段俊林，陳日壽，陳偉，葉林強(qiáng)，馮永洪，黃祖輝，劉亮洪

(東莞市中醫(yī)院，1.檢驗(yàn)科；2.骨科，廣東 東莞 523000)

金黃色葡萄球菌屬于革蘭氏陽(yáng)性致病菌，具有侵襲性，廣泛地存在于自然界，能夠引起包括人類和牲畜在內(nèi)的多種脊椎動(dòng)物體內(nèi)不同部位的感染[1]。近幾十年來(lái)，隨著細(xì)菌的進(jìn)化與抗生素的濫用，金黃色葡萄球菌耐藥性逐漸增強(qiáng)，特別是重癥監(jiān)護(hù)室(ICU)、神經(jīng)外科及骨科病房[2-3]。因此，及時(shí)了解金黃色葡萄球菌耐藥情況有利于促進(jìn)臨床合理用藥。金黃色葡萄球菌可產(chǎn)生多種毒力因子，參與病原體侵入與抵抗宿主的防御機(jī)制的整個(gè)過(guò)程，進(jìn)而引發(fā)疾病或器官損傷[4]。多種毒力基因共同決定了病原菌的毒力，與金黃色葡萄球菌致病性密切相關(guān)的毒力基因主要包括有黏附素基因、溶血毒素基因、殺白細(xì)胞素基因、侵襲毒素基因，其分別從黏附、細(xì)胞裂解、破壞線粒體的內(nèi)環(huán)境、降解宿主細(xì)胞中大分子等方面發(fā)揮致病作用[5-6]。本研究擬檢測(cè)骨科創(chuàng)傷后感染患者體內(nèi)金黃色葡萄球菌耐藥基因及毒力基因，旨在為臨床合理用藥提供理論依據(jù)，并探究不同感染嚴(yán)重程度、不同預(yù)后轉(zhuǎn)歸情況患者金黃色葡萄球菌毒力基因的分布情況。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年5月至2021年4月東莞市中醫(yī)院診治的骨科創(chuàng)傷后感染患者送檢標(biāo)本中分離的40株金黃色葡萄球菌。40例患者包括男性25例，女性15例；年齡18～75歲，平均(44.27±9.10)歲；住院時(shí)間7～21 d，平均(14.15±5.20)d；手術(shù)類型包括自四肢手術(shù)20例，關(guān)節(jié)手術(shù)7例，腰椎及骨盆手術(shù)6例，頸椎手術(shù)4例，胸部手術(shù)3例。根據(jù)感染程度將患者分為淺表感染組(n=18)和深部感染組(n=22)，淺表感染指僅累計(jì)皮膚及皮下組織的感染，并具備下述情況之一：(1)傷口淺層有分泌物；(2)傷口淺層分泌物培養(yǎng)出細(xì)菌；(3)疼痛或壓痛、腫脹、紅熱，醫(yī)生因此將切口開放的。深部感染指累及傷口深部筋膜及肌層的感染，并至少具備下述情況之一：(1)從傷口深部流出膿液；(2)傷口深部自行裂開或由醫(yī)生打開，且體溫>38 ℃、局部疼痛或壓痛；(3)經(jīng)臨床、手術(shù)、病理組織學(xué)或影像學(xué)診斷發(fā)現(xiàn)切口深部有膿腫。根據(jù)患者術(shù)后創(chuàng)面愈合情況將患者預(yù)后分為有效組(n=31)和無(wú)效組(n=9)，評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)如下[7]：優(yōu)，14 d內(nèi)創(chuàng)面完全愈合，且表皮基本覆蓋，無(wú)需更換敷料；良，14 d內(nèi)創(chuàng)面分泌物較少，可見健康肉芽組織生長(zhǎng)，仍更換敷料；差，14 d內(nèi)創(chuàng)面仍存在較多分泌物、且不可見新生肉芽組織生長(zhǎng)。以優(yōu)、良為有效組，差為無(wú)效組。標(biāo)本搜集嚴(yán)格按照醫(yī)院倫理委員會(huì)要求進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1 目的DNA提取 無(wú)菌條件下，將金黃色葡萄球菌接種于血瓊脂平板上(青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司)，于37 ℃條件下恒溫培養(yǎng)24 h，將菌落挑取轉(zhuǎn)移至裂解液中制備菌懸液；充分振蕩混勻后置于干式恒溫器(杭州瑞誠(chéng)儀器有限公司)上以100 ℃條件下加熱10 min，隨后冰浴5 min，采用離心機(jī)以12 000 rpm的轉(zhuǎn)速離心10 min，上清液即擴(kuò)增模板。

1.2.2 聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)法測(cè)定耐藥基因及毒力基因 T100梯度PCR儀產(chǎn)自美國(guó)伯樂公司，25 μL反應(yīng)體系：DNA模板1.5 μL，Premix Tap 緩沖液12.5 μL、上游及下游引物各1 μL，其余加入蒸餾水補(bǔ)足。反應(yīng)條件如下：95 ℃ 5 min(預(yù)變性)，95 ℃ 1 min(變性)，退火 1 min(退火溫度)，72 ℃ 1 min(延伸)，循環(huán)30次后， 72 ℃ 10 min(延伸)。以人工合成的目標(biāo)基因片段為陽(yáng)性對(duì)照，以蒸餾水為陰性對(duì)照。取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析。PCR試劑購(gòu)自天根生化科技有限公司。引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。見表1。

