焦晶凱，劉振民，鄭遠(yuǎn)榮，劉 景

（乳業(yè)生物技術(shù)國家重點實驗室，上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心，上海 200436）

紅曲霉（Monascus）的應(yīng)用在近年來備受關(guān)注，紅曲霉發(fā)酵最為常見的產(chǎn)物即為紅曲米，紅曲米的應(yīng)用已經(jīng)存在了上千年的歷史，通常是由紅曲霉（紫色紅曲霉M.purpureus、叢毛紅曲霉M.pilosus、佛羅里達(dá)紅曲霉M.floridanus、紅色紅曲霉M.ruber）發(fā)酵而成的。此外，紅曲霉也被應(yīng)用在釀酒、制藥和食品保護(hù)劑等方面。紅曲霉可以產(chǎn)生一系列的生物活性物質(zhì)，并對人體產(chǎn)生有益健康的作用，如洛伐他?。{克林）[1-2]、紅曲酸[3]、異黃酮[4]、γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）[5]以及紅曲色素[6]。Zhao Yongxia等[7]分離來自紅曲霉的麥角固醇，并證實來自紅曲的麥角甾醇具有很強的抗脂質(zhì)過氧化和抗氧化能力，以及保護(hù)和修復(fù)受損細(xì)胞的能力。Su Nanwei等[8]發(fā)現(xiàn)紅曲霉發(fā)酵的紅曲米提取物對Hep G2癌細(xì)胞具有選擇性的細(xì)胞毒性作用，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，而對正常的細(xì)胞無害。Wang Pan等[9]研究發(fā)現(xiàn)紫色紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)物可以改善凡納濱對蝦的生長性能、免疫反應(yīng)、腸道形態(tài)、微生物群和抗病性。Wang Nifei等[10]從紅曲霉發(fā)酵液中提取出對RAW 264.7巨噬細(xì)胞具有免疫調(diào)節(jié)作用的胞外多糖。Choe等[11]研究表明紅曲霉色素的蘇氨酸衍生物可以減少小鼠體質(zhì)量、附睪脂肪質(zhì)量和腹部脂肪大小。

白霉干酪屬于表面霉菌成熟軟質(zhì)干酪，它的特點是由于卡門柏青霉（Penicillium camemberti）等青霉菌生長在表面而使表面形成菌絲體，類似包裹一層白色外衣，并賦予干酪特殊的芳香風(fēng)味。最為典型的白霉干酪即為卡門貝爾干酪，卡門貝爾干酪源自于法國的諾曼底地區(qū)，它起源于法國，流傳到歐洲國家，再到南美、新西蘭和澳大利亞[12]。由于霉菌的引入帶來了更強的蛋白水解和脂肪水解作用，從而產(chǎn)生了更多脂肪酸、醛類、酯類和萜烯化合物，使白霉干酪的風(fēng)味更加的豐富。有學(xué)者對表面霉菌干酪的附屬發(fā)酵劑進(jìn)行了深一步研究，如通常會加入漢斯德巴氏酵母菌（Debaryomyces hansenii）和馬克斯克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus）改善奶酪的質(zhì)地[13]；白地霉（Geotrichum candidum）也通常被用來提高卡門貝爾干酪的風(fēng)味[14]，并成為常規(guī)的生產(chǎn)模式商業(yè)菌株。

本研究以傳統(tǒng)可食用性菌株紅曲霉為研究對象，并作為附屬發(fā)酵劑參與表面成熟白霉干酪的成熟過程，通過測定其基本理化指標(biāo)、功能性及有害性成分、質(zhì)構(gòu)和流變特性等分析紅曲霉在軟質(zhì)成熟干酪中的應(yīng)用價值，并分析紅曲霉對這類干酪成熟過程的影響。以期為紅曲霉的應(yīng)用拓展新的方向，同時紅曲霉的加入旨在改變表面成熟軟質(zhì)干酪的風(fēng)味、外觀和質(zhì)地，擴展軟質(zhì)奶酪的新品類。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

PD206746.0FR菌種（主要為卡門柏青霉）、凝乳酶Marzyme 150MG 美國Danisco公司；CHN-22菌種（主要為乳酸乳球菌乳脂亞種（Lactococcus lactissubsp.cremoris）、乳酸乳球菌乳酸亞種（L.lactissubsp.lactis）、乳酸乳球菌雙乙酰亞種（L.lactisssp.diacetylactis）、腸膜明串珠菌腸膜亞種（Leuconostoc mesenteroidessubsp.mesenteroides）） 科漢森（中國）有限公司；實驗室自篩選菌種紅曲霉M.CJ781。

