孫宏躍，艾亮，趙宗瑞，張富青，陶占領(lǐng)

（1.鄭州市婦幼保健院檢驗(yàn)科2.鄭州市金水區(qū)總醫(yī)院檢驗(yàn)科3.鄭州安圖生物工程股份有限公司，河南 鄭州 450000）

人巨細(xì)胞病毒(Human Cytomegalovirus,CMV)和風(fēng)疹病毒（Rubella virus）是引起先天性感染的重要病原體。 35～50%的孕婦原發(fā)感染巨細(xì)胞病毒后可導(dǎo)致胎兒宮內(nèi)感染，其中約10%的宮內(nèi)感染胎兒會(huì)發(fā)生出生缺陷，嚴(yán)重程度與感染的病毒量、毒力和孕期有關(guān)，孕早期原發(fā)感染發(fā)生出生缺陷的幾率更高。 先天性感染的胎兒多數(shù)可出現(xiàn)智力低下，視力受損，聽(tīng)力喪失等癥狀，特別是引起嬰兒的巨細(xì)胞包涵體病，患兒可多個(gè)系統(tǒng)、多個(gè)器官受損[1]。 孕婦在孕期感染風(fēng)疹病毒，可能會(huì)導(dǎo)致新生兒出現(xiàn)先天性風(fēng)疹綜合征（congenital rubella syndrome,CRS），最常見(jiàn)的出生缺陷是白內(nèi)障等眼疾患，其次是耳聾和心血管系統(tǒng)缺損[2,3]，懷孕的前三個(gè)月原發(fā)感染，宮內(nèi)感染的幾率在70%以上，出生缺陷的幾率在80%以上，在懷孕的后三個(gè)月原發(fā)感染，宮內(nèi)感染的幾率會(huì)降低到10%以下，很少會(huì)出現(xiàn)出生缺陷，因此確定是否為原發(fā)感染以及感染時(shí)間非常重要[4]。

目前對(duì)巨細(xì)胞病毒和風(fēng)疹病毒感染的篩查主要是檢測(cè)血清中的IgG 和IgM 抗體，單份血清樣本IgM 抗體檢測(cè)存在一些缺點(diǎn)，例如假陽(yáng)性，IgM抗體過(guò)早消失，有些感染者IgM 抗體可能存在半年以上，復(fù)發(fā)感染也會(huì)產(chǎn)生IgM 抗體[5]等。IgM 抗體陽(yáng)性同時(shí)IgG 抗體出現(xiàn)血清轉(zhuǎn)化被認(rèn)為是判斷急性感染的金標(biāo)準(zhǔn)，但是這需要至少間隔一周以上的兩次樣本且容易錯(cuò)過(guò)最佳采樣時(shí)機(jī)，這給判斷是否為近期感染帶來(lái)了困難。

近年來(lái)通過(guò)IgG 抗體親和力的檢測(cè)進(jìn)行風(fēng)疹病毒原發(fā)急性感染的診斷在國(guó)外已有報(bào)道，IgG 親和力檢測(cè)可以幫助區(qū)分是否為原發(fā)感染或新的復(fù)發(fā)感染，因?yàn)榈陀H和力的IgG 抗體出現(xiàn)在感然后的前幾個(gè)月，隨著時(shí)間的推移，抗體逐漸成熟為高親和力的抗體，高親和力的IgG 抗體可以排除發(fā)生在4 個(gè)月以?xún)?nèi)的感染[6,7]。 本文通過(guò)對(duì)原發(fā)感染人群、既往感染人群、IgM 抗體陽(yáng)性人群的風(fēng)疹病毒和巨細(xì)胞病毒IgG 抗體親和力水平檢測(cè)，評(píng)估抗體親和力檢測(cè)在判斷急性感染診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 樣本

