刁凌云，皇金萍，陳洋，孫唱，王勝英，羅玉國，葛飛

(1．南京中醫(yī)藥大學(xué)徐州附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，江蘇 徐州 221000；2．揚州大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬海安市中醫(yī)院消化科，江蘇 海安 226600)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcreative colitis，UC)是一種侵襲腸道粘膜的慢性炎癥和潰瘍性病變，臨床表現(xiàn)包括血性腹瀉、腹痛、里急后重、嘔吐等，偶爾表現(xiàn)為關(guān)節(jié)炎、虹膜睫狀體炎和肝功能障礙等[1]。UC以病情遷延不愈、緩解和復(fù)發(fā)交替為特征，使臨床診斷面臨巨大挑戰(zhàn)。尋求準(zhǔn)確且高效的監(jiān)測手段對早期發(fā)現(xiàn)UC，并采取有效措施治療降低臨床復(fù)發(fā)率、改善疾病預(yù)后十分重要[2]。

免疫反應(yīng)是造成炎癥加重及組織損傷的關(guān)鍵，由于核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)核內(nèi)與kB序列結(jié)合可影響多種炎性因子如腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和IL-10表達(dá)，故NF-κB與炎性反應(yīng)、細(xì)胞增殖等關(guān)系密切[3]。炎癥反應(yīng)在UC的發(fā)生發(fā)展中占據(jù)主要地位，Toll樣受體家族(TLRs)分布于不同的免疫細(xì)胞表面。研究[4]發(fā)現(xiàn)，TLR2、TLR4在UC中表達(dá)升高，而TLR1水平則未見明顯波動。由于TLR4可通過LPS下游MyD88依賴性及非依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來多種炎性因子分泌，故TLR4介導(dǎo)的信號通路被認(rèn)為是UC發(fā)病的重要因素[5]。髓過氧化物酶(MPO)是存在于中性粒細(xì)胞的一種過氧化物酶，具有使過氧化氫還原的能力，可定量反應(yīng)組織炎性損傷的程度[6]。本研究通過檢測UC患者TLR2、TLR4、NF-κB、IL-1β、TNF-α、IL-10及MPO活性，分析各指標(biāo)在UC早期診斷及預(yù)后評估中的價值，為臨床治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年7月至2021年6月南京中醫(yī)藥大學(xué)徐州附屬醫(yī)院收治的108例UC患者為研究對象，并設(shè)為研究組；另選102例同期于本院進(jìn)行腸鏡檢查未見異常患者為對照組。研究組中，男性58例，女性50例；年齡25～65歲，平均(41.33±8.98)歲；病程5～31個月，平均(23.41±4.25)個月；主要病變位置：乙狀結(jié)腸36例，直腸34例，左半結(jié)腸22例，全結(jié)腸16例。對照組中，男性54例，女性48例；年齡24～62歲，平均(41.65±8.37)歲。本研究已獲得院倫理委員會批準(zhǔn)，所有研究對象均簽署知情同意書。兩組患者性別、年齡等比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。UC患者參考Mayo評分[7]評估疾病臨床活動度，并分為活動期組(總分3～12分，n=70)及緩解期(評分<2分，n=38)；參考Sutherland疾病活動指數(shù)(disease activity index，DAI)[8]對活動期患者進(jìn)行分級，并分為輕度組(n=21)、中度組(n=27)及重度組(n=22)，依據(jù)預(yù)后分為預(yù)后良好組(n=44)及預(yù)后不良組(n=26)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)UC納入標(biāo)準(zhǔn)參照《炎癥性腸病診斷與治療的共識意見(2018年，北京)》[9]；(2)入組前2月內(nèi)均未接受相關(guān)系統(tǒng)性治療者；(3)臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其它感染性結(jié)腸炎、腸阿米巴病等；(2)合并惡性腫瘤；(3)合并重要器官功能障礙；(4)合并其它免疫系統(tǒng)疾病。

