翟翊然，曹麗楠，李偉棟

（南陽市中心醫(yī)院皮膚科，河南 南陽 473000）

銀屑病（Psoriasis Vulgaris，PV）是一種表皮過度增殖的慢性炎癥性皮膚病, 其發(fā)病機制非常復雜,目前認為炎癥、表皮細胞過度增殖和免疫學異常是其發(fā)病機制的3 個中心環(huán)節(jié)[1]。 miR -124-3p是微小RNAs（microRNAs，miRNAs）的一員，在膠質(zhì)瘤、膀胱癌、肝細胞癌和肺癌等惡性腫瘤的轉(zhuǎn)化和發(fā)展中表現(xiàn)出顯著的抑制作用[2]。 近年來研究顯示，miR-124-3p 在特應(yīng)性濕疹患者的慢性皮損皮膚中表達降低[3]，可以靶向調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活因子3（Signal transduction and transcriptional activators 3，STAT3）蛋白表達，參與炎癥、多組織損傷等[4,5]。 STAT3 是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，參與炎癥反應(yīng)、 角質(zhì)形成細胞過度增生等多種病理生理過程，在PV 發(fā)病中起重要作用[6]。 基于此，我們推測miR-124-3p 可能作為STAT3 的上游調(diào)節(jié)因子，參與PV 的發(fā)生和進展，但其具體作用和機制尚不清楚。 本研究檢測miR-124-3p 及STAT3 在尋常型銀屑病皮損組織中的表達，并探討miR-124-3p 參與銀屑病的發(fā)病機制，以期為尋常型銀屑病的臨床治療提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年3月-2020年7月在本院確診的102 例尋常型銀屑病患者，男62 例，女40 例，年齡24～65歲，平均40.15±9.83歲，其中進行期患者50 例，靜止期患者52 例，病程6 個月～17年。 納入標準：⑴所有患者按照《中國銀屑病診療指南》（2018 版）標準進行診斷[7]，并經(jīng)組織病理檢查確診；⑵患者行為能力正常，能積極配合本次研究，且病歷資料完整；⑶年齡≥18歲。 排除標準：⑴患者3 個月內(nèi)服用治療藥物，例如：糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等；⑵并發(fā)其他疾病者，例如：凝血障礙性疾病、惡性腫瘤、其他自身免疫性疾病及感染性疾病者；⑶隨訪過程中無法聯(lián)系者、病歷資料不完整者；⑷術(shù)前已行放療、化療者。 另收集102例正常人皮膚組織（經(jīng)整形外科手術(shù)切除）作為對照組，男57 例，女45 例，年齡22～60歲，平均38.25±8.19歲，兩組間性別與年齡比較均無統(tǒng)計學差異（P 值均＞0.05）。 本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，所有患者及家屬均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑 RNA 抽提試劑Trizol （廣州泰勒生物科技有限公司）；miRNA 分離試劑盒（Ambion miRNA Isolation Kit，美 國Ambion 公 司）；miR -124-3p 特異性引物和U6 內(nèi)參特異性引物均由上海艾研生物科技有限公司設(shè)計合成，序列為：miR-124-3p 上游引物5'-GGGTATTGAG -GAAGGTGTT-3'、下游引物5' -CAGTGCGTGTCGTG -GAGT-3'；內(nèi)參U6 上游引物5'-GAGCCACAGCGTAACG-3'、下游引物5' -CTAGCA -CATAGTACAGG-3'；STAT3 兔多克隆抗體（上海江萊生物科技有限公司）；β-actin 單克隆抗體（上海江萊生物科技有限公司）；通用型二步法檢測試劑盒（上海江萊生物科技有限公司）；鼠兔通用型二抗試劑盒（PV-6000）；DAB 顯色試劑盒（上海江萊生物科技有限公司）；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（北京中科瑞泰生物科技有限公司）。

1.3 皮膚組織總RNA 的提取 對皮損組和對照組進行皮膚活檢，兩組均是大小約1cm×0.5cm 被切下的皮膚組織，然后分別剪切成2～3 小塊，迅速儲存在液氮中，之后放入-80℃中保存。待所有樣本前處理結(jié)束后，使用液氮研磨皮膚組織至粉末狀，并將研缽及杵均滅菌均保存在-80℃下，過夜，第二天將粉末倒入去RNA 酶的EP 管中，根據(jù)說明書采用Trizol 法提取細胞系總RNA。

1.4 實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng) 將上述抽提的總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，逆轉(zhuǎn)錄條件:25℃，10min；50℃，45 min；85℃，5 min。 按照PCR試劑盒說明檢測成熟的miR，以cDNA 為模板，miR-124-3p 和U6 熒光探針作引物擴增，反應(yīng)程序為：95℃，10 min；95℃，15s；、60℃，1min；共40 個循環(huán)。 所有試驗重復3 次，相對表達量采用2-△△Ct法測定： 用△Ct 值代表基因的相對定量，△Ct 值=目的基因Ct 值-同組內(nèi)參Ct 值，△△Ct 值=各樣本△Ct 值-最低樣本△Ct 值，基因表達的差別倍數(shù)用2-△△Ct值表示。