1.1.1 風(fēng)疹病毒急性感染樣本（BIOMEX 公司血清轉(zhuǎn)化樣本盤(pán)） SCP-RV-001，15 例樣本，取樣時(shí)間至感染后第50d；SCP-RV-002，13 例樣本，取樣時(shí)間至感染后第42d；SCP-RV-003，20 例樣本，取樣時(shí)間至感染后第71d；SCP-RV-004，15 例樣本，取樣時(shí)間至感染后第60d。 四個(gè)血清轉(zhuǎn)化盤(pán)共計(jì)樣本63 例，這些樣本是確定的原發(fā)急性感染樣本，用于監(jiān)測(cè)風(fēng)疹病毒IgG 抗體親和力與感染時(shí)間的關(guān)系。

1.1.2 巨細(xì)胞病毒急性感染樣本（BIOMEX 公司血清轉(zhuǎn)化樣本盤(pán)） SCP-CMV-001，15 例樣本，取樣時(shí)間至感染后第99d；SCP-CMV-002，25 例樣本，取樣時(shí)間至感染后第124d；SCP-CMV-003，5 例樣本，取樣時(shí)間至感染后第34d；SCP-CMV-005，6 例樣本，取樣時(shí)間至感染后第35d；SCP -CMV -006，24 例樣本，取樣時(shí)間至感染后第122d；SCPCMV-007，20 例樣本，取樣時(shí)間至感染后第98d。六個(gè)血清轉(zhuǎn)化盤(pán)共計(jì)樣本95 例，這些樣本是確定的原發(fā)急性感染樣本，用于監(jiān)測(cè)巨細(xì)胞病毒IgG 抗體親和力與感染時(shí)間的關(guān)系。

1.1.3 初篩IgM 抗體陽(yáng)性樣本 州市婦幼保健院優(yōu)生遺傳中心2014年12月1 日-2016年4月30日，篩查的孕婦風(fēng)疹病毒IgM 和IgG 抗體均為陽(yáng)性的樣本43 例，巨細(xì)胞病毒IgM 和IgG 抗體均為陽(yáng)性的樣本59 例（鄭州安圖生物工程股份有限公司產(chǎn)品），-20℃保存。

1.1.4 既往感染樣本 鄭州市婦幼保健院優(yōu)生遺傳中心2016年2月1 日-2016年4月30 日，篩查的孕婦風(fēng)疹病毒IgG 抗體陽(yáng)性IgM 抗體陰性的樣本300 例，巨細(xì)胞病毒IgG 抗體陽(yáng)性IgM 抗體陰性的樣本300 例（鄭州安圖生物工程股份有限公司產(chǎn)品），-20℃保存。

1.2 方法

1.2.1 親和力檢測(cè)試劑盒 風(fēng)疹病毒IgG 抗體親和力檢測(cè)試劑盒（ELISA），批號(hào)20151201，巨細(xì)胞病毒IgG 抗體親和力檢測(cè)試劑盒（ELISA），批號(hào)20151201，鄭州安圖生物工程股份有限公司生產(chǎn)。

1.2.2 親和力檢測(cè)方法 樣本1/100 稀釋后復(fù)孔加樣，37℃反應(yīng)30min 后洗滌微孔板，向其中一個(gè)孔加入對(duì)照緩沖液，另外一個(gè)孔加入解離緩沖液，37℃反應(yīng)10min，在此過(guò)程中解離孔中的結(jié)合的IgG 抗體會(huì)被解離緩沖液從結(jié)合的抗原上解離，洗滌微孔板后加入二抗酶結(jié)合物，37℃反應(yīng)30min 后顯色。

1.2.3 親和力計(jì)算 IgG 抗體親和力指數(shù)（Avidity Index，AI）=解離緩沖液孔OD 值/對(duì)照緩沖液孔OD值×100%。

注：樣本中IgG 抗體濃度需大于試劑盒要求才能用于IgG 抗體親和力計(jì)算，但是當(dāng)樣本中IgG 抗體濃度太高時(shí)，OD 值會(huì)超出3.0，這種情況下需要將樣本4 倍稀釋后重新檢測(cè)，或者使用405/620 雙波長(zhǎng)讀數(shù)后計(jì)算親和力。

