閆薛，張巍，張婷，師錦寧

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬江寧醫(yī)院血液科，江蘇 南京 211100)

多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是血液系統(tǒng)中的一種惡性腫瘤，約占中國血液腫瘤的12%，是第二常見的血液腫瘤[1]，其病理特征為骨髓中漿細(xì)胞的異?？寺≡鲋常匝懈咚矫庖咔虻鞍自斐晒?、腎等多器官損害為主要特點[2]。近年來，造血干細(xì)胞移植在臨床中被廣泛運用及沙利度胺、硼替佐米等化療藥物的聯(lián)合使用幫助延緩了患者的死亡時間，但由于腫瘤細(xì)胞所產(chǎn)生的耐藥性，MM仍然屬于不可治愈的疾病[3-4]。隨著對微小RNA (miRNA)研究的逐漸加深，人們明確認(rèn)識到miRNA可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性。近年來研究[5-10]表明，miRNA可影響靶基因mRNA穩(wěn)定性，轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)，在細(xì)胞發(fā)育、分化、增殖、凋亡等過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，循環(huán)中miRNA可作為診斷、療效評價和預(yù)后預(yù)測的重要標(biāo)志物，且miRNA的表達(dá)模式與實體瘤和血液腫瘤的生物學(xué)和臨床特點相關(guān)。其中有研究[11-13]發(fā)現(xiàn)，miRNA-720、miR-17-3p及miR-215-5p可在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起關(guān)鍵作用，但對于這三種miRNA在MM中的表達(dá)及臨床意義報道較少。本研究旨在通過檢測MM患者miRNA-720、miR-17-3p及miR-215-5p的表達(dá)情況與MM的聯(lián)系，為MM的診療提供新研究思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年1月至2020年12月南京醫(yī)科大學(xué)附屬江寧醫(yī)院收治的100例多發(fā)性骨髓瘤患者為研究對象作為病例組；另選取同期入院體檢的100名健康志愿者作為對照組。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者自愿參加試驗并簽署知情同意書。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)MM診斷經(jīng)骨髓穿刺組織病理學(xué)檢查確診，符合2014年國際骨髓瘤工作組MM診斷標(biāo)準(zhǔn)[14]，骨髓克隆性漿細(xì)胞比例≥10%和(或)活組織檢查證實有漿細(xì)胞瘤，骨髓漿細(xì)胞(BMPC)≥60%，一種或多種定義骨髓瘤的事件；(2)臨床及隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)妊娠期或哺乳期婦女；(2)嚴(yán)重精神障礙，不能配合治療者；(3)合并嚴(yán)重心、肝、腎等重要臟器疾病患者；(4)合并其余惡行腫瘤患者；(5)合并其他免疫、血液系統(tǒng)疾病患者。

1.2 方法

1.2.1 血清樣本采集 采集MM 患者入院后和化療后及對照組入院時的空腹外周血2 mL， 放至帶有分離膠的真空采血管中，3 500 rpm 離心5 min，收集上清，將上層血清分裝于無RNA酶 2 mL EP 管中，置于-80 ℃冰箱保存。

1.2.2 樣本總RNA提取計逆轉(zhuǎn)錄 按TaKaRa 公司試劑盒(貨號：RR718)提供說明書進(jìn)行，反應(yīng)體系20 μL，包括dNTP 2 μL，10× RT Buffer 2 μL，RT特異引物(1 μm) 0.3 μL，Total RNA 100 ng，MMLV反轉(zhuǎn)錄酶(200 U/μL)0.2 μL，RNA 酶抑制劑(40 U/μL)0.3 μL，RNase Free dH2O 補足至20 μL，逆轉(zhuǎn)錄條件：16 ℃ 30 min；42 ℃ 40 min；85 ℃ 5 min。

1.2.3 實時熒光定量PCR反應(yīng)測定 以熒光定量 PCR 法(ABI7300 實時熒光 PCR 儀，美國ABI公司)檢測 miRNA-720、miR-17-3p及miR-215-5p水平，反應(yīng)體系：2×Master Mix 5 μL，cDNA 2 μL，10 μM 的 PCR 特異引物0.5 μL，10 μm 的 PCR 特異引物 R 0.5 μL，以RNase Free dH2O 補足至 10 μL，PCR引物采用Pirmer 5軟件設(shè)計，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列見表1。反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，循環(huán) 40 次；95 ℃ 10 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。以U6為內(nèi)參采用2-ΔΔCT方法計算miRNA相對表達(dá)水平。