奶酪槽 英國Armfiled公司；Inlab solids pro三合一pH計探頭 瑞士METTLER公司；SPECORD紫外分光光度計、ColorFlex EZ色差儀 美國HunterLab公司；TA-Hdi型質(zhì)構(gòu)分析儀 英國Stable Micro Systems公司；mb45水分測定儀 美國OHAUS公司；ARES-G2流變儀美國TA儀器公司；Ultimate 3000高效液相色譜 美國賽默飛儀器公司。

1.2 方法

1.2.1 白霉干酪的制備

首先將生牛乳（由光明乳業(yè)股份有限公司牧場提供，蛋白2.9%，脂肪3.1%）進(jìn)行巴氏殺菌，殺菌乳冷卻至34～36 ℃后泵送進(jìn)入奶酪槽，加入主發(fā)酵劑CHN-22菌種和附屬發(fā)酵劑PD206746.0FR菌種，菌種接種量分別為5 U/100 L和0.4 U/100 U，當(dāng)發(fā)酵pH值達(dá)到6.4～6.5時加入凝乳酶Marzyme 150MG，使用量為4 000 IMCU/100 L，凝乳30 min后進(jìn)行切割，切割后間隔緩慢攪拌45～60 min，隨后泵入模具，25 ℃條件下過夜，飽和食鹽水鹽漬1 h。所得干酪置于28 ℃環(huán)境下成熟2～3 d，后置于4 ℃環(huán)境下成熟25 d。得白霉干酪成熟初始階段C1干酪樣品（發(fā)酵第1天）、中期階段C2干酪樣品（發(fā)酵第15天）和末期階段C3干酪樣品（發(fā)酵第28天）。

1.2.2 紅曲霉-白霉干酪的制備

通過從紅曲米、腐乳等傳統(tǒng)食品中分離篩選出優(yōu)勢紅曲霉M.CJ233，該株菌保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物保藏中心，保藏號為CGMCC No.18563。紅曲霉M.CJ2330種子液制備：挑取紅曲霉菌株，在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基中活化，PDA培養(yǎng)基包括馬鈴薯粉4～6 g/L、葡萄糖18～22 g/L，培養(yǎng)基的pH值為5.4～5.8，隨后進(jìn)行10～20 倍的擴培。紅曲霉-白霉干酪的制備方法與1.2.1節(jié)白霉干酪的制備基本相同，僅將附屬發(fā)酵劑PD206746.0FR菌種變?yōu)橥瑫r加入發(fā)酵劑PD206746.0FR菌種和紅曲霉M.CJ233種子液。得紅曲霉-白霉干酪成熟初始階段MCC1干酪樣品（發(fā)酵第1天）、中期階段MCC2干酪樣品（發(fā)酵第15天）和末期階段MCC3干酪樣品（發(fā)酵第28天）。

1.2.3 干酪的理化測定

pH值測定采用用Inlab solids pro三合一pH計插入干酪樣品直接測定。采用mb45水分測定儀測定干酪樣品水分含量。蛋白質(zhì)測定采用AOAC 2001.14[15]；脂肪測定采用AOAC 933.05[16]；總膳食纖維測定采用AOAC 991.43[17]；灰分測定采用AOAC 935.42[18]。色差采用ColorFlex EZ色差儀進(jìn)行測定；紅色素、橙色素和黃色素分別以干酪乙醇提取液在500、470 nm和400 nm波長下的吸光度表示。

1.2.4 感官評價分析

按照Zhao Zheng等[19]的測試方法，根據(jù)9 個尺度進(jìn)行分析，即1-極度不喜歡，9-極度喜歡。向平常有品嘗或接觸干酪的14 人（8 位男性和10 位女性）分發(fā)問卷，以評估總體接受度。

1.2.5 質(zhì)構(gòu)特性

干酪的質(zhì)構(gòu)分析采用質(zhì)構(gòu)儀測定，測量方式為兩次下壓，模式measure force in compress；測試前速度1.00 mm/s，測試速度1.00 mm/s，測量后探頭回程速度5.00 mm/s；測試距離5 mm；探頭類型為P/0.5R，每組樣品平行測定5 次。

