高立娟，劉巧香，王華莉

（河南省平頂山市平煤神馬醫(yī)療集團(tuán)總醫(yī)院產(chǎn)科，河南 平頂山 467099）

妊娠期糖尿?。℅DM）是最常見的妊娠并發(fā)癥之一，占所有妊娠的1%～14%[1,2]。 GDM 婦女其他妊娠并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)增加，包括妊娠高血壓、糖尿病性酮癥酸中毒,產(chǎn)后2 型糖尿病、子代成年后患糖尿病、肥胖癥、心血管疾病等代謝疾病[3]。 GDM 具有胰島素抵抗（IR）特性，在診斷為GDM 的婦女中，IR 比例升高[4]。 研究表明，全身和局部炎癥在GDM 患者IR 的發(fā)展中起著重要作用。 研究表明，血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1 （platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1）是分泌的剪接變體，該變體識(shí)別病原體相關(guān)分子模式（PAMP）以及組織損傷的內(nèi)源性指標(biāo)，PECAM-1 是抑炎反應(yīng)的關(guān)鍵介質(zhì)[5]。 PECAM-1 可抑制NF-κB,活化蛋白1（AP-1）和干擾素調(diào)節(jié)因子（IRFs）在內(nèi)的幾種轉(zhuǎn)錄因子而導(dǎo)致促炎性細(xì)胞因子的弱表達(dá)。 這些細(xì)胞因子可以直接或間接抑制胰島素靶細(xì)胞中的胰島素作用[6]。 PECAM-1 是IR 中潛在的分子功能。 在糖尿病動(dòng)物模型以及T1DM 和T2DM 患者中觀察到PECAM-1 的表達(dá)降低。 以前的研究還發(fā)現(xiàn)GDM患者中PBMC, 骨骼肌和脂肪組織中PECAM-1 的表達(dá)明顯下降。 此外,激活PECAM-1 信號(hào)傳導(dǎo)可以改善IR[7,8]。 也有研究發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞特異的PECA M-1 過(guò)表達(dá)可減輕飲食引起的全身和局部IR[9]。本研究擬探討GDM 患者血清、 胎盤組織及臍血中PECAM-1 表達(dá)及臨床意義，為GDM 的發(fā)病、治療機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2016年8月至2019年9月，平煤神馬醫(yī)療集團(tuán)總醫(yī)院96 例行剖宮產(chǎn)手術(shù)的妊娠期糖尿病孕婦為病例組，根據(jù)國(guó)際糖尿病與妊娠研究小組（IADPSG）標(biāo)準(zhǔn)在妊娠24～28 周時(shí)通過(guò)口服葡萄糖耐量試驗(yàn)（75 g）對(duì)妊娠期糖尿病進(jìn)行診斷，并根據(jù)國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)合會(huì)（FIGO）建議進(jìn)行飲食管理和生活方式調(diào)整以及藥物干預(yù)（二甲雙胍、胰島素）。 根據(jù)年齡、BMI、身高、體重、妊娠周數(shù)進(jìn)行匹配選取2016年8月至2019年9月本院96例行剖宮產(chǎn)手術(shù)的正常孕婦為對(duì)照組。 該研究得到本院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)和審查，剖宮產(chǎn)前已獲得研究對(duì)象知情同意書。 納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴單身妊娠；⑵年齡18～40歲；⑶符合IADPSG 診斷標(biāo)準(zhǔn)；⑷研究對(duì)象自愿提供血清、胎盤組織及臍血；⑸經(jīng)過(guò)本院醫(yī)學(xué)倫理協(xié)會(huì)批準(zhǔn)。 排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴多胎妊娠；⑵感染或其他妊娠并發(fā)癥； ⑶先天性或染色體異?；蛱悄虿〖易迨贰?/p>