表1 引物序列

1.2.4 臨床指標(biāo)采集 收集患者和健康人入院時的臨床指標(biāo)，包括漿細(xì)胞、血紅蛋白、白蛋白、血鈣和乳酸脫氫酶。漿細(xì)胞以<40%為正常[15]、血紅蛋白以≥10 g/dL為正常[16]、白蛋白以≥35 g/L為正常[17]、乳酸脫氫酶以<245 IU/L為正常[18]。ISS分期標(biāo)準(zhǔn)[19]：Ⅰ期：血清β2微球蛋白含量<3.5 mg/L，切白蛋白≥35 g/L；Ⅱ期：3.5 mg/L≤血清β2微球蛋白含量<5.5 mg/L；Ⅲ期：血清β2微球蛋白≥5.5 mg/L。M蛋白分型采用血清免疫固定電泳(immunofixation electrophoresis，IFE)檢測。療效評價：參照國際骨髓瘤工作組(IMWG)制定的多發(fā)性骨髓瘤療效判定國際統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)[20]，嚴(yán)格完全緩解(strict complete remission，sCR)為骨髓內(nèi)無克隆性漿細(xì)胞；完全緩解(complete remission，CR)為骨髓內(nèi)漿細(xì)胞≤5%；非常好的部分緩解(very good partial response，VGPR)為血清M蛋白下降≥90%；部分緩解(partial response，PR)為血清M蛋白下降≥50%；疾病穩(wěn)定(stable disease，SD)為不符合CR、VGPR、PR、PD標(biāo)準(zhǔn)；疾病進(jìn)展(progressive disease，PD)為血清M蛋白增加≥25%。以達(dá)到sCRCR、VGPR和PR為有效。

1.2.5 生存分析 對100例初治MM患者進(jìn)行生存分析，由于時間限制，選取無進(jìn)展生存期(PFS)作為評判指標(biāo)進(jìn)行分析，隨訪時間截止到2020年12月。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 兩組對象血清miRNA-720、miR-17-3p及miR-215-5p表達(dá)水平比較

病例組血清miRNA-720、miR-17-3p相對表達(dá)量高于對照組，miR-215-5p相對表達(dá)量低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組對象血清miRNA-720、miR-17-3p及miR-215-5p表達(dá)水平比較

2.2 病例組血清miRNA-720、miR-17-3p及miR-215-5p表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性

血清miRNA-720相對表達(dá)量與年齡、性別、分期、分型、漿細(xì)胞、血紅蛋白、白蛋白、乳酸脫氫酶水平無關(guān)(P>0.05)；miR-17-3p相對表達(dá)量與ISS分期相關(guān)(P<0.05)；miR-215-5p相對表達(dá)量與血紅蛋白水平相關(guān)(P<0.05)。見表3。

表3 病例組血清miRNA-720、miR-17-3p及miR-215-5p表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性

2.3 不同療效患者血清miRNA-720、miR-17-3p及miR-215-5p表達(dá)水平比較

以中位數(shù)為節(jié)點，將MM患者血清miRNA-720、miR-17-3p及miR-215-5p表達(dá)水平高于中位數(shù)組定義為高表達(dá)組(n=45)，低于中位數(shù)組定義為低表達(dá)組(n=61)。血清miRNA-720高表達(dá)患者初次化療有效率低于低表達(dá)患者(P<0.05)，血清miR-215-5p低表達(dá)患者初次化療有效率低于高表達(dá)患者(P<0.05)；血清miRNA-720高表達(dá)與低表達(dá)患者初次化療有效率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 不同療效患者血清miRNA-720、miR-17-3p及miR-215-5p表達(dá)水平比較[ n(%)]

2.4 不同表達(dá)水平miRNA-720、miR-17-3p及miR-215-5p患者Kaplan-Meier生存曲線分析

miRNA-720高表達(dá)、低表達(dá)患者總生存期分別為8～36個月(中位26.74個月)、12～36個月(中位30.08個月)；miR-17-3p高表達(dá)、低表達(dá)患者總生存期分別為10～36個月(中位26.22個月)、16～36個月(中位30.36個月)；miR-215-5p高表達(dá)、低表達(dá)患者總生存期分別為17～36個月(中位30.30個月)、11～36個月(中位26.20個月)；Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，miRNA-720低表達(dá)、miR-17-3p低表達(dá)及miR-215-5p高表達(dá)患者生存情況較好(P<0.05)。見圖1。

3 討論

目前MM的病因機制尚未完全明確，年齡過高、電離輻射的影響、機體肥胖或慢性感染等因素均是MM發(fā)生的危險因素。研究[21]顯示，M患者的5年生存率約40%。因此進(jìn)一步研究MM發(fā)生發(fā)展機制，幫助MM患者的診斷、治療及預(yù)后，及早發(fā)現(xiàn)并為開發(fā)新的靶向藥物提供條件，對改善患者預(yù)后和延長患者的整體生存時間具有重要意義。miRNA可通過轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平及翻譯水平調(diào)節(jié)控制基因的表達(dá)，細(xì)胞的發(fā)育、分化、衰老、凋亡等過程均可受其影響，在炎癥、腫瘤及免疫等多種疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，成熟的miRNA參與構(gòu)成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物，與靶基因信使RNA 的3，非編碼區(qū)結(jié)合，調(diào)控靶基因的翻譯，miRNA 在轉(zhuǎn)錄后水平可調(diào)控約30%的基因，與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有著密切的關(guān)系[22]。

