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        微柱凝膠法檢測頭孢唑啉鈉和頭孢西丁鈉誘導(dǎo)形成藥物性抗體的可行性研究

        2022-01-06 04:06:56王波楊訊韓海心辛葉楊旭
        實驗與檢驗醫(yī)學(xué) 2021年5期

        王波,楊訊,韓海心,辛葉,楊旭

        (南陽市中心醫(yī)院輸血科,河南 南陽 473000)

        藥物誘導(dǎo)免疫性溶血性貧血(drug-induced immune hemolytic anemia,DIHA) 是一種免疫球蛋白G (immunoglobulin G,IgG) 或免疫球蛋白M(immunoglobulin M,IgM) 介導(dǎo)細胞毒性抗體的II型變態(tài)反應(yīng),因在臨床較為少見,故容易被忽視[1,2]。DIHA 發(fā)病機制是機體中產(chǎn)生某種藥物的抗藥物抗體,如藥物再次使用將導(dǎo)致溶血,多見于患者使用抗菌藥物后[3,4]。目前臨床鮮有關(guān)于藥物性抗體及其檢測方式的相關(guān)報道,患者發(fā)生溶血后分析其發(fā)生原因面臨著一定的困難。 微柱凝膠法是一種通過觀察凝膠柱介質(zhì)中紅細胞抗原和相應(yīng)抗體的凝集反應(yīng)判斷是否有抗體生成的新型免疫學(xué)檢測技術(shù),相較于以往的試管法抗人球蛋白實驗、菠蘿酶法具有操作簡便、耗時短等優(yōu)勢,但關(guān)于其應(yīng)用于抗菌素藥物性抗體生成情況的檢測中的研究尚少[5,6]。 頭孢菌素類藥物在臨床有著廣泛的應(yīng)用范圍,其中80%左右可誘發(fā)DIHA,同時相關(guān)報道也所有增加[7-10]。 頭孢唑啉鈉和頭孢西丁鈉分別屬于第一代、第二代頭孢菌素,抗菌譜廣,殺菌力強,通常用于敏感性菌株感染性疾病的治療。 本研究選取使用頭孢唑啉鈉和頭孢西丁鈉的168 例患者為研究對象,分析微柱凝膠法檢測兩種藥物誘導(dǎo)形成藥物性抗體的可行性。

        1 資料與方法

        1.1 一般資料 選取2018年10月-2020年2月本院采用頭孢唑啉鈉和頭孢西丁鈉治療的患者168例,男91 例,女77 例;年齡19~78歲,平均(47.16±5.39)歲;頭孢唑啉鈉治療98 例,頭孢西丁鈉治療70 例。 納入標準: 入院前7 d 未使用抗菌藥物治療; 入院后采用頭孢唑啉鈉和頭孢西丁鈉治療>3 d; 采用藥物治療后血液標本中血紅蛋白水平<用藥之前。 本研究經(jīng)院倫理委員會批準通過,所有受試者簽署知情同意書。

        1.2 藥物、試劑與儀器 頭孢唑啉鈉(1.0 g;深圳立健藥業(yè)有限公司;國藥準字H20143067);頭孢西丁鈉(1.0 g; 揚子江藥業(yè)集團有限公司; 國藥準字H20057973);LISS/Coombs/IgG +C3d 微柱凝膠卡(管中為中性凝膠,并含抗人球蛋白血清、低離子介質(zhì),中山市生科試劑儀器有限公司);O 型血健康受試者新鮮血液(采集自健康獻血者,EDTA 抗凝后冷藏);待檢血液(采集自頭孢唑啉鈉和頭孢西丁鈉治療的患者,EDTA 抗凝后冷藏)。

        醫(yī)學(xué)檢驗多功能離心機TD2Y(中山市生科試劑儀器有限公司);F37-12X2 37℃恒溫孵育器(上海盧湘儀離心機儀器有限公司)。

        1.3 方法

        1.3.1 間接抗人球蛋白試驗(Indirect Antiglobulin Test,IAT) 篩查不規(guī)則抗體 清晨采集患者空腹狀態(tài)下5ml 左右靜脈血,加入EDTA 抗凝。 血漿標本與不規(guī)則抗體篩查細胞各50μl,加入微柱凝膠試驗卡(含抗球蛋白試劑),37℃下孵育20min,1000 r/min 離心半徑12cm 離心3min,2000r/min 離心半徑10cm 離心2min,判定結(jié)果。

        1.3.2 直接抗人球蛋白試驗 (direct antiglobulin test,DAT) 用0.9%的氯化鈉溶液經(jīng)濃縮紅細胞稀釋為0.8%紅細胞懸液,取50μl 加入微柱凝膠試驗卡(含抗球蛋白試劑),1000r/min 離心半徑12cm離心3min,2000r/min 離心半徑10cm 離心2min,判定結(jié)果。如標本DAT 結(jié)果為陽性,繼續(xù)檢測其血漿及放散液中藥物性抗體; 如標本DAT 結(jié)果為陰性,繼續(xù)檢測其血漿中藥物性抗體。