1.2 方法

1.2.1 血清及臍帶血中PECAM-1 表達(dá)水平測(cè)定用TRIzol 試劑 （美國(guó)Invitrogen Life Technologies公司，批號(hào)：SD-77896.36）從血清及臍帶血中提取總RNA。 使用TaqMan mRNA 試劑盒（美國(guó)Applied Biosystems，批號(hào)：CV-556963.36） 將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA （cDNA）。 PECAM-1、GAPDH引物由華大基因合成，序列如下：PECAM-1F：5'-TGCTAGCTAGTCGCGTCGATCGTGATCGATGCTA GCT -3' 和R：5'-TCGCGCTGCGTCGTCGATGCTA GCTCGTCGTAGCTCGATG-3'; GAPDHF：5'-CTCCGCTACTAGCTGCTAGCTGCTAGCTAGTCGCTAG CTGCA-3' 和R：5'-TCGCTAGCTAGTAGCTAGCTGACTGATCGTCG-3'。 使用SYBR Green 試劑盒（中國(guó)碧云天生物科技，批號(hào)：XS-559686.36）以及7300 實(shí)時(shí)PCR 系統(tǒng)（美國(guó)Applied Biosystems）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)； 熱循環(huán)參數(shù)進(jìn)行：16°C 30min，42°C 30min，在85°C 下放置5min，然后在4°C 下放置。 2-ΔΔCT 計(jì)算PECAM-1 表達(dá)水平，并標(biāo)準(zhǔn)化至GAPDH。

1.2.2 胎盤中PECAM-1 蛋白表達(dá)水平測(cè)定 如下對(duì)胎盤樣品中的PECAM-1 進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析。胎盤組織石蠟包埋并切成4μm 的厚度。將玻片在二甲苯中脫蠟兩次，持續(xù)10min，然后通過(guò)降低乙醇濃度將其重新水化。 在0.01 mol/L 檸檬酸鹽緩沖液（pH 6.0）中于98°C 至100°C 的微波爐中進(jìn)行10min 的抗原回收。 在室溫下，使用3%過(guò)氧化氫（在新鮮甲醇中） 封閉內(nèi)源過(guò)氧化物酶活性10min 溫度。 用磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）洗滌后，將切片與封閉血清溫育1h。 然后，將組織與兔PECAM-1 抗體（AF1086,1：40; R&D Systems，Minneapolis，MN，USA）在4°C 孵育過(guò)夜。 作為二級(jí)抗體，使用辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的兔抗小鼠IgG （ 美國(guó)Dako Envision plus System，批 號(hào)：SD448596.36），用DAB 觀察陽(yáng)性染色。兩名不知情的觀察員對(duì)結(jié)果進(jìn)行評(píng)估。 PECAM-1 染色強(qiáng)度分級(jí)如下：0 表示無(wú)染色，1+弱染色，2+中度染色，3+強(qiáng)染色。 根據(jù)PECAM-1 陽(yáng)性細(xì)胞的百分比對(duì)分布進(jìn)行分級(jí)，然后如下劃分為四分位數(shù)：0，0～5%染色；1+，6～25%染色；2+，26～50%染色；3+，51～75%染色；4+，76～100%染色。 使用0～3 的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)（0：0～4%細(xì)胞染色；1：5～29%細(xì)胞染色；2：30-59%細(xì)胞染色；3：60～100%細(xì)胞染色測(cè)定免疫反應(yīng)細(xì)胞百分比的估計(jì)值）。 染色強(qiáng)度評(píng)分為0～3（0，陰性；1，弱；2，中等；3，強(qiáng)）。 然后將數(shù)量和染色強(qiáng)度評(píng)分的值相乘，得到范圍為0 至9 的結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用SPSS23.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行錄入、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t 檢驗(yàn)比較，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α 為0.05。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般情況比較 對(duì)照組和病例組年齡、BMI、身高、體重、妊娠周數(shù)等一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 見表1。

表1 兩組一般情況比較

2.2 兩組糖脂代謝指標(biāo)比較 與對(duì)照組比較，病例組TG、TC、LDL-C、FBG、FINS、HOMA-IR、HOMAISI 水平升高，HOMA-β 水平降低（P＜0.05）。 見表2。