曲線參數(shù)及其定義：1）硬度：最大力值以N（g）表示，表示干酪對變形的抵抗能力。2）黏附性：食品表面和其他物體（舌、牙、口腔）附著時，剝離它們所需要的力。3）彈性：表示收到徹底擠壓后恢復(fù)形變的能力。

1.2.6 流變特性測定

采用ARES-G2流變儀，樣品在恒定溫度20 ℃下統(tǒng)一測定，04 RAD錐形鈦板，平板直徑50 mm，間隙1 mm，應(yīng)變掃描范圍為0.01%～10%，動態(tài)頻率掃描在20 ℃下，根據(jù)線性黏彈區(qū)所確定的應(yīng)變值0.1%，GAP設(shè)置為1 mm，在0.1～100 rad/s范圍內(nèi)頻率掃描，測定儲能模量（G’）、損耗模量（G’’）、復(fù)合模量（G*）和耗損角tanδ的變化情況。

1.2.7 干酪的功能及有害成分測定

洛伐他汀和橘青霉素測定：使用5 mL 68%的乙醇提取1 g樣品，混合1 h，后置于40 ℃水域下保持12 h，2 000×g離心15 min，使用沃特曼1號濾紙過濾上清液并真空蒸干。取1 mL流動相溶解并用0.45 μm膜過濾后上機測試。使用Dionex Ultimate 3000超高性能液相色譜與四極Orbitrap質(zhì)譜儀聯(lián)用，在電噴霧離子源模式下進(jìn)行測定，使用C18柱（180 μm×20 mm，100 ?），用含有0.1%甲酸和5 mmol/L甲酸銨的甲醇梯度洗脫進(jìn)行分析，甲醇從2%增加到98%，保持1.5 min，隨后在0.5 min內(nèi)降到2%，并維持2 min達(dá)到平衡。

GABA測定：GABA的提?。菏褂?0 mL 75%乙醇溶液提取1 g樣品，混合30 min，6 500×g離心10 min。使用沃特曼1號濾紙過濾上清液并真空蒸干，取1 mL流動相溶解并用0.45 μm膜過濾后上機測試。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法同洛伐他汀和橘青霉素測定方法。

黃曲霉素測定：采用GB 5009.24—2010《食品中黃曲霉毒素M1和B1的測定》方法。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

硬度、黏性、彈性數(shù)據(jù)利用TA-Hdi型質(zhì)構(gòu)分析儀自帶軟件Exponent進(jìn)行處理獲得。數(shù)據(jù)結(jié)果利用統(tǒng)計分析軟件SPSS進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 白霉干酪和紅曲霉-白霉干酪的理化指標(biāo)

如表1所示，紅曲霉-白霉干酪的紅度值a*為7.81～19.05，顯著高于白霉干酪，由圖1所示，可以明顯看到紅曲霉-白霉奶酪的紅色素沉淀，這是由于紅曲霉在生長過程中可以產(chǎn)生天然的紅曲色素，紅曲色素是一組通過酯化聚酮生色團(tuán)和β-酮酸衍生而來的紅曲霉代謝產(chǎn)物，具有抗菌、抗腫瘤和抗氧化的作用[20]，Lee等[21]發(fā)現(xiàn)紅曲色素monascin和ankaflavin可以降低低密度脂蛋白膽固醇并保留和促進(jìn)高密度脂蛋白膽固醇的形成，由表1也可以看出，紅色素、橙色素和黃色素的值在不同發(fā)酵階段也是顯著高于白霉干酪；通過感官測試，干酪在發(fā)酵初期時比較受歡迎，這與我國本土的飲食文化相關(guān)，隨著成熟時間的延長，感官評定分?jǐn)?shù)逐漸下降，而可以看出在成熟后，加入紅曲霉的干酪風(fēng)味得到了更多人的接受。

表1 白霉干酪和紅曲霉-白霉干酪的理化指標(biāo)Table 1 Physiochemical parameters of white mold cheese with and without Monascus

圖1 紅曲霉-白霉干酪Fig.1 White mold cheese with Monascus at the middle and late ripening stages