1.2 方法

1.2.1 資料收集 收集所有研究對象年齡、性別、疾病活動情況、臨床表現(xiàn)、DAI評分、內(nèi)鏡表現(xiàn)等。并根據(jù)蒙特利爾分型區(qū)[10]分各UC患者病變位置，其中E1代表病變僅存在于直腸；E2代表病變累及左半結(jié)腸；E3為廣泛病變累及脾曲乃至全結(jié)腸。另根據(jù)受累腸段最嚴(yán)重處的血管紋理、出血情況、糜爛和潰瘍計算潰瘍性結(jié)腸炎內(nèi)鏡下嚴(yán)重程度指數(shù)(ulcerative colitis endoscopic index of severity，UCEIS)[11]評分，其中2～6分為內(nèi)鏡下輕、中度活動度，7分或8分為內(nèi)鏡下重度活動度。見表1。

表1 UCEIS評分細(xì)則

1.2.2 TLR2、TLR4、NF-κB 蛋白表達(dá)水平檢測 所有患者進(jìn)行結(jié)腸鏡檢查，并在結(jié)腸炎癥最明顯處取活檢粘膜及適量組織，進(jìn)行固定。采用免疫組織化學(xué)法檢測各組結(jié)腸組織中TLR2(美國Santa Cruzsc公司，貨號：P4052Rb-h)、TLR4(美國Santa Cruzsc公司，貨號：P4051Rb-h)、NF-κB(上海貝博生物，貨號：YT746)蛋白表達(dá)強(qiáng)度，連續(xù)切片5張(4～5 μM)，對石蠟切片常規(guī)脫蠟，水化，封閉，脫水，熱修復(fù)抗原，PBS液洗滌兩次(5 min/次)。滴加5%正常山羊血清，滴加均為1∶2 000稀釋的TLR2、TLR4多克隆抗體50 μL于不同切片上，PBS沖洗3次，5 min/次。將載玻片從冰箱中取出，孵育(37 ℃，30 min)，PBS沖洗3次；甩干后滴加試劑1(生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG)，再次孵育、沖洗，滴加試劑2(辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作))，PBS沖洗3次，5 min/次；最后DAB進(jìn)行顯色。日本OLMPUS公司顯微攝像系統(tǒng)進(jìn)行觀察，在所有切片上下左右及中央部位隨機(jī)選取5個視野圖片，以染色呈棕褐色或者棕黃色沉淀為陽性細(xì)胞標(biāo)志， Image Pr0 Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)(美國MediaCybemetics公司)進(jìn)行半定量分析，測定組織TLR2、TLR4陽性細(xì)胞的IOD值。

1.2.3 炎性因子IL-1β、TNF-α、IL-10水平檢測 采用放射免疫分析法檢測各組血清IL-1β、TNF-α、IL-10水平。設(shè)備為FI-2003/2008ps全自動γ放射免疫計數(shù)器，IL-1β、TNF-α、IL-10放射免疫分析試劑盒購自北京福瑞生物工程公司，貨號分別為ML-Elisa-0378、ML-Elisa-1420、BJ-R64865。嚴(yán)格按照試劑操作說明書完成試驗。

1.2.4 MPO活性檢測 參照邱重陽[12]研究方法，并進(jìn)行改進(jìn)。取出的結(jié)腸組織以10%甲醛固定，石蠟包埋后切為4 μL薄片，HE染色，通過過供氫體鄰連茴香胺供氫后生成黃色化合物，在460 nm處通過比色測定A產(chǎn)物的生成量，從而推算出MPO的活力。計算公式：MPO(u/g)=測定管OD值-對照管OD值/0.113。

1.2.5 預(yù)后隨訪 根據(jù)《炎癥性腸病診斷與治療的共識意見(2012 年廣州)》[13]對 UC 患者進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化治療 ，治療兩個月后由同一名醫(yī)師復(fù)查腸鏡，鉗取原病變位置組織，采用Mayo內(nèi)鏡評分[9]對粘膜愈合情況進(jìn)行評估，并將Mayo內(nèi)鏡評分為0分者納入預(yù)后良好組，Mayo內(nèi)鏡評分≥1分者納入預(yù)后不良組。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 研究組活動期和緩解期患者與對照組TLR2、TLR4、NF-κB、IL-1β、TNF-α、IL-10及MPO活性比較

研究組活動期組、緩解期患者及對照組TLR2、TLR4、NF-κB、IL-1β、TNF-α水平及MPO活性比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且活動期組>緩解期組>對照組；IL-10水平和活動期組<緩解期組<對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2、圖1、圖2及圖3。