表2 兩組糖脂代謝指標(biāo)比較

2.3 對(duì)照組和病例組中血清PECAM-1 mRNA、臍血PECAM-1 mRNA 表達(dá)比較 與對(duì)照組比較，病例組血清PECAM-1 mRNA、 臍血PECAM-1 mRNA 表達(dá)水平降低（P＜0.05）。 見表3。

表3 對(duì)照組和病例組中血清PECAM- 1mRNA、臍血PECAM- 1 mRNA 水平比較

2.4 對(duì)照組、病例組中胎盤PECAM-1 蛋白表達(dá)評(píng)分比較 與對(duì)照組比較，病例組胎盤組織PECAM-1 蛋白表達(dá)陽(yáng)性率、PECAM-1 蛋白表達(dá)評(píng)分降低（P＜0.05）。 見表4。

表4 對(duì)照組、病例組中PECAM- 1mRNA 水平比較

2.5 血清PECAM-1 mRNA、胎盤PECAM-1 蛋白、臍血PECAM -1 mRNA 與各變量相關(guān)性 血清PECAM -1mRNA、 胎盤PECAM -1 蛋白、 臍血PECAM -1 mRNA 與TG、TC、LDL -C、FBG、FINS、HOMA-IR、HOMA-ISI 負(fù)相關(guān)，與HOMA-β 正相關(guān)（P＜0.05）。 見表5。

表5 血清PECAM- 1mRNA、胎盤PECAM- 1 蛋白、臍血PECAM- 1 mRNA 與各變量相關(guān)性

2.6 妊娠發(fā)生糖尿病的多因素Logistic 回歸分析以妊娠婦女是否發(fā)生糖尿病為應(yīng)變量（是=1，否=0），各血清指標(biāo)為自變量進(jìn)行多因素logistic 逐步回歸分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：血清PECAM-1 mRNA、胎盤PECAM -1 蛋白、 臍血PECAM -1 mRNA、FBG、FINS、TC、HOMA-IR 均為妊娠婦女發(fā)生糖尿病的危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。 見表6。

表6 妊娠孕婦出現(xiàn)糖尿病的多因素Logistic 回歸分析

圖1 PECAM- 1 在對(duì)照組、病例組胎盤組織的表達(dá)

3 討論

越來(lái)越多的證據(jù)表明，炎癥分子的系統(tǒng)性和局部產(chǎn)生可能對(duì)導(dǎo)致GDM 中的IR 至關(guān)重要，包括CRP、TNF-α 和IL-6。 PECAM-1 是抑炎反應(yīng)的候選者。 PECAM-1 在受到LPS 和有害代謝產(chǎn)物的刺激后，它將螯合下游分子MyD88，阻止轉(zhuǎn)錄因子NF-kB 向核轉(zhuǎn)移，并抑制促炎性細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生，包括IL-6、TNF-α、趨化因子（CC 基序）配體2（CCL2），這些細(xì)胞因子都將在IR 中起決定作用[10]。 先前對(duì)IR 的研究集中在肝臟、脂肪組織或骨骼肌。 本研究將重點(diǎn)放在胎盤上，并輔助檢測(cè)臍血、血清PECAM-1 表達(dá)水平。 胎盤作為母胎界面執(zhí)行各種功能的載體，在GDM 的發(fā)展和進(jìn)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。 胎盤來(lái)源的激素，人胎盤乳原（hPL）和人胎盤生長(zhǎng)激素（hPGH）被認(rèn)為是重編程產(chǎn)婦生理學(xué)以實(shí)現(xiàn)胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)的主要因素。此外，GDM 婦女胎盤中炎癥途徑的上調(diào)基因以及脂質(zhì)，氨基酸和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的基因，也在全身或局部IR 中起作用。