結(jié)果顯示，額外添加紅曲霉，使奶酪的膳食纖維和蛋白質(zhì)含量增高，如表1所示，紅曲霉-白霉干酪的蛋白質(zhì)為17.4%～19.6%，膳食纖維為5.22%～6.81%，而白霉干酪的蛋白質(zhì)為13.8%～16.9%，膳食纖維為3.22%～5.16%，Sun Congcong等[22]也發(fā)現(xiàn)紅曲霉可以增加豆渣的膳食纖維含量。但是，脂肪并未表現(xiàn)增加，已有學(xué)者對紅曲霉菌進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，該菌具有一定降解脂肪的作用，如張茜等[23]研究了20 株紅曲霉在含有膽固醇的培養(yǎng)基中生長情況，結(jié)果表明，供試的20 株紅曲霉均具有降解膽固醇的能力，部分菌株對膽固醇降解率甚至超過50%。Suraiya等[24]研究發(fā)現(xiàn)紅曲霉提取物可以抑制3T3L-1細(xì)胞的成脂分化，經(jīng)過油紅O染色顯示細(xì)胞胞質(zhì)油滴呈紅曲霉提取物劑量依賴性下降，與對照相比，紅曲霉提取物處理的細(xì)胞中脂質(zhì)的積累較低。紅曲霉菌產(chǎn)生的洛伐他汀也是公認(rèn)降脂的主要成分[25]。

2.2 白霉干酪和紅曲霉-白霉干酪的理化指標(biāo)的質(zhì)構(gòu)特性

由表2可以看出，紅曲霉-白霉干酪在成熟初期和中期，硬度顯著高于白霉干酪，而到了成熟期末時，其硬度與白霉干酪硬度無顯著差異，白霉干酪的硬度為1 341.52 g，紅曲霉-白霉干酪的硬度為1 376.83 g。霉菌生長到一定階段時會產(chǎn)生蛋白酶，使干酪中的蛋白膠束發(fā)生水解，蛋白空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)強度和剛度降低[26]，因此可以解釋紅曲霉-白霉的硬度在末期逐漸變小，而白霉干酪硬度之所以沒有減少，可能原因為白霉干酪的水分損失帶來的硬度增加，大于白霉蛋白酶水解帶來的硬度減小。紅曲霉-白霉干酪的彈性為90.35～92.15，黏性為1 078.47～1 766.82，顯著高于白霉干酪，這可能與增加的紅曲霉-白霉干酪膳食纖維有關(guān)，膳食纖維與持水力非常相關(guān)，不僅可溶性膳食纖維和不可溶膳食纖維的比例影響持水力[22]，可溶性膳食纖維顆粒的比表面積增加也會增加持水的能力[27]。加入紅曲霉后帶來的質(zhì)構(gòu)的變化，可能也增加了干酪的可接受程度（如表1感官評定所示）。

表2 不同成熟期軟質(zhì)干酪的質(zhì)構(gòu)特性Table 2 Textural properties of soft cheese at different ripening stages

2.3 白霉干酪和紅曲霉-白霉干酪的流變特性

如圖2所示，G’和G’’隨著角頻率的增加而緩慢增加，并且G’顯著大于G’’說明干酪樣品表現(xiàn)出良好的固態(tài)彈性，最初成熟階段，兩種奶酪的G’并沒有顯著差別，隨著成熟時間的延長，紅曲霉-白霉干酪的G’明顯增加，說明額外添加紅曲霉之后可以很好地增加干酪的彈性。此外，G’隨著干酪成熟時期的延長不斷增加，說明隨著干酪的成熟，質(zhì)地趨勢漸好。

圖2 干酪成熟過程中的流變特性Fig.2 Rheological properties of cheese at different ripening stages

機械損耗角正切（tanδ）是G’’與G’之比，tanδ值越小，說明復(fù)配凝膠體系的彈性越大，tanδ值越大則說明復(fù)配凝膠體系的黏性越大[28]。紅曲霉-白霉成熟末期樣品（MCC3）隨著角頻率的增加，tanδ值的降低斜率最大，說明，此時的MCC3樣品的彈性最為良好。

2.4 白霉干酪和紅曲霉-白霉干酪的功能及有害成分分析

紅曲霉被廣泛應(yīng)用于20多種食品中，而沒有對健康產(chǎn)生不利的影響，此外，以紅曲霉發(fā)酵生產(chǎn)的紅曲米被廣泛的用于食品、防腐劑、食品著色劑和制藥，公認(rèn)的紅曲霉代謝產(chǎn)物具有抗炎、抗氧化、抗疲勞、抗腫瘤、降血糖和降壓等功效[29]。