表2 研究組活動期和緩解期患者與對照組TLR2、TLR4、NF-κB、IL-1β、TNF-α、IL-10及MPO活性及比較

2.2 活動期組中不同病情程度患者TLR2、TLR4、NF-κB、IL-1β、TNF-α、IL-10及MPO活性比較

輕度組、中度組及重度組TLR2、TLR4、NF-κB、IL-1β、TNF-α水平及MPO活性比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且重度組>中度組>輕度組；IL-10水平與重度組<中度組<輕度組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 不同病情程度組患者TLR2、TLR4、NF-κB、IL-1β、TNF-α、IL-10及MPO活性比較

2.3 影響UC患者預(yù)后的單因素分析

單因素分析結(jié)果顯示，預(yù)后不良組病理組織分級、UCEIS評分、DAI評分分級、TLR2、TLR4、NF-κB、IL-1β、TNF-α、IL-10及MPO活性與預(yù)后良好組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而兩組間性別、年齡、病程、病變位置比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 影響UC患者預(yù)后的單因素分析

2.4 影響UC患者預(yù)后的多因素分析

Logistics回歸分析結(jié)果顯示，UCEIS評分>6分、TLR2、TLR4、NF-κB、IL-1β、TNF-α、MPO活性升高及IL-10水平降低是影響UC患者預(yù)后不良的獨立危險因素(P<0.05)。見表5。

表5 影響UC患者預(yù)后不良的Logistic回歸分析

2.5 TLR2、TLR4、NF-κB、IL-1β、TNF-α、IL-10、MPO活性及UCEIS評分、DAI評分分級預(yù)測UC預(yù)后不良的價值

ROC曲線分析顯示， TLR2、TLR4、NF-κB、IL-1β、TNF-α、IL-10、MPO活性、UCEIS評分及DAI評分分級聯(lián)合預(yù)測UC患者預(yù)后的曲線下面積(AUC)大于單項，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表6。

表6 TLR2、TLR4、NF-κB、IL-1β、TNF-α、IL-10、MPO活性、FD4水平及UCEIS評分、DAI評分分級預(yù)測UC預(yù)后不良的價值

3 討論

UC是多種因素引起的腸道免疫系統(tǒng)對內(nèi)部菌群免疫耐受的失衡，主要累及結(jié)腸粘膜及粘膜下層[14]。目前UC的臨床診斷主要依靠臨床癥狀、輔助檢查(纖維結(jié)腸鏡檢、氣鋇灌腸雙重對比造影)及相關(guān)量表評分等[15]。UCEIS評分是評估UC內(nèi)鏡下嚴(yán)重程度的一種量表型工具，可評估患者血管模式、出血和糜爛、潰瘍狀況[16]。一項最新研究[17]顯示，應(yīng)用UCEIS可準(zhǔn)確評估UC的總體內(nèi)鏡下嚴(yán)重度。由于UC具有反復(fù)發(fā)作的特點，單純應(yīng)用內(nèi)鏡檢查對鑒別UC存在一定局限性，故尋求更多的指標(biāo)評估臨床治療效果及預(yù)后對減輕患者負(fù)擔(dān)有重要意義。盡管UC的確切發(fā)病機(jī)制仍存在爭議，但細(xì)胞因子在其中發(fā)揮的作用已得到公認(rèn)，這也為臨床診斷和治療提供了新的思路。