1.2.4 親和力結(jié)果判斷 風(fēng)疹病毒IgG 親和力指數(shù)：≤50%，為低親和力；50%～55%之間為灰區(qū)；＞55%為高親和力。 巨細(xì)胞病毒IgG 親和力指數(shù)：＜45%，為低親和力；45%～50%之間為灰區(qū)；＞50%為高親和力。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism 5 統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。 數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)方法分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 急性感染者抗體親和力檢測(cè)結(jié)果 風(fēng)疹病毒4個(gè)抗體血清轉(zhuǎn)化盤(pán)（BIOMEX 公司） 共計(jì)63 例樣本，取樣時(shí)間從感染開(kāi)始至第71d，有17 例樣本因取樣時(shí)間較早，IgG 抗體為陰性，不能計(jì)算親和力，其余46 例樣本的IgG 親和力水平隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)而持續(xù)升高，從第20d 的約10%，升高到第71d 的約45%，均為低親和力，見(jiàn)圖1。

圖1 風(fēng)疹病毒IgG 抗體親和力水平隨感染時(shí)間的變化

巨細(xì)胞病毒6 個(gè)抗體血清轉(zhuǎn)化盤(pán)（BIOMEX 公司） 共計(jì)95 例樣本，取樣時(shí)間從感染開(kāi)始至第124d，有18 例樣本因取樣時(shí)間較早，IgG 抗體為陰性，不能計(jì)算親和力，其余77 例樣本的IgG 親和力水平隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)而持續(xù)升高，但不同樣本的抗體親和力成熟時(shí)間有所不同，有3 例樣本至第99d（3 個(gè)月）仍為低親和力，1 例樣本在75d成熟為高親和力，見(jiàn)圖2。

圖2 巨細(xì)胞病毒IgG 抗體親和力水平隨感染時(shí)間的變化

2.2 初篩IgM 抗體陽(yáng)性樣本和既往感染樣本抗體親和力檢測(cè)結(jié)果 來(lái)我院優(yōu)生遺傳中心進(jìn)行TORCH 感染篩查的孕婦均用ELISA 方法檢測(cè)了風(fēng)疹病毒和巨細(xì)胞病毒IgM 和IgG 抗體，并對(duì)初篩IgM 抗體陽(yáng)性的樣本進(jìn)行了復(fù)測(cè)確認(rèn)，共檢出風(fēng)疹病毒IgM(+)IgG(+)樣本43 例，巨細(xì)胞病毒IgM(+)IgG(+)樣本59 例，另隨機(jī)選擇風(fēng)疹病毒和巨細(xì)胞病毒IgM(-)IgG(+)既往感染樣本各300 例。

如表1 所示，43 例風(fēng)疹病毒IgM(+)IgG(+)樣本中有20 例檢測(cè)為低親和力，18 例檢測(cè)為高親和力，5 例檢測(cè)為灰區(qū)。 300 例風(fēng)疹病毒IgM(-)IgG(+)樣本中有1 例檢測(cè)為低親和力，3 例檢測(cè)為灰區(qū)，296 例檢測(cè)為高親和力。

表1 風(fēng)疹病毒IgG 抗體親和力檢測(cè)結(jié)果

如表2 所示，59 例巨細(xì)胞病毒IgM(+)IgG(+)樣本中有24 例檢測(cè)為低親和力，31 例檢測(cè)為高親和力，4 例檢測(cè)為灰區(qū)。 300 例巨細(xì)胞病毒IgM(-)IgG(+) 樣本中有2 例檢測(cè)為低親和力，3 例檢測(cè)為灰區(qū)，295 例檢測(cè)為高親和力。

表2 巨細(xì)胞病毒IgG 抗體親和力檢測(cè)結(jié)果

2.3 風(fēng)疹病毒急性感染樣本46 例、IgM(+)IgG(+)樣本43 份、IgM(-)IgG(+)300 份，共計(jì)389 例樣本的IgG 抗體親和力數(shù)據(jù)如圖3，巨細(xì)胞病毒急性感染樣本77 例、IgM(+)IgG(+)樣本59 例、IgM(-)IgG(+)300 例，共計(jì)436 例樣本的IgG 抗體親和力數(shù)據(jù)如圖4，可以看出三個(gè)類(lèi)型樣本之間的抗體親和力存在顯著差異（P＜0.001）。

