900 萬膿毒癥患者和500 萬膿毒癥相關的患者死亡［1］。中性粒細胞參與膿毒癥過程，不僅是IL?1β和IL?18 的主要來源［2］，還是宿主對膿毒癥的免疫反應的調節(jié)。既往研究表明中性粒細胞在膿毒癥中具有關鍵作用。例如，誘導中性粒細胞自噬可能會增加中性粒細胞胞外陷阱（NETs）的產生，減少膿毒癥小鼠的死亡［3］。

在膿毒癥中，高水平的miR?133a 與疾病的嚴重程度有關，而且能預測危重患者的不良結果［4］。但涉及膿毒癥中性粒細胞的核心基因和miRNA 相關研究較少。生物信息學結合計算機科學和生物科學，采用通路分析、視覺化進行數(shù)據(jù)挖掘，篩選核心基因和通路。本研究旨在對膿毒癥中性粒細胞的基因數(shù)據(jù)進行生物信息學分析，鑒定膿毒癥中性粒細胞可能的關鍵基因、轉錄因子和miRNA。

1 臨床資料

1.1 一般資料基因表達綜合（GEO）數(shù)據(jù)庫是PubMed 上可公開訪問的基因組學數(shù)據(jù)庫，包含高通量基因表達數(shù)據(jù)、微陣列數(shù)據(jù)等。以“膿毒癥”或“膿毒癥休克”和“中性粒細胞”為檢索詞，提供的檢索策略如下：（“neutrophils”［MeSH Terms］OR neutrophil［All Fields］）AND（（（“sepsis”［MeSH Terms］ OR sepsis［All Fields］） OR（“shock，septic”［MeSH Terms］OR septic shock［All Fields］））OR（（“sepsis”［MeSH Terms］OR sepsis［All Fields］）AND（“shock”［MeSH Terms］OR shock［All Fields］）））。納入標準是：（1）基因表達數(shù)據(jù)集；（2）由正常對照組和膿毒癥或膿毒癥休克組病例原始數(shù)據(jù)組成的數(shù)據(jù)集。排除標準是：（1）非編碼RNA 和DNA 甲基化序列數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)集；（2）非中性粒細胞的非膿毒癥數(shù)據(jù)集的樣本數(shù)據(jù)。共選取3 個數(shù)據(jù)集（GSE64457、GSE123729和GSE100150）進行數(shù)據(jù)分析，2 個數(shù)據(jù)集（GSE100159 和GSE101639）作為驗證。本實驗已經過中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會倫理審查同意（SYSEC?KY?KS?2021?345）。

1.2 鑒定差異表達基因（DEG）R 軟件中的Affy包用于讀取基因表達芯片?CEL 格式數(shù)據(jù)，處理成表達矩陣。使用Limma 包來分析和計算膿毒癥組和正常組的矩陣數(shù)據(jù)，獲得差異表達基因，以火山圖形式顯示，結果取交集，以韋恩圖顯示。P＜0.05和|Log2FC|＞1 的作為閾值。

1.3 基因本體（GO）和KEGG 通路富集分析基因本體（GO）、KEGG（京都基因與基因組百科全書分析）分析用于了解生物系統(tǒng)的功能和通路富集情況。向DAVID 網站上傳DEG，進行GO 和KEGG分析。P＜0.05 表示差異具為有統(tǒng)計學意義。

1.4 蛋白質-蛋白質互作（PPI）網絡構建和核心基因鑒定STRING 數(shù)據(jù)庫為差異表達基因建立PPI 網絡，使用Cytoscape 將數(shù)據(jù)可視化，其中Cyto?Hubba、MCODE 功能，能分析PPI 網絡中基因間的度中心性、介數(shù)中心性和接近中心性的值，篩選核心基因。

1.5 轉錄因子（TF）-差異表達基因（DEG）配對預測及調控網絡構建Cytoscape 的iRegulon 功能可以對PPI 網絡分析，以歸一化富集分數(shù)（NES）＞3 為標準，構建TF?DEG 可視化網絡。使用miR?Walk2.0、TargetScan、Miranda、miRDB 和RNA22 數(shù)據(jù)庫以預測miRNA，在Cytoscape 中可視化。

1.6 受試者工作特性曲線（ROC）分析采用R軟件中的“PROC”包進行ROC 分析。計算ROC 曲線下面積（AUC），通過AUC 值評價DEG、TF 和miRNA 在膿毒癥或膿毒性休克診斷中的準確性。AUC 值＞0.8 時，表明具有較好的診斷價值。