檢測紅曲霉-白霉干酪中具有降血脂功效的洛伐他汀和可以緩解疲勞的GABA含量，如圖3所示，在紅曲霉-白霉干酪中期和末期分別檢測到（0.05±0.01）mg/kg和（2.21±0.01）mg/kg洛伐他汀，未加入紅曲霉的白霉干酪的并未檢測到，眾所周知，洛伐他汀是降血脂藥物中的主要成分，各種臨床實驗表明，紅曲霉代謝產(chǎn)物紅曲米在不耐受常規(guī)的他汀類藥物的高血脂患者中極為有效，紅曲霉干酪是另一種極為有潛力替代紅曲米的治療高血脂患者的食物。

圖3 干酪中的橘青霉素、黃曲霉毒素、洛伐他汀和GABA含量Fig.3 Contents of citrinin, aflatoxin, mevinolin and gammaaminobutyric acid in cheese

在所有干酪中均檢測到GABA，白霉干酪中的GABA含量為（0.63±0.01）～（1.25±0.07）mg/kg，紅曲霉-白霉干酪中的GABA含量為（0.54±0.02）～（0.70±0.01）mg/kg。GABA是交感神經(jīng)系統(tǒng)中的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，在一項關(guān)于果糖誘導(dǎo)的高血壓研究中發(fā)現(xiàn)，胃內(nèi)給服含有GABA（1 mg/（kg·d））的紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)物后，可使血壓升高恢復(fù)到正常水平，而等計量的純GABA給藥并沒有產(chǎn)生作用[29]。紅曲白霉干酪中的GABA的作用有待于進(jìn)一步深入研究。

雖然紅曲霉早已廣泛應(yīng)用于人們的生活中，但它所產(chǎn)生的橘青霉素是目前科學(xué)家們主要擔(dān)心會對人體產(chǎn)生危害的物質(zhì)，橘青霉素是一種真菌毒素，對人體肝臟和腎臟有害。目前國際上關(guān)于橘青霉素的限量法規(guī)如，日本允許限量為200 μg/kg；2019年歐盟委員會發(fā)布2019/1901號條例，修訂以紅曲霉發(fā)酵的大米基食品補充劑中橘青霉素的最高限量從2 000 μg/kg降低到100 μg/kg。通過檢測發(fā)現(xiàn)，紅曲霉發(fā)酵的干酪中未檢測到黃曲霉素，但存在少量橘青霉素，其含量在100 μg/kg之下，此外除發(fā)酵初期橘青霉素含量接近100 μg/kg（可能由發(fā)酵劑帶入）外，其他樣品含量均低于50 μg/kg，遠(yuǎn)低于商業(yè)用途的紅曲米中橘青霉素的含量，有學(xué)者研究紅曲米中橘青霉素在0.28～2 458.80 mg/kg范圍不等[30]。橘青霉素的存在給紅曲霉相關(guān)產(chǎn)品的應(yīng)用帶來了極大限制，目前有很多學(xué)者通過科學(xué)手段降低橘青霉素的含量，有學(xué)者使用三羥基異黃酮[31]、黃酮類化合物[32]、蘆丁[33]等化合物誘導(dǎo)抑制，降低了紅曲霉產(chǎn)生橘青霉素含量；再有通過改變生長環(huán)境如降低pH值、增加極低頻磁場等方式抑制橘青霉素的產(chǎn)生；也有學(xué)者通過敲除橘青霉素合成相關(guān)基因[34]等手段降低橘青霉素的含量。通過這些方式可以幫助更好地提高和控制紅曲霉相關(guān)產(chǎn)品安全和質(zhì)量。

3 結(jié) 論

本研究分析了紅曲霉在牛乳中的發(fā)酵特性，并與成熟軟質(zhì)霉菌干酪-白霉干酪進(jìn)行對比，表征了紅曲霉-白霉干酪特性。紅曲霉-白霉干酪對比傳統(tǒng)白霉干酪，具有天然紅曲色素的外觀，含有更多的蛋白質(zhì)和膳食纖維，并在更高含水量的情況下，維持脂肪含量不變。質(zhì)構(gòu)和流變特性也加以改善，同時增加了洛伐他汀功能性成分。額外添加紅曲霉也增加了干酪的可接受度。結(jié)果分析表明，紅曲霉可以很好地應(yīng)用于干酪的生產(chǎn)，并賦予干酪更好的質(zhì)構(gòu)特性、更多的活性成分和營養(yǎng)價值，為紅曲霉的應(yīng)用開辟了更廣闊的前景，增加了軟質(zhì)成熟干酪附屬發(fā)酵劑的新品類，為進(jìn)一步研究適合中國人口味的軟質(zhì)成熟干酪奠定基礎(chǔ)。