圖3 389 份風(fēng)疹病毒IgG 抗體親和力統(tǒng)計(jì)結(jié)果

圖4 436 份巨細(xì)胞病毒IgG 抗體親和力統(tǒng)計(jì)結(jié)果

3 討論

國(guó)內(nèi)外的孕期風(fēng)疹病毒和巨細(xì)胞病毒感染處理指南均建議臨床醫(yī)生應(yīng)結(jié)合IgM、IgG 和IgG 親和力的檢測(cè)結(jié)果對(duì)孕婦宮內(nèi)感染的風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)估[8,9]。 Lazarotto 等用CMV IgG 親和力試劑盒檢測(cè)了42 例孕婦，15 例器官移植病人，96 例獻(xiàn)血員血清轉(zhuǎn)化樣本，結(jié)果表明88.6%的原發(fā)感染病人為低親和力,且抗體成熟為高親和力需要17～25 周的時(shí)間[10]。 Bodeus 等用ELISA 方法檢測(cè)了409 例IgM 和IgG 均陽(yáng)性孕婦的IgG 抗體親和力，發(fā)現(xiàn)207 例孕婦為高親和力，可排除原發(fā)感染，121 例懷孕三個(gè)月內(nèi)的孕婦中，有30%通過(guò)親和力檢測(cè)排除了原發(fā)感染[11]。 Us 等發(fā)現(xiàn)41 例CMV IgM 和IgG 均 陽(yáng)性樣本中有34 例為低親和力（82.9%），7 例為高親和力（17.1%），52 例CMV IgM 陰性IgG 陽(yáng)性樣本均為高親和力[12]。

本研究中，我們檢測(cè)了77 例巨細(xì)胞病毒原發(fā)感染抗體血清轉(zhuǎn)化樣本，100%的樣本在感染后10周內(nèi)為低親和力，87.2%的樣本在感染17 周內(nèi)為低親和力，與Lazarotto 的研究結(jié)果基本一致。59 例IgM (+)IgG (+) 的樣本中，40.7%檢測(cè)為低親和力，52.5%檢測(cè)為高親和力，與Bodeus 的研究結(jié)果基本一致。 300 例IgM(-)IgG(+)的既往感染中只有2 例檢測(cè)為低親和力，98.3%的樣本檢測(cè)為高親和力。

Bottinger 等研究了94 例有典型風(fēng)疹病毒感染癥狀且IgM 抗體陽(yáng)性的病人抗體親和力結(jié)果，發(fā)現(xiàn)85%的病人抗體親和力低于30%，97%的病人抗體親和力低于40%，而對(duì)于137 例既往感染者，平均親和力為85%[13]。Hedamn 等研究了15 例風(fēng)疹病毒急性感染后4～5 個(gè)月的84 例樣本抗體親和力隨時(shí)間的變化趨勢(shì)，發(fā)現(xiàn)所有感染者的抗體親和力都隨時(shí)間逐漸升高，6 周內(nèi)均為低親和力，13周后均為高親和力[14]。

本研究中，我們檢測(cè)了46 例風(fēng)疹病毒原發(fā)感染抗體血清轉(zhuǎn)化樣本，感染后10 周內(nèi)均為低親和力，與Hedamn 的研究基本一致。 300 例IgM(-)IgG(+)的既往感染中只有1 例檢測(cè)為低親和力，98.7%的樣本檢測(cè)為高親和力。 43 例IgM(-)IgG(+)的樣本中，46.5%檢測(cè)為低親和力，41.9%檢測(cè)為高親和力。

文獻(xiàn)研究和本研究表明，IgG 抗體親和力檢測(cè)可以區(qū)分急性感染和既往感染，高親和力基本可以排除10 周以?xún)?nèi)的感染。 對(duì)于IgM 和IgG 抗體均陽(yáng)性的樣本應(yīng)該進(jìn)行親和力檢測(cè)，其中約50%可以通過(guò)親和力排除急性感染。