表1 靶基因引物序列目的產(chǎn)物長(zhǎng)度

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料以[n(%)]表示，組間比較采用χ2分析或Fisher精確檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨科創(chuàng)傷患者金黃色葡萄球菌耐藥基因分布情況

40株金黃色葡萄球菌中共檢出mecA基因耐藥株數(shù)23株(耐藥率57.50%)，即耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin resistant Staphylococcus aureus，MRSA)為23株，對(duì)甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌(Methicillin sensitive Staphylococcus aureus，MSSA)為17株。

2.2 不同嚴(yán)重程度骨科創(chuàng)傷后感染患者金黃色葡萄球菌毒力基因分布情況比較

深部感染組患者sdrC基因檢出率高于淺表感染組(72.73%vs.33.33%)、ssp基因檢出率高于淺表感染組(100.00%vs.66.67%)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；淺表感染組與深部感染組患者其余基因檢出率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 不同嚴(yán)重程度骨科創(chuàng)傷后感染患者金黃色葡萄球菌毒力基因分布情況比較[ n(%)]

2.3 不同預(yù)后骨科創(chuàng)傷后感染患者金黃色葡萄球菌毒力基因分布情況比較

無(wú)效組患者sdrD基因檢出率低于有效組(11.11%vs.61.29%)、pvl基因檢出率高于有效組(33.33%vs.3.33%)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；有效組與無(wú)效組患者其余基因檢出率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 不同預(yù)后骨科創(chuàng)傷后感染患者金黃色葡萄球菌毒力基因分布情況比較

3 討論

金黃色葡萄球菌作為一種共生菌，通常無(wú)癥狀地存在于人體的某些部位，如皮膚、皮膚腺體、粘膜、鼻子及內(nèi)臟等[2，8]。在引入青霉素后兩年內(nèi)即出現(xiàn)了金黃色葡萄球菌的耐藥性，相較于MSSA感染患者，MRSA感染不但增加了住院時(shí)間及住院費(fèi)用，還增加了死亡風(fēng)險(xiǎn)[9]。本研究中，共檢出mecA基因耐藥株數(shù)23株(耐藥率57.50%)，原因可能與骨科患者損傷程度較重、開放性傷口較為常見、傷口深、急診入院患者多、廣譜抗生素應(yīng)用及侵入性操作等因素有關(guān)。該結(jié)果提示應(yīng)加強(qiáng)抗生素藥物的管理，在進(jìn)行經(jīng)驗(yàn)性抗金黃色葡萄球菌治療前進(jìn)行耐藥分析、合理選擇抗菌策略。

本研究發(fā)現(xiàn)，深部感染組患者sdrC基因及ssp基因檢出率均高于淺表感染組(P<0.05)，可能與sdrC編碼蛋白的黏附及促進(jìn)生物膜形成相關(guān)。而ssp基因基因檢出率較高的作用機(jī)制可能是由于ssp基因?qū)儆谇忠u毒素基因，其編碼的侵襲性酶為金黃色葡萄球菌釋放的胞外酶，該類酶可降解宿主細(xì)胞或細(xì)胞與細(xì)胞之間的多種大分子，從而使得炎癥進(jìn)一步發(fā)展[10]；此外，ssp 編碼的絲氨酸蛋白酶，可能斷裂大分子中的肽鍵，使之成為小分子蛋白質(zhì)[11]，此過(guò)程可能與促進(jìn)感染程度增加相關(guān)。目前，針對(duì)黃金葡萄糖球菌感染患者毒力基因與預(yù)后的相關(guān)研究尚未見報(bào)道。在本研究中，無(wú)效組患者sdrD基因檢出率低于有效組(P<0.05)、pvl基因檢出率高于有效組(P<0.05)，其作用機(jī)制可能如下：sdrD基因與上述sdrC基因同屬于黏附毒素基因，pvl基因?qū)儆跉准?xì)胞素基因，由位于前噬菌體上的LukF-PV與LukS-PV基因共同編碼，可通過(guò)于細(xì)胞膜上形成孔道對(duì)白細(xì)胞進(jìn)行殺傷[12]；此外，另有學(xué)者[13]推斷，攜帶pvl的金黃色葡萄球菌致病力及耐藥性更強(qiáng)，可以引起嚴(yán)重的感染，增加治療難度且復(fù)發(fā)率高。雖然sdrD、pvl基因與感染控制情況相關(guān)的作用機(jī)制尚未完全明確，但推測(cè)其因素可能與參與金黃色葡萄球菌耐藥相關(guān)。孫琛等[14]以金黃色葡萄球菌感染患兒為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)MRSA 的sdrD攜帶率顯著低于MSSA(P<0.05)；夏雯等[15]對(duì)醫(yī)院獲得性肺炎患者痰液中金黃色葡萄球菌進(jìn)行分離與鑒定，發(fā)現(xiàn)MRSA的毒力基因pvl攜帶率較高。由于MRSA致病力強(qiáng)、治療難度大，從而導(dǎo)致患者感染控制情況不佳。

綜上，毒力基因sdrC、ssp與骨科創(chuàng)傷后金黃色葡萄球菌感染患者感染程度相關(guān)，毒力基因sdrD、pvl與骨科創(chuàng)傷后金黃色葡萄球菌感染患者預(yù)后轉(zhuǎn)歸(感染控制情況)相關(guān)。