PECAM-1 及其各種共受體和必需蛋白（包括CD14）的表達(dá)改變已在人胎盤中描述，并且在妊娠并發(fā)癥中也有所改變。 在絨毛膜羊膜炎（CAM）早產(chǎn)的胎盤中絨毛狀Hofbauer 細(xì)胞中的PECAM-1表達(dá)低于沒有CAM 的早產(chǎn)胎盤，或有或沒有CAM的足月胎盤；較低水平的PECAM-1 水平發(fā)生在妊娠并發(fā)先兆子癇的胎盤中[11]。 與上述的研究一致，與對(duì)照組比較，病例組胎盤組織PECAM-1 蛋白表達(dá)陽(yáng)性率、PECAM-1 蛋白表達(dá)評(píng)分降低（P＜0.05）。本研究在GDM 胎盤的各種細(xì)胞中觀察到了PECAM-1 的表達(dá)，包括合體滋養(yǎng)層細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞，蛻膜細(xì)胞和羊膜上皮細(xì)胞，且合胞體滋養(yǎng)層和成纖維細(xì)胞染色最弱。 研究表明PECAM-1 的表達(dá)可能與胎盤部位有關(guān)，本研究發(fā)現(xiàn)，PECAM-1在胎盤與母體接觸部位表達(dá)最弱，這可能歸因于胎盤的母體部分與母體有更多的血液交流，而大量刺激性物質(zhì)的母血可以抑制PECAM-1。 除微生物外，組織損傷的內(nèi)源性信號(hào)也可以抑制PECAM-1，其中包括來(lái)自凋亡，損傷相關(guān)分子模式的碎片，ECM 降解產(chǎn)物，高遷移率box-1 蛋白（HMGB1），脂肪酸，熱激蛋白，AGEs 在組織損傷和發(fā)炎時(shí)釋放[12，13]。 本研究同時(shí)也檢測(cè)了，血清臍帶血中PECAM-1 水平，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，病例組血清、 臍血PECAM-1 mRNA 表達(dá)水平降低（P＜0.05）。 這與胎盤研究結(jié)果一致。

近期研究表明,糖脂代謝異常和游離飽和脂肪酸的積累也可能在胎盤PECAM-1 途徑的抑制中具有潛在作用。 對(duì)肝細(xì)胞、脂肪組織和骨骼肌的研究表明，PECAM-1 在局部胰島素敏感性中起重要作用[14]。 在GDM 的胎盤中已經(jīng)檢測(cè)到胰島素信號(hào)傳導(dǎo)受損。 胎盤是胰島素受體的豐富來(lái)源，也是妊娠中胰島素的靶組織[15]。 胰島素的受體水平可通過(guò)周圍的胰島素濃度來(lái)調(diào)節(jié)[16-18]。 研究表明,在GDM中，總胎盤和滋養(yǎng)細(xì)胞膜中的胰島素受體蛋白發(fā)生了變化，且PECAM-1 與胰島素受體蛋白相關(guān)性明顯。 本研究檢測(cè)血糖脂水平，結(jié)果顯示： 血清PECAM-1 mRNA、 胎盤PECAM-1 蛋白、 臍血PECAM -1 mRNA 與TG、TC、LDL -C、FBG、FINS、HOMA-IR、HOMA-ISI 負(fù)相關(guān)，與HOMA-β 正相關(guān)（P＜0.05）。 這表明，PECAM-1 與GDM 的脂質(zhì)代謝紊亂以及IR 相關(guān)。 本研究也探討了妊娠婦女發(fā)生糖尿病的相關(guān)因素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：血清PECAM-1 mRNA、胎盤PECAM-1 蛋白、臍血PECAM-1 mRNA、FBG、FINS、TC、HOMA-IR 均為妊娠婦女發(fā)生糖尿病的相關(guān)因素（P＜0.05）。 這提示血清、胎盤、臍血PECAM-1 為妊娠婦女發(fā)生糖尿病的危險(xiǎn)因素，可作為GDM 的治療靶點(diǎn)。 由于大多數(shù)GDM 患者一旦被診斷出就接受了干預(yù)，包括飲食管理、運(yùn)動(dòng)甚至胰島素治療，這些治療對(duì)PECAM-1 表達(dá)的影響尚不清楚，這將在后續(xù)研究中探討。

綜上所述，妊娠期糖尿病患者血清、胎盤組織及臍血中PECAM-1 表達(dá)水平降低；PECAM-1 為妊娠婦女發(fā)生糖尿病的相關(guān)因素。