        1.3.3 放散實驗 從DAT 結(jié)果陽性標本中采集濃縮紅細胞1ml,經(jīng)生理鹽水洗滌3 次,嚴格按照《輸血技術(shù)操作規(guī)程》進行酸放散試驗,并快速離心、分離放散液。

        1.3.4 制備空白O 型人紅細胞 采集20 例O 型血健康受試者新鮮血液,混合均勻后取壓積紅細胞10ml 于試管中,再混合生理鹽水90ml,2500r/min離心半徑10cm 離心3min,棄上清,采用生理鹽水將紅細胞洗滌3 次,制備為不含有藥物的空白紅細胞待用。

        1.3.5 制備頭孢唑啉鈉、 頭孢西丁鈉包被紅細胞藥物0.1 g 溶于巴比妥緩沖液(pH 為9.6~9.8)0.25 ml 中,并與洗滌后O 型紅細胞170μl 混合均勻;另取一試管,加入等量巴比妥緩沖液與O 型紅細胞。兩試管均于室溫下孵育2h,每10min 輕搖勻1 次,之后生理鹽水洗滌3 次紅細胞,前者即為頭孢唑啉鈉、頭孢西丁鈉包被紅細胞,后者即為無藥物包被紅細胞。 使用前采用生理鹽水配置為2%紅細胞懸液。

        1.3.6 鑒定藥物包被紅細胞 抗體檢測試劑盒陽性與陰性對照試劑(50μl)和2%紅細胞(藥物包被、無藥物包被各25μl)混合,加入微柱凝膠卡,37℃孵育1h,1000r/min 離心半徑12cm 離心3min,2000r/min 離心半徑10cm 離心2min。 采用兩種頭孢抗菌素抗體陰性與陽性對照檢測試劑檢測藥物包被紅細胞,判定是否包被成功。

        1.3.7 微柱凝膠柱凝集試驗檢測藥物性抗體 取20μl 2%頭孢唑啉鈉和頭孢西丁鈉紅細胞懸液,置于微柱凝膠柱上,同時再加100μl 待測血清,放置于恒溫孵育器中孵育20min,然后經(jīng)卡式定速離心機離心(1030r/min 離心15min)。 微柱凝膠抗人球蛋白卡自左向右標記4 個孔,第1 個孔加入患者血漿/放散液50μl,藥物包被O 型紅細胞25μl;第2 個孔加入患者血漿/放散液50μl,無藥物包被O型紅細胞25μl; 第3 個孔加入混合的0 型紅細胞對應(yīng)血漿50μl,藥物包被O 型紅細胞25μl; 第4個孔加入混合的0 型紅細胞對應(yīng)血漿50μl,無藥物包被O 型紅細胞25μl。觀察微柱凝膠離心結(jié)果,陰性:紅細胞懸液沉積至微柱凝膠底部;陽性:紅細胞懸液滯留于微柱凝膠上;弱陽性:紅細胞群滯留于凝膠柱中間。 記錄凝集結(jié)果,如僅有第1 個孔中發(fā)生凝集,則為藥物性抗體陽性。

        1.4 統(tǒng)計學(xué)方式 采用SPSS 19.0 對數(shù)據(jù)進行處理與分析,以[n(%)]表示計數(shù)資料,理論頻數(shù)為1~5時行校正χ2檢驗,>5 時行χ2檢驗。 P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 IAT 檢測結(jié)果 168 例血漿標本中不規(guī)則抗體篩查結(jié)果均未出現(xiàn)陽性。

        2.2 DAT 檢測結(jié)果 168 例血漿標本中DAT 結(jié)果陽性32 例(19.05%),其中采用頭孢唑啉鈉治療的患者陽性20 例,采用頭孢西丁鈉治療的患者陽性12 例。

        2.3 藥物包被紅細胞鑒定結(jié)果 微柱凝膠抗人球蛋白卡第1 孔(加入陰性對照試劑與藥物包被紅細胞)無凝集,第2 孔(加入陰性對照試劑與無藥物包被紅細胞)無凝集,第3 孔(加入陽性對照試劑與藥物包被紅細胞)凝集,第4 孔(加入陽性對照試劑與無藥物包被紅細胞)無凝集。 由此可見,僅有第3 孔發(fā)生凝集,提示藥物包被紅細胞成功。

        2.4 頭孢唑啉鈉、 頭孢西丁鈉藥物性抗體陽性率頭孢唑啉鈉藥物性抗體陽性率高于頭孢西丁鈉(P<0.05); 頭孢唑啉鈉DAT 結(jié)果陽性標本與頭孢西丁鈉DAT 結(jié)果陽性標本中藥物性抗體陽性率比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);頭孢唑啉鈉DAT結(jié)果陰性標本中藥物性抗體陽性率高于頭孢西丁鈉DAT 結(jié)果陰性標本(P<0.05)。 見表1。