本研究中病例組血清miRNA-720、miR-17-3p相對表達(dá)量高于對照組(P<0.05)，miR-215-5p相對表達(dá)量低于對照組(P<0.05)，與miRNA-720在宮頸鱗癌中高表達(dá)，miR-17-3p在結(jié)腸癌中高表達(dá)、miR-215-5p在乳腺癌中低表達(dá)[23-25]的研究結(jié)論相似，分析原因為miRNA-720受抑癌基因p53基因相關(guān)新基因的調(diào)節(jié)，可在一定程度上抑制靶蛋白p63和ADAM9的表達(dá)，從而發(fā)揮致癌基因的功能，因此其表達(dá)水平升高可對促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖具有一定促進(jìn)作用；MM患者miR-17-3p表達(dá)水平上升可能是由于與腫瘤微環(huán)境TNF-α產(chǎn)生增加與細(xì)胞表面腫瘤壞死因子受體1相結(jié)合，從而激活核轉(zhuǎn)錄因子-κB信號通路，使得轉(zhuǎn)錄因子AP-1直接與miR-17-3p基因啟動子區(qū)相結(jié)合，最終促進(jìn)其表達(dá)水平上升；而MiR-215-5p可通過AKT/GSK-3β/Snail信號通路對腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲產(chǎn)生抑制作用，其表達(dá)水平下降有利于促進(jìn)腫瘤MM的發(fā)生發(fā)展。

本研究中，血清miR-215-5p相對表達(dá)量僅與血紅蛋白水平相關(guān)(P<0.05)，與宋翠薇等[26]研究結(jié)論一致，但其作用機制尚未明確。而血清miR-17-3p相對表達(dá)量與ISS分期相關(guān)(P<0.05)，其可能的用機制包括：(1)miR-17-3p 的高表達(dá)可能通過促進(jìn)MM細(xì)胞的惡性增殖，促使血 β2 -MG水平升高，β2 -MG主要是由單核細(xì)胞及B淋巴細(xì)胞等組成的物質(zhì)，當(dāng)MM發(fā)生時大量的 β2 -MG合成入血，所以通過觀察此指標(biāo)可反映機體腫瘤的嚴(yán)重情況，從而ISS分期加重；(2)高表達(dá)的miR-17-3p可能通過結(jié)合IncRNA GCASPC信使RNA并抑制IncRNA GCASPC 的表達(dá)，使得丙酮酸羧化酶的穩(wěn)定程度增加，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞始終維持在一種高代謝的狀態(tài)、不斷增殖，最終導(dǎo)致疾病嚴(yán)重程度增加，從而影響ISS分期。血清miRNA-720高表達(dá)患者初次化療有效率低于低表達(dá)患者(P<0.05)，與食管鱗癌患者中[27]在放化療抵抗組患者血清miRNA-720水平高于放化療敏感組結(jié)果相似，作用機制可能與高表達(dá)的miRNA-720會促進(jìn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和脈管浸潤，導(dǎo)致患者出現(xiàn)化療藥物耐藥性有關(guān)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，血清miR-215-5p低表達(dá)患者化療有效率低于高表達(dá)患者(P<0.05)，作用機制可能是由于miR-215-5p低表達(dá)預(yù)示腫瘤處于較高的增殖狀態(tài)，腫瘤生長速度較快，對周圍組織的侵襲性也較強[28]，且miR-215-5p的異常表達(dá)破壞了原有的增殖平衡，正、負(fù)調(diào)節(jié)失衡，細(xì)胞增殖加快，藥物對疾病的治療效果降低。生存分析結(jié)果顯示，miRNA-720低表達(dá)、miR-17-3p低表達(dá)及miR-215-5p高表達(dá)患者生存情況較好(P<0.05)。與Ren等[29]對于MM中miRNA-720的表達(dá)增加與較短的無進(jìn)展生存期相關(guān)，表明預(yù)后不良的結(jié)果相似。有研究[30]表明，MM患者血漿miR-17-3p表達(dá)水平與初始化療療效無關(guān)、但miR-17-3p高表達(dá)患者3年總體生存率低于低表達(dá)者(P<0.05)，機制可能與上述的相應(yīng)的基因表達(dá)情況與腫瘤的發(fā)生發(fā)展和化療的有效率相關(guān)，例如miR-215-5p低表達(dá)時MM病理情況更加嚴(yán)重且化療有效率較低，miR-215-5p在MM漿細(xì)胞和人骨髓瘤細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)時可抑制骨髓瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡，在MM中發(fā)揮抑癌基因的作用[31]。

綜上所述，miRNA-720、miR-17-3p及miR-215-5p的表達(dá)與MM的發(fā)生發(fā)展有密切聯(lián)系，可通過監(jiān)測此三種基因的情況反映患者的病情，得到化療藥物的有效情況，從而實施更有效的治療措施，提升患者的生存率。