免疫異常為UC的主要因素之一，不僅可破壞患者原有的腸粘膜功能，還會引起其它腸外并發(fā)癥，嚴(yán)重影響預(yù)后。TLRs是一種跨膜受體和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體，該受體可以通過識別保守的微生物蛋白質(zhì)/DNA 基序或病原體相關(guān)分子模式，可識別不同的病原微生物。腸粘膜持續(xù)的損傷可使TLR4-CD14陽性的巨噬細(xì)胞聚集，增加UC對LPS等配體的敏感性，從而觸發(fā)TLR4/NF-κB信號通路，造成大量NF-κB的出現(xiàn)[18]。近年有研究[19]發(fā)現(xiàn)，NF-κB是腸道慢性炎癥發(fā)生和加重的因素之一，原因在于NF-κB可改變腸粘膜中致炎細(xì)胞因子和抑炎細(xì)胞因子的表達(dá)，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)持續(xù)發(fā)生，進(jìn)而造成上皮細(xì)胞的凋亡。張穎慧等[20]探討了Toll樣受體在UC組織中的表達(dá)變化及與組織中炎性細(xì)胞因子表達(dá)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)UC患者結(jié)腸粘膜TLR2、TLR4蛋白表達(dá)陽性率遠(yuǎn)高于正常者，認(rèn)為Toll樣受體的異常表達(dá)與UC的發(fā)生及炎癥反應(yīng)程度加重關(guān)系密切。本研究與上述結(jié)果相似，且多因素Logistics回歸分析結(jié)果顯示，TLR2、TLR4、NF-κB表達(dá)升高是影響UC患者預(yù)后不良的獨立危險因素(P<0.05)，進(jìn)一步提示各種病原微生物觸發(fā)TLRs信號通路過度活化可能是UC發(fā)病和的始動因素之一，可通過檢測UC患者TLR2、TLR4、NF-κB表達(dá)變化對病情進(jìn)展及預(yù)測預(yù)后轉(zhuǎn)歸做出預(yù)測。

UC患者由于腸道菌群失調(diào)，宿主腸黏膜對革蘭陰性菌的脂多糖的耐受性被打破，由于TLR4與革蘭陰性菌的脂多糖關(guān)系密切，導(dǎo)致結(jié)腸粘膜上皮細(xì)胞及固有層細(xì)胞大量表達(dá)TLR4，進(jìn)而激活下游的細(xì)胞因子(NF-κB等)大量釋放自由基，加重黏膜損傷。同時，腸腔內(nèi)的抗原物質(zhì)亦可經(jīng)上皮細(xì)胞，參與免疫反應(yīng)，加劇炎癥程度，形成惡性循環(huán)，因此TLR4的表達(dá)水平與UC患者炎癥反應(yīng)相關(guān)。另外，激活的NF-κB亦可激活TLR2轉(zhuǎn)錄表達(dá)，形成TLR2-NF-κB-TLR2循環(huán)。此外，細(xì)胞因子在UC患者的變化亦值得關(guān)注。本研究結(jié)果顯示，UC患者中活動期組IL-1β、TNF-α水平較對照組高(P<0.05)，IL-10水平較緩對照組低(P<0.05)，且三者水平變化與病情嚴(yán)重程度呈相關(guān)性(P<0.05)。在炎癥反應(yīng)中，IL-1β、TNF-α是促炎細(xì)胞因子，IL-10則是常見的抑炎細(xì)胞因子，三者通過控制炎癥發(fā)應(yīng)進(jìn)展，參與UC的發(fā)生、發(fā)展。

MPO是中性粒細(xì)胞中含量較高的一種酶，腸粘膜MPO活性是監(jiān)測UC活動性的常用指標(biāo)之一[21]。本研究結(jié)果顯示，UC組織中MPO表達(dá)高于正常組(P<0.05)，且在重度組患者中更為顯著(P<0.05)，提示MPO活性可反映結(jié)腸組織的病理損害程度，對于UC的早期診斷及預(yù)后評估有指導(dǎo)意義。此外，腸粘膜屏障是保證腸道功能正常運行的重要組成部分，在感染、創(chuàng)傷等應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生時，腸粘膜屏障將受到不同程度損傷，造成通透性的改變，引起細(xì)菌移位及炎癥反應(yīng)[22]。因此，明確腸粘膜屏障功能的改變，對明確UC的發(fā)生及判斷炎癥進(jìn)展有一定價值。本研究推測TLR2、TLR4、NF-κB、IL-1β、TNF-α、IL-10及MPO活性及具有預(yù)測UC預(yù)后不良的價值，經(jīng)繪制ROC曲線論證，結(jié)果顯示，各指標(biāo)AUC以聯(lián)合檢測最大，提示臨床在傳統(tǒng)手段基礎(chǔ)上，增加多項細(xì)胞因子的檢測可提高預(yù)測UC患者預(yù)后的靈敏度。

綜上所述，Toll-TLRs、炎性因子、NF-κB及MPO活性在UC患者中呈顯著異常表達(dá)，各指標(biāo)與患者病情嚴(yán)重程度關(guān)系密切，聯(lián)合檢測各指標(biāo)可作為早期診斷UC及預(yù)測患者預(yù)后的有效指標(biāo)。