1.6 STAT3 表達檢測 在勻漿器的球狀部位加入少量皮膚組織，再加入去污劑裂解液，混合后進行勻漿，重復碾壓樣本3 次，使皮膚組織完全裂解。30min 后在在4℃下，12000r/min，離心5min，取適當被稀釋過的上清液。 蛋白濃度采用BCA 法來測定，然后對蛋白質(zhì)濃度進行調(diào)整，采用免疫印跡法（Western blot）檢測皮膚組織中STAT3 的表達。 采取的具體步驟：⑴經(jīng)過灌膠、加樣、電泳、轉(zhuǎn)膜等一系列操作后，用5%牛血清白蛋白（BSA）封閉液將膜裝入其中；⑵將標本制置于室溫搖床1h，然后加入一抗稀釋液5ml，混合均勻，并放于4℃冰箱過夜；⑶再加入二抗稀釋液（配比為1：10000）10mL置于搖床上1h，待顯色后，將其置于暗室內(nèi)進行壓片曝光顯影。 最后用Quantity-one 圖像軟件對結(jié)果進行分析及光密度值掃描，分別計算出目的蛋白條帶與β-肌動蛋白（β-actin）的強度，然后把結(jié)果相除計算出其比值（%）。

1.5 皮損面積和嚴重程度評分 對患者進行PASI評分，病情程度根據(jù)PASI 評分分級，重度≥30 分、中度15～29 分、輕度＜15 分[8]。 PASI 評分=皮損面積×[0.1×（Dh+Ih+Eh）+0.2×（Du+Iu+Eu）+0.3×（Dl+Il+El）+0.4×（Dt+It+Et）]，E：紅斑，I：浸潤，D：鱗屑，h：頭（包括頸），u：上肢，t：下肢，l：軀干，皮疹部位均為5 個等級：0～4 分。 皮損面積為（0～6）分，0%為0 分；＜10%為1 分；10%～29%為2 分；30%～49%為3 分；50%～69%為4 分；70%～89%為5 分；90%～100%為6 分。 總分（0～72）分，得分越高，皮損越嚴重。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 22.0 軟件對所得數(shù)據(jù)進行分析，計量資料均以均數(shù)±標準差（±s）表示，采用兩樣本獨立t 檢驗比較組間差異，采用Pearson 相關(guān)分析尋常型銀屑病患者皮損組織中miR-124-3p 表達水平與PASI 評分的相關(guān)性，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 皮損組織和正常組織中miR -124 -3p 與STAT3 的表達 尋常型銀屑病患者皮損組織及對照組中均檢測出有miR-124-3p 表達，皮損組及對照組中miR-124-3p 表達的2-△△Ct值分別為0.82 ±0.09 和1.20±0.17，皮損組明顯低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05) ；通過Western blot 檢測發(fā)現(xiàn)，皮損組和對照組STAT3 表達量分別為0.52±0.07 和0.25±0.05，皮損組顯著高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 皮損組及對照組中miR- 124- 3p 和表達水平

2.3 miR-124-3p 和STAT3 表達水平與尋常型銀屑病臨床病理特征之間的關(guān)系 分析這些皮損組織樣本與患者年齡、性別、病程和臨床分期等病理特征發(fā)現(xiàn)，miR-124-3p 和STAT3 表達水平與年齡、性別和病程等病理特征無相關(guān)性（P＞0.05），但與患者的臨床分期有關(guān)。 在進行期患者皮損中，miR-124-3p 表達水平更低，與靜止期患者的miR-124-3p 表達水平比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）； 而進行期患者皮損中的STAT3 表達水平比靜止期患者的更高，比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。 見表1。

表1 miR- 124- 3p 在尋常型銀屑病患者皮損中的表達與臨床特征的關(guān)系（±s）

表1 miR- 124- 3p 在尋常型銀屑病患者皮損中的表達與臨床特征的關(guān)系（±s）

臨床病理特征 例數(shù) P STAT3 t P年齡（歲）≥60歲＜60歲性別miR- 124- 3p t 1.056 0.293 1.539 0.127 48 54 0.81±0.09 0.83±0.10 0.53±0.06 0.51±0.07 1.173 0.243 0.719 0.473男女病程62 40 0.82±0.08 0.84±0.09 0.53±0.06 0.52±0.08 1.104 0.272 1.864 0.065≥5年＜5年臨床分期進行期靜止期42 60 0.80±0.09 0.82±0.09 0.54±0.08 0.51±0.08 7.788＜0.001 5.012＜0.001 50 52 0.75±0.08 0.89±0.10 0.56±0.08 0.49±0.06