2 結 果

2.1 DEG 的鑒定DEG 以火山圖的形式顯示（圖1.A?C）。如圖1.D 所示，共116 個DEG，其中18 個下調DEG 和98 個上調DEG。

圖1 DEG 鑒定

2.2 GO 和KEGG 分析對上調和下調的DEG 分別進行GO 和KEGG 分析。上調DEG 富集于先天免疫反應（P=1.45E?04）、細胞外泌體（P=1.06E?05）等。下調DEG 富集于淋巴細胞穩(wěn)態(tài)（P=1.80E?02）、全膜（P=2.23E?02）和MAPK信號通路（P=8E?03）。

2.3 PPI 網絡和核心基因PPI 網絡共涉及116個節(jié)點和244 個互作關系（圖2.A?B）。核心基因顯示在圖2.C?E，10 個核心基因是：AKT 1、MMP9、ARG1、MMP8、C3AR1、LCN2、QSOX1、TLR5、MAPK14 和FCAR（表1）。

圖2 PPI 網絡

表1 核心基因

2.4 TF-DEG 配對和調控網絡ETS1 作為關鍵轉錄因子靶向39 個DEG（如AKT1）（圖3）。參與TF?DEG 調控網絡的基因進行了通路分析，包括：MAPK 信號通路（P=1.13E?05）、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路（P=1.02E?04）。鑒定出has?miR?124?3p 為關鍵的miRNA，其靶基因共9 個（7 個上調DEG 和2 個下調DEG，如RPS6KA5）差異表達。圖4 顯示了miRNA?DEG 網絡。

圖3 TF-DEG 調控網絡

圖4 miRNA-DEG 網絡

2.5 ROC 分析ROC 分析結果顯示，MMP9（AUC=0.955）、ETS1（AUC=0.950）、RPS6KA5（AUC=0.945）可以較好診斷膿毒癥和對照樣本，AKT1（AUC=0.602）診斷能力一般（圖5.A）。has?miR?124?3p 區(qū)分膿毒性休克和對照組（AUC=0.889）或是膿毒癥和對照組均具有顯著的診斷價值（AUC=0.833）（圖5.B?C），但是無法區(qū)分膿毒癥和膿毒癥休克組（AUC=0.556，圖5.D）。

圖5 ROC 分析

3 討 論

本研究共鑒定116 個DEG，包括98 個上調和18 個下調DEG，其中AKT1 和MMP9 為核心基因，而ETS1 和has?miR?124?3p 是調控網絡的關鍵因子。

AKT1 是細胞存活、代謝的調節(jié)因子。Ursula 等人［5］證明AKT1 過表達能防止膿毒癥誘導的細胞凋亡。Yong H 等人［6］研究亦表明lncRNA MALAT1通過刺激AKT1 磷酸化加重膿毒癥炎癥反應。據(jù)報道，MMP9 可能具有抑制中性粒細胞過度遷移或抗炎的作用［7］。Reckens 發(fā)現(xiàn)MMP9（?/?）小鼠的感染將產生更嚴重的損傷［8］。我們的研究表明，AKT1、MMP9 在膿毒癥中性粒細胞的MAPK 和TNF 信號通路中富集，表明AKT1、MMP9 可能是膿毒癥中性粒細胞的炎癥反應的關鍵基因。

HeH 等人研究發(fā)現(xiàn)炎癥因子可通過TNFα→ETS1→IL?27ra 通路促進肝星狀細胞衰老［9］。Shi?uYT 的研究［10］認為ETS1 參與調節(jié)細胞因子和粘附分子的表達，也是膿毒癥中性粒細胞參與的重要病理生理過程。HuaP 的研究發(fā)現(xiàn)Ang II 誘導的ETS1磷酸化涉及ERK?MAPK 通路和PI3K/Akt 通路［11］。我們的研究表明膿毒癥中性粒細胞中ETS1 調控的基因（如AKT1）在MAPK 和TNF 信號通路中顯著富集。表明靶向AKT1 的ETS1 可能通過MAPK 和TNF通路在膿毒癥中性粒細胞調控作用。

我們的研究認為has?miR?124?3p 是膿毒癥中性粒細胞的關鍵miRNA，結合既往研究提示可能是通過RPS6KA5 參與膿毒癥中性粒細胞的細胞凋亡過程。

綜上所述，AKT1、MMP9 是膿毒癥中性粒細胞的核心基因。AKT1、MMP9、靶向AKT1 的轉錄因子ETS1 和靶向RPS6KA5 的has?miR?124?3p 可能參與膿毒癥中性粒細胞的重要過程，并具有較好的診斷價值。本研究結果是基于生物信息學分析的推測和假設，對于膿毒癥的診斷和潛在干預指導具有顯著的價值，而核心基因等在膿毒癥中性粒細胞中的作用仍需要進一步的實驗研究來證實。

致謝

感謝GEO 數(shù)據(jù)庫的公共數(shù)據(jù)庫以及在該平臺分享數(shù)據(jù)的研究者，我們的研究是基于免費開放獲取的數(shù)據(jù)進行的，本研究沒有對人類或動物的任何實驗行為。