        表1 頭孢唑啉鈉、頭孢西丁鈉藥物性抗體陽性率比較[n(%)]

        2.5 DAT 陽性標本放散液檢測結(jié)果 頭孢唑啉鈉、頭孢西丁鈉DAT 結(jié)果陽性標本中不規(guī)則抗體檢測結(jié)果均為陰性,藥物性抗體均為陽性。 見表2。

        表2 DAT 陽性標本放散液檢測結(jié)果

        3 討論

        機體中生成藥物依賴性抗體是導(dǎo)致DIHA 的常見機制,通常為頭孢類藥物、哌拉西林等所致,DAT 試驗結(jié)果為陽性時患者常表現(xiàn)為貧血、乏力、黃疸等溶血征象,蒼白、黃疸、脾腫大、淋巴結(jié)腫大等,甚至危及生命[11]。 因此,用藥前采取準確、有效的藥物性抗體監(jiān)測預(yù)警技術(shù),減少DIHA 發(fā)生,保障臨床用藥安全,避免藥物誘導(dǎo)性抗體導(dǎo)致的輸血性溶血。

        微柱凝膠法通過離心技術(shù)、凝膠過濾技術(shù)、抗原抗體發(fā)生反應(yīng)的原理,凝集的紅細胞不能穿過凝膠間隙,留置于凝膠上層,從而呈現(xiàn)陽性結(jié)果,而未發(fā)生凝集的紅細胞在離心力作用下可穿過凝膠間隙沉積于凝膠柱底部,從而呈現(xiàn)陰性結(jié)果[12,13]。DAT 是檢測機體中已被補體或不完全抗體致敏的紅細胞,通常用于新生兒溶血病、 溶血性輸血反應(yīng)、藥物性溶血性貧血等的檢測。 既往研究顯示[14],DAT 結(jié)果陽性的標本與藥物性抗體關(guān)系密切。 本研究結(jié)果顯示,168 例患者血漿標本與DTA 結(jié)果為陽性的標本放散液中不規(guī)則抗體均顯示陰性,可排除實驗過程中血型相關(guān)意外抗體陽性導(dǎo)致假陽性的可能性。此外,本研究的DAT 結(jié)果陽性標本中,血漿與放散液中均存在有兩種頭孢抗菌素的藥物性抗體;且DAT 結(jié)果陰性標本中,同樣存在兩種頭孢抗菌素藥物性抗體。 分析原因可能為:DAT陽性結(jié)果可能并非藥物性抗體所致; 部分患者在發(fā)生DIHA 部分癥狀時,已經(jīng)接受了抗菌藥物治療,誘使紅細胞表面吸附大量藥物性抗體,導(dǎo)致DAT 陽性。 通常情況下,采用抗人球蛋白介質(zhì)試管法時需要洗滌紅細胞3 至4 次后才可用于檢測,但即使洗滌后血清蛋白極微量的殘留也可能與抗人球蛋白試劑中和。 洗滌不標準、不完全均可能導(dǎo)致結(jié)果可靠性降低,還可能由于抗體分子太少與紅細胞結(jié)合后無法被檢測出來。 根據(jù)紅細胞與IgG結(jié)合的檢測方式因采用的檢測方式不同而結(jié)果存在差異,相較于試管法,微柱凝膠法敏感性更強,該檢測方式不需要洗滌紅細胞,標準加樣與結(jié)果判斷標準可控也是其優(yōu)勢之一[15,16]。然而,在某些特殊情況下,例如變形性較差的鐮狀細胞難以正常通過凝膠柱,影響結(jié)果判斷的準確性,需臨床檢測人員細心觀察并分析患者臨床診斷結(jié)果,需要時使用試管法DAT 鑒定、分析。

        此外,本研究結(jié)果中,頭孢唑啉鈉及其DAT 陰性標本中藥物性抗體陽性率均高于頭孢西丁鈉,提示頭孢唑啉鈉面臨著更高的藥物性抗體形成風(fēng)險; 兩種頭孢抗菌素的DAT 陽性標本中藥物性抗體陽性率比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義,分析原因可能是當DAT 表現(xiàn)為陽性時,患者已出現(xiàn)DIHA 相關(guān)癥狀,該種情況下產(chǎn)生的藥物性抗體可能與藥物的使用無關(guān)。

        綜上所述,微柱凝膠法檢測頭孢唑啉鈉和頭孢西丁鈉誘導(dǎo)形成藥物性抗體時操作簡便,結(jié)果穩(wěn)定,可行性強,可用于臨床檢驗工作。 采用頭孢唑啉鈉和頭孢西丁鈉誘發(fā)DIHA 大多為外科手術(shù)圍術(shù)期預(yù)防性使用抗生素患者,如輸血患者發(fā)生溶血,特別是血管內(nèi)溶血時需要和輸血反應(yīng)進行鑒別,以防誤診。 即便患者僅對一種頭孢菌素發(fā)生DIHA,同樣需建議其今后注意使用其他頭孢類藥物。

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