2.4 皮損組中miR-124-3p 與STAT3 的相關(guān)性分析 采用Pearson 相關(guān)分析患者皮損組織中miR-124-3p 表達水平與STAT3 的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-124-3p 表達水平與STAT3 呈負相關(guān)（r=-0.835, P＜0.001），見圖2。

圖2 皮損組中miR- 124- 3p 與STAT3 的相關(guān)性分析

2.5 miR-124-3p 和STAT3 表達量與PASI 評分的相關(guān)性分析 皮損組中所有患者的PASI 評分為10.9～29.5 分，平均18.22±7.84 分。 采用Pearson 相關(guān)分析尋常型銀屑病患者皮損中miR-124-3p 表達水平及其與PASI 評分的相關(guān)性，兩者呈顯著負相關(guān)（r=-0.778，P＜0.001）; STAT3 表達水平及其PASI 評分的相關(guān)性，兩者呈顯著正相關(guān)（r=0.818，P＜0.001），見圖3、4。

圖3 miR- 124- 3p 表達量與PASI 評分的相關(guān)性分析相

3 討論

圖4 STAT3 表達量與PASI 評分的相關(guān)性分析相

銀屑病是一種T 細胞介導皮膚病，屬于慢性炎癥性疾病，其特征是表皮增生、 角質(zhì)形成細胞（KCs）異常分化和血管過度增生[9,10]。 銀屑病除了表現(xiàn)為皮膚臨床癥狀，還會發(fā)生一系列合并癥，包括由銀屑病導致的關(guān)節(jié)炎、 心血管疾病和代謝綜合征等，其對患者的正常生活產(chǎn)生較大的影響[11]。 既往研究顯示[12,13]，在表皮和毛囊中存在多種高表達的miRNA，包括miR-125b、miR-21、miR-203 等可以調(diào)控皮膚發(fā)育和功能，參與銀屑病等多種皮膚病的發(fā)生、發(fā)展。 本研究探討了尋常型銀屑病患者皮損組織中miR-124-3p 的表達水平，結(jié)果顯示miR-124-3p 在尋常型銀屑病患者皮損組織中的表達水平相對于對照組明顯下調(diào)，STAT3 蛋白表達明顯上調(diào)，說明miR-124-3p 和STAT3 表達異?？赡芘c尋常型銀屑病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。 既往研究顯示，miR-124-3p 可以調(diào)控多種腫瘤的生物學行為，抑制胰腺癌細胞增殖和促進凋亡[14,15]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，miR-124-3p 還可以促進皮損組織修復、愈合[16]，但其在銀屑病發(fā)生中的調(diào)控機制尚不明確。 STAT3 是一種蛋白質(zhì)，參與了細胞內(nèi)和細胞外的信號傳遞，在角質(zhì)形成細胞和免疫細胞之間的相互作用起著關(guān)鍵因素。 Nakajima 等[17]發(fā)現(xiàn)銀屑病患者皮損組織中STAT3 異?；罨琒TAT3 通過與相應(yīng)的miRNA 結(jié)合抑制角質(zhì)形成細胞過度增殖,對于銀屑病的發(fā)生、發(fā)展起著重要的保護作用。Shan 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，miR-124-3p 通過干擾STAT3的3' 非編碼區(qū)負向調(diào)控STAT3 的轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)細胞的生物學行為。 本研究結(jié)果顯示，miR-124-3p 表達水平與STAT3 呈負相關(guān)性，提示miR-124-3p可能通過調(diào)節(jié)STAT3 蛋白表達，參與銀屑病的進展。

本研究結(jié)果還顯示尋常型銀屑病患者皮損組織中miR-124-3p 表達量與PASI 評分具有相關(guān)性。 通過分析所選患者的臨床分期以及對比PASI評分發(fā)現(xiàn)，皮損嚴重程度隨著皮損面積的增大而增大，則miR-124-3p 表達水平相應(yīng)降低，而STAT3 表達水平則升高。 同時，miR-124-3p 在進行期患者皮損組織中有著更低的表達水平，說明miR-124-3p 在臨床上能隨銀屑病的病理變化而變化，但與患者性別、年齡及病程沒有顯著相關(guān)性。 已有研究顯示，STAT3 表達水平與PASI 評分存在相關(guān)性[19]。提示miR-124-3p 和STAT3 可以作為評估尋常型銀屑病嚴重程度的相關(guān)性因子。

綜上所述，尋常型銀屑病患者皮損組織中miR-124-3p 及其可能調(diào)控的靶基因蛋白STAT3表達水平與PASI 評分密切相關(guān)，可望作為疾病的進展及預后評估指標，為臨床治療銀屑病提供參考。